一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法与流程

本发明涉及观赏植物生物技术领域，具体提供一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法。

背景技术：

紫薇属千屈菜科紫薇属，是重要的观赏园艺植物。紫薇传统繁殖方式主要为播种繁殖和扦插繁殖，但播种繁殖易产生变异，且繁殖速度较慢，扦插繁殖成活率低。

近年来，随着生物技术的发展，组织培养快繁技术成为解决上述问题的重要途径。已经利用紫薇带腋芽的嫩茎或种子为外植体，进行紫薇快繁，并建立了紫薇的快速繁殖体系。国内外研究者开发了紫薇人工种子胶囊单元的生产技术并发现矮生紫薇的外植体以带腋芽茎段的成活率最高。

随着细胞生物学和分子生物学等理论与技术的发展，利用体细胞胚胎发生技术，建立无性系是细胞工程中植株再生的重要途径之一。木本植物体细胞胚胎发生研究始于70年代后期，到80年代后期90年代初得到迅速发展。在木本被子植物的体细胞胚胎发生研究中，已经从46科95属大约140多个树种的组织培养中观察到体细胞胚可诱导出再生植株。体细胞胚发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高和操作简单的特点。而且为研究植物细胞的分化、发育、全能性表达和遗传转化、突变体筛选提供了良好的基础。

前人对紫薇组织培养和快繁的研究仅局限于用固体培养基来诱导嫩茎或种子萌发丛生芽。关于紫薇体细胞胚发生、发育及生根系统建立的方法，国内外尚无文献报道。因此，利用细胞工程快繁技术开发出一种稳定、可控的紫薇体细胞胚发生、发育及生根体系，对于实现紫薇快繁加速产业化生产奠定理论基础和提供切实可行的方法来说尤为必要；同时，也可以为紫薇的生物技术育种、种质资源保存、快速繁殖、遗传转化建立良好的实验体系。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法，本发明通过自主研发的体细胞胚诱导方法，成功诱导出了胚状体并萌发发育成苗。

本发明提供一种紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法，包括：

步骤1)紫薇无菌苗的培养及外植体的选取；2)愈伤组织的诱导；3)胚性愈伤组织的诱导；4)体细胞胚的发生及发育；5)体细胞胚的诱导生根；6)移栽成苗。

进一步地，针对步骤1)，其特征在于，无菌苗的培养具体为：将紫薇的种子在室温条件下用自来水浸泡24-28小时；接种前做表面灭菌处理：75％的酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2遍，然后浸入体积分数为0.1％的hgcl2溶液中10分钟，然后用无菌水冲洗5-6遍；将种子接种在ms0培养基上，培养温度为(25±2)℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间12h/d。所述外植体为紫薇无菌苗的子叶。

进一步地，针对步骤2)，其特征在于，愈伤组织的诱导具体为：将步骤1)所得无菌苗的子叶剪成1.0～2.0mm的小块，接种在诱导愈伤组织的培养基上，在恒温25℃黑暗条件下诱导愈伤组织。

优选的，所述步骤2)中，愈伤组织诱导培养基为：ms+4mg/l2,4-d+1.0mg/lba。

进一步地，针对步骤3)，其特征在于，胚性愈伤组织的诱导具体为：将步骤2)所得的愈伤组织接种在胚性愈伤诱导培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下诱导胚性愈伤组织。所述胚性愈伤组织诱导培养基为：ms+4mg/l2,4-d+0-1.0mg/lnaa+0-2.0mg/lba或ms+4mg/l2,4-d+0-1.0mg/lnaa+0-2.0mg/lkt。

优选的，所述步骤3)中，胚性愈伤组织诱导培养基为：ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+1.0mg/lba。

进一步地，针对步骤4)，其特征在于，体细胞胚的发生及发育具体为：将步骤3)所得的胚性愈伤组织接种于体细胞胚发生发育培养基上，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养。所述体细胞胚发育培养基为：ms+0-4mg/l2,4-d+0-0.2mg/lnaa+0-2.0mg/lba+0-0.3mg/liba或ms+0-4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+0-2.0mg/lkt+0-0.3mg/liba或ms0。

优选的，体细胞胚发育培养基为：ms+0.5mg/lba+0.3mg/liba。

进一步地，针对步骤5)，其特征在于，体细胞胚的诱导生根具体为：当步骤4)中的幼苗长到3cm以上时，将幼苗接种到诱导生根的培养基中，在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下进行培养。所述诱导生根培养基为：1/2ms+1.0mg/lnaa，或1/2ms+0.5mg/liba。

进一步地，针对步骤6)，其特征在于，移栽成苗具体为：当步骤5)中的幼苗根长达到1.5-2.0cm，有4片真叶展开时，经炼苗后移栽。

优选的，所有培养基中的加添的蔗糖浓度均为30g/l，琼脂均为9g/l，ph均为5.7-5.8。

此外，本发明还公开了以上任一所述的诱导方法在紫薇遗传转化体系建立、原生质体培养、优良无性系繁殖、基因工程和突变体筛选中的用途。

本发明的有益效果在于：

本发明首次提出观赏植物紫薇体细胞胚诱导及植株再生的方法，愈伤组织诱导率及出胚率均接近100％，为紫薇通过体细胞胚发生方式获得再生植株提供了一种方便、快捷和有效的方法，具有较好的社会经济效益。

本发明处于领先地位，对于实现紫薇体细胞胚的工厂化育苗奠定理论基础和提供切实可行的方法来说尤为必要，也为紫薇的生物技术育种、快速繁殖、遗传转化奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为在(2)号愈伤组织诱导培养基中获得的紫薇愈伤组织；

图2为培养10天时，在(11)(12)号体细胞胚发生发育培养基中获得的原胚；

图3为培养20天时，在(11)号体细胞胚发生发育培养基中获得的球形胚；

图4为培养20天时，在(12)号体细胞胚发生发育培养基中获得的球形胚；

图5为培养30天时，在(11)(12)号体细胞胚发生发育培养基中获得的心形胚；

图6为培养30天时，在(11)(12)号体细胞胚发生发育培养基中获得的鱼雷形胚；

图7为培养30天时，在(11)(12)号体细胞胚发生发育培养基中获得的子叶形胚；

图8-10为培养30天时，在(11)号体细胞胚发生发育培养基中获得的完整体细胞胚。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明所述内容作进一步详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或更变，均应包括在本发明的范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、紫薇无菌苗的培养及外植体的选取

紫薇种子采自于河北科技师范学院。将紫薇的种子在室温条件下用自来水浸泡24-28小时，每5-6小时换一次水。接种前做表面灭菌处理，即于超净工作台上用75％的酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2遍，然后浸入体积分数为0.1％的hgcl2溶液中10分钟，用玻璃棒轻轻搅动，使材料均匀消毒。然后用无菌水冲洗5-6遍，将种子接种在ms0培养基上。培养温度为(25±2)℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间12h/d。

选取无菌苗的子叶作为外植体。

实施例2、愈伤组织的诱导

将实施例1中的无菌苗的子叶垂直于主叶脉剪成1.0-2.0mm的小块，接种在诱导愈伤组织的培养基上，每种培养基接种40段。愈伤组织诱导培养基在ms培养基中加入不同种类的激素，如下所示：

(1)ms+4mg/l2,4-d+1.0mg/lnaa

(2)ms+4mg/l2,4-d+1.0mg/lba

(3)ms+4mg/l2,4-d+1.0mg/lkt

并且，培养基中含3％的蔗糖，加琼脂前将ph调至5.7-5.8，随后在121℃、压力101kp高温、高压条件下灭菌15分钟。恒温25℃黑暗条件下分别培养10d、20d、30d至诱导出愈伤组织。

3种培养基均使紫薇子叶碎片形成愈伤组织，诱导率100％，且前20天表现相似，30天时全部形成愈伤，但诱导出的愈伤组织明显不同。含有naa的(1)号培养基的愈伤组织为雪花状白色，表面具有绒毛，为非胚性愈伤，含有ba的(2)号培养基的愈伤组织为乳白色，致密，粒状堆积物型，解剖镜下观察多为圆球状，水分含量大，有粘性，有部分胚性愈伤的产生(图1)；含有kt的(3)号培养基为乳黄色，松软，显微镜下观察，其细胞质稀薄，液泡较大。对紫薇的愈伤组织诱导时，ba效果远好于kt。

实施例3、胚性愈伤组织的诱导

将实施例2中诱导的愈伤组织接种在胚性愈伤诱导培养基上，每种培养基接种40块，胚性愈伤组织诱导培养基在ms培养基中加入不同种类的激素，如下所示：

(1)ms+4mg/l2,4-d+1.0mg/lnaa

(2)ms+4mg/l2,4-d+1.0mg/lba

(3)ms+4mg/l2,4-d+1.0mg/lkt

(4)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+0.5mg/lba

(5)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+1.0mg/lba

(6)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+1.5mg/lba

(7)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+2.0mg/lba

(8)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+0.5mg/lkt

(9)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+1.0mg/lkt

(10)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+1.5mg/lkt

(11)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+2.0mg/lkt

并且，培养基中含3％的蔗糖，加琼脂前将ph调至5.7-5.8，随后在121℃、压力101kp高温、高压条件下灭菌15分钟。在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下培养20d至诱导出胚性愈伤组织。

11种培养基均能诱导出胚性愈伤组织，但诱导率明显不同。(1)号培养基上胚性愈伤组织的诱导率仅为25％；(2)、(4)-(7)的ba系列处理对胚性愈伤组织的诱导率均在60％以上，效果明显优于其他处理，其中，(4)-(7)的ba与naa配合使用效果最佳，配合系列中，随ba浓度增加，诱导率上升，在ba浓度达1.0mg/l时，诱导率达100％，之后随浓度增加，诱导率降低(表1)。对胚性愈伤组织的诱导中，kt的效果远低于ba，而且以细胞分裂素ba与0.2ml/l的naa配合诱导效果较好，ba浓度在1.0mg/l诱导率达100％。

表1不同处理对胚性愈伤诱导的影响

实施例4、体细胞胚的发生及发育

将实施例3中胚性愈伤组织接种于体细胞胚发生发育培养基上，每种培养基接种40块，体细胞胚的发生发育培养基在ms培养基中加入不同种类的激素，如下所示：

(1)ms+4mg/l2,4-d+1.0mg/lba

(2)ms+4mg/l2,4-d+1.0mg/lkt

(3)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+0.5mg/lba

(4)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+1.0mg/lba

(5)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+1.5mg/lba

(6)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+2.0mg/lba

(7)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+0.5mg/lkt

(8)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+1.0mg/lkt

(9)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+1.5mg/lkt

(10)ms+4mg/l2,4-d+0.2mg/lnaa+2.0mg/lkt

(11)ms+0.5mg/lba+0.3mg/liba

(12)ms0

并且，培养基中含3％的蔗糖，加琼脂前将ph调至5.7-5.8，随后在121℃、压力101kp高温、高压条件下灭菌15分钟。在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下诱导体细胞胚萌发并发育。分别在培养10d、20d、30d时，在解剖镜下进行观察。

10天时进行镜检，与胚性愈伤组织诱导培养基相同的(1)-(10)号培养基中仍为胚性愈伤，含iba的(11)和无激素的(12)号培养基上出现原胚(图2)，20天时进行镜检，(1)-(10)号培养基上有原胚出现，而(11)和(12)号培养基上有绿色的颗粒状突起物出现，经镜检为球形胚(图3-4)。30天时进行镜检，(1)-(10)号培养基的原胚上发生球形胚和心形胚，此时愈伤组织和体细胞胚的数量也大大增多。(11)和(12)号培养基发生心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚(图5-7)，且此时的体细胞胚与周围的愈伤组织易分离。继续培养30天后(11)号培养基中形成完整的体细胞胚(图8-10)，随着时间的延长，体细胞胚形成植株雏形。而(12)号无激素培养基中虽可以观察到心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚。但继续培养产生不正常的植株，同时有大量的白色根毛。

(11)号培养基诱导的体细胞胚数明显最多，畸形胚率最低。无激素处理的培养基上畸形胚率较低，但其诱导率相对较低。(1)-(10)号培养基对体细胞胚的诱导率低，畸形胚率高，虽然(4)号培养基能很好的诱导出胚性愈伤组织，但与(11)号相比，其体细胞胚诱导率明显较低。这说明胚性愈伤组织诱导培养基，能使体细胞胚发生发育，但效果较差(表2)。

表2不同处理对紫薇体细胞胚发生发育的影响

实施例5、体细胞胚的诱导生根

当实施例4中的幼苗长到3cm以上时，将幼苗切下分别接种到诱导生根的培养基中，每种培养基接种20株，诱导生根培养基在1/2ms培养基中加入不同种类的激素，如下所示：

(1)1/2ms+0.1mg/lnaa

(2)1/2ms+0.5mg/lnaa

(3)1/2ms+1.0mg/lnaa

(4)1/2ms+1.5mg/lnaa

(5)1/2ms+2.0mg/lnaa

(6)1/2ms+0.1mg/liba

(7)1/2ms+0.5mg/liba

(8)1/2ms+1.0mg/liba

(9)1/2ms+1.5mg/liba

(10)1/2ms+2.0mg/liba

并且，培养基中含3％的蔗糖，加琼脂前将ph调至5.7-5.8，随后在121℃、压力101kp高温、高压条件下灭菌15分钟。在26-28℃、12-14h/d光照、1800-2000lx光照强度、60％-80％湿度下诱导体细胞胚生根。培养20天时调查生根率，并观察根质。

培养20d后发现，随naa浓度增加，生根率和平均每段根数增加，(3)号培养基，即在naa浓度达1.0mg/l时，生根率达最高，之后随浓度增加，生根率降低；平均每段根数在(4)号培养基，即naa浓度达1.5mg/l时最多(表3)。

表3不同处理对生根的影响

从根质分析，根细长且根毛多，其吸收能力强，不易受损伤，有利于移栽成活，(2)、(3)号培养基上的根细长，根毛多。总体来看，(3)号培养基的生根效果较好。含iba的系列处理对根的影响趋势与naa的相似，在浓度达1.0mg/l时生根率最高，在0.5mg/l时，平均每段根数最多，从根质来看，除(10)号处理的根愈伤化外，其他根质差不多。比较naa和iba处理，含naa的处理生根率相对较高，其(2)、(3)处理的根质较好；含iba的处理其根愈伤化较轻，虽然根毛都较少，但(7)号处理平均每段根数达8条。

实施例6、移栽成苗

当实施例5中(2)、(3)和(7)号生根培养基上的幼苗根长达到1.5～2.0cm，有4片真叶展开时，可以将小苗移栽入已灭菌的蛭石中。移栽时将根部的培养基冲洗干净，并尽量少损伤根系。移栽后浇透水，防止小苗失水死亡，加盖薄膜，保持水分在80％-90％之间，温度为24±1℃。在小苗展开新叶前，每天喷洒清水，待有新叶长出后可以适量施用营养液，促进苗壮。移栽成活率均达94％以上。