一种伊乐藻组织培养与快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及沉水植物伊乐藻的组培和快速繁殖 方法，该方法是利用完全无菌和严格的控温措施，实现了沉水植物在实验室大量生产，并可 以推广到生态环境修复。
【背景技术】
[0002] 伊乐藻属于被子植物门（Angiospermae)单子叶植物纲（Monocotyledonidae)水 鳖科。目前湖泊生态修复工程中作为净水工具种和植被恢复先锋物种、鱼虾蟹塘养殖过程 中作为饵料、避难和产卵场所，以及室内观赏水族养殖过程中作为布景材料的迫切需要。运 用组织培养技术，获得并大规模扩繁其优质工程苗，以克服该物种在自然环境中种源有限 且污染严重的问题。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一种伊乐藻组织培养与快速繁殖方法，该方法是在无菌条件下，采 取控温措施，给予固定光照，培养无菌苗体系，可常年提供大量无菌幼苗。方法易行，操作方 便，产量高。
[0004] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
[0005] -种伊乐藻组织培养与快速繁殖方法，包括以下步骤：
[0006] A、外植体选择与预处理：选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的带腋芽的伊乐藻茎 段作为外植体，用碱性洗涤剂浸泡30min，再在自来水下冲洗2h，用蒸馏水反复冲洗4-5次， 用无菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台。
[0007] B、外植体灭菌：在无菌操作台上首先用70% (体积比）乙醇浸泡15s，用无菌水 冲洗4-5次，再用0. 1 % (质量体积比，0. lg氯化汞加入100ml水中）氯化汞进行表面消毒 2-5min，无菌水冲洗4-5次，放入0. 15%质量体积比的无菌柠檬酸溶液中切割，在无菌滤纸 上将水吸干，待用。
[0008] C、芽诱导：将形态及大小相似的1-1. 5cm的伊乐藻外植体接入芽诱导培养基，外 植体上的芽经过了幼叶剥离处理，留下有2-3幼叶包裹的生长点，于光照培养箱中静置培 养，待幼芽长至1. 0-1. 5cm可进行增殖培养。
[0009] 所述的芽诱导培养基为：MS固体培养基+KT 0? 50-2. 0mg/L+NAA 0? 10-0. 50mg/L+ 蔗糖浓度为3% (质量体积比），pH 5. 8-6. 0。
[0010] D、增殖培养：将长约1. o-l. 5cm的幼芽接入增殖培养基中，置于光照培养箱中静 置，进行增殖培养，幼芽长至3-4cm可进行生根。
[0011]所述的增殖培养基为：1/2MS 液体培养基 +KT 0? 50-2. 00mg/L+NAA 0? 10-0. 50mg/ L+ 鹿糖 1. 5%。
[0012] 每隔20-25d继代一次，形成的幼芽，切成1. 0-1. 5cm，转入增殖培养基，在与步骤D 相同培养条件下继续进行增殖培养，扩繁植株；
[0013] E、生根：将幼芽接入生根培养基中，置于光照培养箱中静置培养。
[0014] 所述的生根培养基为：1/2MS液体培养基+NAA 0? 10-0. 50mg/L+蔗糖1. 5%。
[0015] F、炼苗和移栽：待不定根长至2. 0以上时，打开瓶盖，室温下炼苗l-2d后（打开瓶 盖，静置在培养箱内即可），取出试管苗，洗净其根部培养基，移栽至自然水体中。
[0016] 步骤(：，〇3均为无菌环境，光照6〇-7〇11￡八1112*8)，光照周期为1211/(1，室内温度 (22±2)°C。
[0017] 以上所述的方案中，优选的，步骤B中，氯化汞的消毒时间为2min ;步骤C和D中， KT的浓度为0? 50mg/L，NAA的浓度为0? lmg/L。
[0018] MS培养基配方如下：单位mg/L
【主权项】
1. 一种伊乐藻组织培养与快速繁殖方法，包括以下步骤： A、 外植体选择与预处理：选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的带腋芽的伊乐藻茎段作 为外植体，用碱性洗涤剂浸泡30min，再在自来水下冲洗2h，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无 菌水再反复清洗4-5次，置于无菌操作台； B、 外植体灭菌：在无菌操作台上首先用70%乙醇浸泡15s，用无菌水冲洗4-5次，再用 0. 1%氯化汞进行表面消毒2-5min，无菌水冲洗4-5次，放入0. 15%质量体积比的无菌柠檬 酸溶液中切割，在无菌滤纸上将水吸干，待用； C、 芽诱导：将形态及大小相似的1-1. 5cm的伊乐藻外植体接入芽诱导培养基，外植体 上的芽经过了幼叶剥离处理，留下有2-3幼叶包裹的生长点，于光照培养箱中静置培养，待 幼芽长至1. 0-1. 5cm可进行增殖培养； 所述的芽诱导培养基为：MS固体培养基+KT 0· 50-2. 0 mg/L+NAA 0· 10-0. 50 mg/L + 蔗糖浓度为3%，pH 5. 8-6. 0 ; D、 增殖培养：将长约I. 0-1. 5cm的幼芽接入增殖培养基中，置于光照培养箱中静置，进 行增殖培养，幼芽长至3-4cm可进行生根； 所述的增殖培养基为：1/2 MS液体培养基+KT 0. 50-2. 00mg/L+ NAA 0. 10-0. 50mg/L +鹿糖I. 5% ; 每隔20-25d继代一次，形成的幼芽，切成1.0-1. 5cm，转入增殖培养基，在与步骤D相同 培养条件下继续进行增殖培养，扩繁植株； E、 生根：将幼芽接入生根培养基中，置于光照培养箱中静置培养； 所述的生根培养基为：1/2MS液体培养基+NAA 0. 10-0. 50mg/L+蔗糖1. 5% ; F、 炼苗和移栽：待不定根长至2. 0以上时，打开瓶盖，室温下炼苗l-2d后(打开瓶盖，静 置在培养箱内即可)，取出试管苗，洗净其根部培养基，移栽至自然水体中； 步骤C，D，E均为无菌环境，光照60-70μΕ/ (m2 · s)，光照周期为12h/d，室内温度 (22±2) °C。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤B中，氯化汞的消毒时间为2min ;步 骤C和D中，KT的浓度为(λ 50mg/L，NAA的浓度为(λ lmg/L。
【专利摘要】本发明公开了一种伊乐藻组织培养与快速繁殖方法，其步骤是：A.外植体选择：选择生长健壮，颜色鲜绿，无病虫害的植物茎作为外植体。B.外植体灭菌：用酒精和氯化汞处理外植体。C.芽诱导：选择最佳的激素配比诱导芽生长。D.增殖培养：调整激素配比和培养基浓度进行增殖培养。E.生根：选择合适的细胞生长素进行生根诱导。F.炼苗和移栽：在培养箱中打开瓶口培养两天，在转入自然水体中培养。该技术可以不受季节环境限制，培养出大量无菌苗，供水生生态系统恢复之用。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104663439
【申请号】CN201510077015
【发明人】李涛, 母丹丹, 任明磊, 李琪, 赵进东
【申请人】中国科学院水生生物研究所
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月13日