一种凤丹组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种凤丹组织培养方法。
【背景技术】
[0002]凤丹{Paeonia ostii)为苟药科苟药属多年生小灌木牡QPaeoniasuffruticosa Andr.)品种，集药、食、观赏为一体，尤其以其根皮中丹皮酸在镇痛、抗菌消炎、治疗心血管、肿瘤等疾病方面显示出较好的药理活性，同时，除用于医药制剂原料外，现还广泛应用于牙膏及护发、护肤、美容等日化产品的原材料，具有良好的临床应用和开发价值。
[0003]凤丹，实为牡丹品种，其具有药用价值的同时，也兼有观赏价值。关于牡丹的组织培养，国内的研宄不少，但绝大部分的研宄都是为了获得观赏型牡丹品种的无菌苗为目的。本发明以凤丹新抽芽为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、增殖、丛生芽诱导、生根诱导等过程实验了凤丹的离体培养，为凤丹的工厂化生产和推广应用提供了技术支持。
【发明内容】
[0004]本发明以凤丹新抽芽为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、增殖、丛生芽诱导、生根诱导等过程实验了凤丹的离体培养，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种凤丹组织培养方法，包括以下的步骤:
(I)外植体消毒处理:选择0.5g/L GA3处理2年生实生苗后新抽的新芽为外植体，先用洗衣粉水浸泡10?30min，再用自来水漂洗干净，然后置于超净台上，用75%酒精消毒30?60s,无菌水冲洗4?6遍后再用2.5 %次氯酸钠溶液消毒10?30min，消毒滤纸吸干水分后备用。
[0006](2)愈伤组织诱导:将步骤(I)消毒处理好的新芽切取0.5cm左右长度的茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待出现愈伤组织后再移至置于每天光照12?14小时，光照强度为1000?20001x，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率。
[0007](3)增殖培养:将步骤(2)诱导培养得到的愈伤组织转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001x，置于培养温度为25?280C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况。
[0008](4)丛生芽诱导:将步骤(3)继代得到的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001χ，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化情况。
[0009](5)生根培养:将经步骤(4)分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12?14小时，光照强度为2000?30001χ，置于培养温度为25?28°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况。
[0010](6)炼苗移栽:试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗，小心洗净基部残留的培养基，选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水，遮荫处理。移栽后经常喷水，保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植。
[0011]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+1.0?3.0mg/L 6-BA+ 0.1?0.5mg/LNAA+0.1 ?0.5g/L LH+1 ?2g/L PVP+25 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?
5.8ο
[0012]上述步骤(3 )所述的增殖培养基为:MS+1.0?2.0mg/L6_BA+0.1?0.2mg/LNAA+25 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
上述步骤(4)所述的芽诱导培养基为:MS+0.5?1.0mg/LNAA+0.1?0.5mg/L6-BA+20 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
上述步骤(5)所述的生根培养基为:1/2MS+1.0?5.0mg/LNAA+20?30g/L蔗糖+3.5?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
本发明的优点是:以凤丹新抽芽为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、增殖、丛生芽诱导、生根诱导等过程实验了凤丹的离体培养，为凤丹的工厂化生产和推广应用提供了技术支持。
【具体实施方式】
[0013]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0014]实施例1
(I)外植体消毒处理:选择0.5g/L GA3处理2年生实生苗后新抽的新芽为外植体，先用洗衣粉水浸泡lOmin，再用自来水漂洗干净，然后置于超净台上，用75%酒精消毒30s，无菌水冲洗4遍后再用2.5 %次氯酸钠溶液消毒lOmin，消毒滤纸吸干水分后备用。
[0015](2)愈伤组织诱导:将步骤(I)消毒处理好的新芽切取0.5cm左右长度的茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待出现愈伤组织后再移至置于每天光照12小时，光照强度为15001x，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率达到76.9%ο所述的诱导培养基为:MS+1.5mg/L 6-BA+ 0.3mg/L NAA+0.4g/L LH+lg/L PVP+25g/L 蔗糖 +3.8g/L 琼脂，pH 为 5.5。
[0016](3)增殖培养:将步骤(2)诱导培养得到的愈伤组织转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照12小时，光照强度为25001x，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数为2.8。所述的芽诱导培养基为:MS+0.6mg/LNAA+0.3mg/L6-BA+25g/L 蔗糖 +3.8g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0017](4)丛生芽诱导:将步骤(3)继代得到的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为20001χ，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后分化率为64.9%ο所述的芽诱导培养基为:MS+0.7mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+20g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为 5.4。
[0018](5)生根培养:将经步骤(4)分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为20001χ，置于培养温度为25°C，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根率达到96%。所述的生根培养基为:1/2MS+1.5mg/LNAA+25g/L 蔗糖 +3.8g/L 琼脂，pH 为 5.6。
[0019](6)炼苗移栽:试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗，小心洗净基部残留的培养基，选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水