域化r)和（iii)用于驱动重组蛋白表达的适 当启动子。用于昆虫的重组DNA元件优选组合如上所述。此外，重组杆状病毒优选为包括 编码重组蛋白的核酸序列。
[0070] 除了适用于W杆状病毒进行整合或转座的序列外，本发明还公开了可用于产生本 发明的昆虫和/或重组杆状病毒且包含所述使得蛋白IE-1、IE-0和/或其片段高于内源水 平地表达的序列的转移载体。
[0071] 转移载体一般能够向杆状病毒中插入基因信息。
[0072] 转移载体优选为，除了ω高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的 序列外，还包括相连的（ii)重组同源区域化r)和（iii)用于驱动重组蛋白表达的适当启 动子。用于昆虫的重组DNA元件优选组合如上所述。
[0073] 在一个优选实施例中，所述转移载体包含编码所述重组蛋白的核酸序列，而在另 一个优选实施例中，所述转移载体不含所述序列。
[0074] 在一个优选实施例中，所述转移载体为杆粒。
[00巧]"杆粒化acmid)"指的是一种质粒结构，其包含在转染入细胞后足W产生杆状病毒 的DNA序列。
[0076] 在又一个优选实施例中，所述转移载体源自W下市售杆状病毒表达体系中的任 一种："Bac-10-Bac"'" (invitrogen?)、"BacPAK?" (Clontech?)、"FlashBAC?"(Oxford Expression Technologies?)、"BacuVance?" (GenScript?)、"Bac-N-Blue DM?" (invitrogen?)、"BaculoDirect?" (invitrogen?)、"BacVector" " 1000、2000、 3000 (Novagen?'）、"Diamon地acTM"( Sigma-Akiri油虫或"Ba州loGold?"度D biosciences?)。
[0077] 本发明公开了一种可用于产生本发明中的昆虫、重组杆状病毒和/或转移载体， 包含所述能够高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列，且适用于细菌复 制的克隆载体。
[0078] "克隆载体"指的是任何适用于克隆的载体，一般包括限制性位点、细菌繁殖的复 制起点W及选择标记。
[0079] 该克隆载体优选为：除了（i)高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段 的序列外，还包括相连的（ii)重组同源区域化r)和（iii)用于驱动重组蛋白表达的适当 启动子。用于昆虫的重组DNA元件优选组合如上所述。
[0080] 在一个优选的方面中，所述克隆载体包括编码所述重组蛋白的核酸序列（亦称为 "供体载体"），而在另一个优选实施例中，所述克隆载体不含所述序列。
[0081] 本发明公开了一种可用于产生本发明中的昆虫、重组杆状病毒和/或克隆载体且 包含所述能够高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列的核酸序列。
[0082] 该核酸序列优选为，除了ω高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段 的序列外，还包括相连的（ii)重组同源区域化r)和（iii)用于驱动重组蛋白表达的适当 启动子。用于昆虫的重组DNA元件优选组合如上所述。
[0083] 在一个优选实施例中，所述核酸序列包含编码所述重组蛋白的核酸序列，而在另 一个优选实施例中，所述核酸序列不含所述序列。
[0084] 序列说明
[0085]
[0086] 根据布达佩斯条约的微生物保藏
[0087] 质粒保藏于西班牙模式菌种保藏中屯、（CECT) (www.cect.org)(地址University ofValencia(ParcCientlficUniversitatdeValencia);CatedroticoAgustln Escardino, 9 ;46980Paterna(Valencia),Spain)，检索号CECT8031，保藏日期 2011 年 10 月 4曰D
[008引 实施例
[0089]实施例1 :杆状病毒载体表达体系化EV巧中，杆状病毒转录调控因子的过度表达， 使得与启动子功能性相连的同源区域化r)的增强子功能加强，提高重组蛋白表达。
[0090] 由AcMNPV中的Ac-ie-OlcDNA所编码的立即早期病毒蛋白IE-1和IE-0是强力的 杆状病毒转录调控因子。所述蛋白W同源二聚体形式与充当转录增强子的杆状病毒同源区 域化r)序列结合，能够增强运些蛋白对反式激活的调节。AcMNPVIE-1/IE-0是67-72kDa 的二聚体DM结合性蛋白，在质粒转染实验中，能够通过其N端酸性区域的活性来刺激转 录（7, 8)。IE-1和IE-0合成于感染极早期，在细胞核中累积，且保留于此度过晚期。使用 双质粒pFas1:Bac?(invit;rogen?)，在po化启动子的控制下克隆Ac-ie-〇lcDNA。在同一 质粒的不同位点上，GFP编码基因被克隆于早前合成的hrlp6. 9pl0嵌合启动子的下游，所 述嵌合启动子包含融合的同源区域虹1和启动子p6. 9和plO。所得到的本发明杆状病毒 表达组件W及重组DNA元件的假定功能如图1所示。所得质粒用于W"Bac-U)-Bac''"体系 (invitrogen?)生成重组杆状病毒。同时，W同样的体系制备在PO化启动子控制下表达GFP 蛋白的常规杆状病毒。
[0091]W低感染剂量或高感染剂量巧X102或5x104)感染粉纹夜蛾（Trichoplusiani) 幼虫96小时后，W巧光光度法研究不同杆状病毒调节的GFP蛋白表达。含有上述本发明表 达组件的杆状病毒使得幼虫提取物中的GFP表达水平提高了约13 %至超过40 %，取决于所 用的病毒剂量（图4A)。使用在昆虫源地2g启动子控制下表达Ac-ie-〇lcDNA的杆状病毒， 或在虹lpB2亦10启动子控制下表达GFP的杆状病毒，观察到相似结果（数据未显示）。 [009引实施例2 :大感染剂量的本发明杆状病毒表达组件通过Ac-ie-01cDNA编码的转 录调控因子提高了受杆状病毒感染的昆虫幼虫的存活率和昆虫生物量回收量
[0093] 在上一实施例中，展示了本发明杆状病毒组件中表达重组蛋白的杆状病毒在蛋白 生产能力方面的优势。但是，观察到的最主要差异还是高感染剂量下的幼虫存活百分比 (最大生产力）。在所述感染条件下，含有本发明表达组件的杆状病毒令幼虫存活率提高了 约70% (图4B)。运意味着，使用常规的杆状病毒时，最优感染条件为使用5x10申即S的 感染剂量（最大幼虫成活率）。但是，通过使用含有本发明表达组件的杆状病毒，可W使用 5x104的剂量，而在生产过程末尾回收到相同数目的幼虫（图4B)。在所述最优生产条件 下巧xl04P即S感染量），含有本发明表达组件的杆状病毒产生的重组蛋白量超过常规杆状 病毒巧x102PFUs)最优剂量感染昆虫幼虫的两倍（图4A和4B)。
[0094] 使用不同剂量的常规杆状病毒（PO化GFP)或含有本发明的表达组件 po化Ac-ie-01/虹lp6. 9plOGFP的杆状病毒（两者均表达GFP蛋白），进行幼虫感染研究，发 现当使用含本发明表达组件时，受感染幼虫的存活率提高（图5A)。在最高感染剂量巧X 1〇4)下，与用常规杆状病毒感染的幼虫相比，用含本发明表达组件进行感染的幼虫的存活 率提高了超过70%。该受感染幼虫的存活率对生产过程末尾所回收的昆虫生物量回收量具 有直接显著的效果，当使用最大剂量（最大生产力）的含本发明表达组件的杆状病毒时，所 述昆虫生物量回收量提高了 80% (图5B)。
[0095] 为了测定本发明杆状病毒高剂量感染后存活率提高的相关有趣性质的遗传因素 原因，生制备在po化启动子控制下表达Ac-ie-01cDNA编码的转录调控因子的重组杆状 病毒。然后，用该杆状病毒W高剂量感染粉纹夜蛾幼虫（T.ni)。作为对照，我们使用了 在相同启动子控制下表达GFP蛋白的杆状病毒。与W本发明的表达组件po化Ac-ie-01/ 虹lp6. 9plOGFP所感染的幼虫相似，受过度表达Ac-ie-01cDNA(po化Ac-ie-01)的杆状病 毒感染的幼虫，与受相同启动子（po化GF巧控制表达GFP的常规杆状病毒感染的幼虫相比， 也显示出提高的存活率（图6A)。运强烈地暗示着，本发明中的杆状病毒表达组件中所用 的转录调控因子的过度表达，保护昆虫幼虫不受杆状病毒导致的死亡率影响，允许长期表 达（更多重组蛋白产量）并使用高感染剂量（最大生产力）来提高昆虫生物量回收量（图 她）。
[0096] 实施例3 :Ac-ie-01cDNA编码的转录调控因子在杆状病毒表达体系中的过度表 达促进用作生物工厂的受感染昆虫幼虫中的重组蛋白翻译后加工
[0097] 杆状病毒感染期间的细胞完整性，对保证该体系中表达的外源蛋白的正确折叠或 任意翻译后加工而言，非常重要。常用于研究和生产的杆状病毒强启动子，例如PO化和 plO,仅在感染后晚期表达外源基因，而此时受感染细胞已经表现出严重的细胞病变效应， 且细胞活力降低。如上所述，本发明的杆状病毒表达组件中所用的转录调控因子的过度表 达，保护细胞不受杆状病毒感染的病原作用影响，允许保持完全活力的细胞具有用于重组 蛋白生产的较宽时间窗口。
[0098] 对本发明的表达组件中所含重组DNA元件与作为活生物工厂的昆虫幼虫中 的重组蛋白翻译后修饰的相关性进行了研究。为此，使用PO化GFP启动子控制下表达 报告蛋白GFP的常规杆状病毒、含本发明杆状病毒组件且亦表达GFP蛋白的杆状病毒 (PO化Ac-ie-01/虹lp6. 9plOGFP)，W5x10中即S的剂量来感染昆虫幼虫。
[0099] 感染后96小时，用SDS-PAGE凝胶和考马斯亮蓝染色来分析受感染幼虫提取物 (图7A)。有趣的是，常规杆状病毒表达的GFP蛋白条带的分子量降低（低于预期），暗示着 重组蛋白的降解或错折叠。相反地，当使用本发明的杆状病毒表达组件来介导GFP蛋白表 达时，所得GFP条带显示出该蛋白的预期分子量，即约27kDa。
[0100] 还使用抗GFP单克隆抗体W免疫印迹法来分析受感染幼虫的提取物（m油2515 ; Millipore?)(图7C)。在两种杆状病毒感染幼虫的提取物中均检测出了GFP蛋白，但用考 马斯亮蓝染色，却观察到重组蛋白的电泳涧度差异。
[0101] 同时，在感染后的不同时间点，使用特异抗血清对细胞微管蛋白进行免疫印迹分 析，W测量细胞机器的完整性（图7B)。常规杆状病毒感染在感染后96小时严重损坏了细 胞完整性，因此在该时间点后检测到的微管蛋白条带急剧减少（因细胞完整性的完全丧失 而降解）。而W本发明表达组件所改造的重组杆状病毒所感染的细胞中，细胞微管蛋白并 未受到同样影响，运符合本发明的杆状病毒表达组件中所含重组DNA元件所带来的细胞保 护。
[0102] 实施例4 :细胞培养物和病毒
[0103] 27 °C下，在6孔组织培养板中W含有10 %热灭活牛胎血清（Pan Biotech?,Germany)的TNM-FH昆虫培养基（PanBiotech?,Germany)培养Spodoptera frugiperdaSf21或Sf9细胞系（IxlO6细胞/孔）。使用"Bac-io-BacK"杆状病毒表达体系 (invitrogen?,USA)获得AcMNPV重组杆状病毒。使用pFas1:Bac?-DUAL质粒（invitrogen?) 制备含有本发明重组dm元件的不同转移载体。pFas巧ac?-DUAL中所包含的启动子和调 控因子是合成（GenScript?，USA)所得，其中W足量的侧翼限制序列来促进克