后覆上埋根； 6) 检测时期及检测组织： a) 现蕾期~成熟期:检测根、茎、叶、花、种子； b) 开花期~成熟期:检测根、茎、叶、花雌蕊的胚珠、花雌蕊的花柱、花雌蕊的柱头、花雄 蕊的花药、花雄蕊的花丝、花瓣； C)结芙期~成熟期:检测幼嫩种子、成熟种子、芙果皮； 7) 检测方法： ①取样：分别于现蕾期、初花期、结芙期采用添加苦参碱菌液诱灌接种方法接菌后的 5(1、15(1、30(1、60(1取样检测分析，直至种子收获;取首猜单株，随机分离出5-10畑1深±层的毛 根，茎、叶均随机取自同一植株，且分离为上部茎、下部茎、上部叶和下部叶、花丝、花瓣、胚 珠、花柱、柱头、花药、芙果皮和种子;取样用自来水冲洗干净后自然惊干； 芭手提紫外灯平板数量检测:根、茎、叶各称取Ig，花5朵/花序、芙果皮5个/花序、种子 5粒/花序，放入50ml无菌Ξ角瓶内，加入有效舰浓度为2500mg/L的舰伏消毒液淹没，震荡消 毒4min后无菌水冲洗5次，至Ξ角瓶内无泡沫状液体出现即可，完全消毒的组织分别置于无 菌研鉢中，加入2ml无菌水充分研磨后离屯、，离屯、转速为4000rpm/min，离屯、时间为5min，吸 取0.2ml上清液均匀涂布于根研磨液依次稀释1〇1-10 3的TY固体培养基，Ξ次重复，28°C培养 24-4化后，黑暗中手提紫外灯下记录每皿内巧光标记根瘤菌数量，巧光标记根瘤菌在手提 紫外灯下发青绿色光； ③体式巧光显微镜检测：黑白体式巧光显微镜视野下，绿光激发cfp显示白色，在检测 中，含CFP标记根瘤菌的首猜组织为白色，未检出的组织为黑色。
[0013] 本发明采用Ξ亲本杂交方法获得携带青色巧光(CFP)特性的，具有安全、稳定和传 代性好W及可实时原位监测等优点的內源巧光标记根瘤菌R.GN5f菌液，添加600mg/L (1.3%)的天然植物源抑菌剂苦参碱混合接种生殖生长期的甘农5号紫花首猜(Medicago sativacv.Gannong No . 5)根部；与不添加苦参碱接种方法相比，可提高根、上部茎、花、种 子、芙果皮内该巧光标记根瘤菌数量。蕾期菌液单独诱灌，毛根内R.GN5f数量最高仅为 76.1943 cfu/g，而添加苦参碱后可促进R. GN5f向毛根内运移，数量高达1.29 X 105cfu/g， 显著高于菌液单独接种处理(P<〇. 05);花期5加寸毛根内R. GN5f数量最高为34.30c化/g，但 后期检测不到巧光标记根瘤菌;而添加苦参碱后可促进R.GN5f向毛根内运移，60d数量高达 488cfu/g，显著高于菌液单独接种处理13.23倍(p<0.05)，在毛根内的定殖时间长于单独接 种处理的时间。该时期R.GN5f主要定殖于花器即为种子的形成的通道内。根部单独接种只 在胚珠内检测到，数量为1.30/花序;添加苦参碱后的菌液接种，花器内可定殖的部位和数 量分别为胚珠1.60cfu/花序，花柱和柱头1.50 cfu/花序，花药3. OOcfu/花序，且接种60d 后，芙果皮内其数量为1.20cfu/g。结芙期种子和结果皮内R.GN5f数量分别为2.10cfu/粒和 2.00cfu/粒，而单独接种未检出。
[0014] 图1-图3为紫外灯(336nm)及体式巧光显微镜下观察首猜部分器官内巧光标记根 瘤菌R.GN5f的定殖状况。
[0015] 由于所使用的苦参碱抑菌剂价格低廉，在大自然中分解后无残留，且与菌液混合 接种技术简便，检测方便，易于实验者操作。因此本发明具有很好的实用性和可靠性。
[0016] 最后应说明的是：W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 选择菌株:选取的荧光标记根瘤菌Rhizobium meliloti.GN5f(R.GN5f)，其原始菌株 Rhizobium meliloti.GN5(R.GN5)为分离自甘农5号紫花苜蓿（Medicago sativa cv .Gannong No. 5)根瘤的优良根瘤菌株;通过三亲本杂交获得含有青色荧光蛋白（CFP)的内 源荧光标记根瘤菌R.GN5f; 2) 选取植物材料:苜蓿材料为甘农5号紫花苜蓿； 3) 制备菌液:将步骤1)的菌株TY平板活化后转接入50mlTY液体培养基，28°C、180rpm/ min振荡培养至菌液光密度0D6Q()nm值为0.5-1，4000rpm/min离心5min，抛去上清液后用等体 积的无菌水冲洗菌体，并用涡振荡器将其打散，最后用无菌水调制成〇D 6QQnmS〇. 5的R. GN5f 荧光标记根瘤菌液； 4) 添加苦参碱:选取的苦参碱浓度为600mg/L，含量为1.3%，无菌操作台内苦参碱溶液 用0.22μπι无菌滤膜和无菌针管过滤灭菌后，添加至培养好的菌液中，至终浓度600mg/L; 5) 接种:分别随机选取现蕾期、初花期、结荚期的苜蓿植株5株，根部10cm范围内挖深约 5cm坑，露出主根、侧根、毛根，将制备好的荧光标记根瘤菌液按50ml/株均匀浇灌于根部，尔 后覆土埋根;未添加苦参碱的R. GN5f接种为对照； 6) 检测时期及检测组织： a) 现蕾期~成熟期:检测根、茎、叶、花、种子； b) 开花期~成熟期:检测根、茎、叶、花雌蕊的胚珠、花雌蕊的花柱、花雌蕊的柱头、花雄 蕊的花药、花雄蕊的花丝、花瓣； c) 结荚期~成熟期:检测幼嫩种子、成熟种子、荚果皮； 7) 检测方法： ①取样:分别于现蕾期、初花期、结荚期采用添加苦参碱菌液浇灌的接种方法，接种后 的5(1、15(1、30(1、60(1取样检测分析，直至种子收获，以未添加苦参碱的菌液浇灌为对照;取苜 蓿单株，随机分离出5-lOcm深土层的毛根，茎、叶均随机取自同一植株，且分离为上部茎、下 部茎、上部叶和下部叶、花丝、花瓣、胚珠、花柱、柱头、花药、荚果皮和种子;取样用自来水冲 洗干净后自然晾干； 蒙手提紫外灯平板数量检测:根、茎、叶各称取lg，花5朵/花序、荚果皮5个/花序、种子5 粒/花序，放入50ml无菌三角瓶内，加入有效碘浓度为2500mg/L的碘伏消毒液淹没，震荡消 毒4min后无菌水冲洗5次，至三角瓶内无泡沫状液体出现即可，完全消毒的组织分别置于无 菌研钵中，加入2ml无菌水充分研磨后离心，离心转速为4000rpm/min，离心时间为5min，吸 取0.2ml上清液均匀涂布于根研磨液依次稀释lOllO 3的TY固体培养基，三次重复，28°C培养 24-48h后，黑暗中手提紫外灯下记录每皿内荧光标记根瘤菌数量，荧光标记根瘤菌在手提 紫外灯下发青绿色光； ③体式荧光显微镜检测：黑白体式荧光显微镜视野下，绿光激发cfp显示白色，在检测 中，含CFP标记根瘤菌的苜蓿组织为白色，未检出的组织为黑色。2. 根据权利要求1所述的一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法，其 特征在于，TY培养基的制备方法为:胰蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、CaCl 2 ·6Η20 1.3g/L，pH至 7 · 0，121°C 灭菌 26min。
【专利摘要】本发明公开了一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法，是采用三亲本杂交方法获得携带青色荧光CFP特性的內源荧光标记根瘤菌<i>R</i>.GN5f菌液，添加的天然植物源抑菌剂苦参碱混合接种生殖生长期的甘农5号紫花苜蓿根部。本发明的有益效果为：1）目标根瘤菌<i>R</i>.GN5f通过三亲本杂交获得，遗传稳定性好，获得容易，使用方便；2）苦参碱，对空气源和土壤源微生物抑制，对根瘤菌无抑制作用，促进根瘤菌在苜蓿体内的运移和定殖；且价格低廉，对环境无毒无害；3）获得含苦参碱的荧光标记根瘤菌液容易，接种操作简单，耗时短，适宜生长时期内可随时接种；4）添加苦参碱后促进了目标根瘤菌的运移和定殖，为获得携带有大量目标根瘤菌种子奠定基础。
【IPC分类】C12R1/41, G01N21/64, C12N1/20, A01G7/06, A01G1/00
【公开号】CN105453923
【申请号】CN201510892098
【发明人】师尚礼, 苗阳阳
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月8日