专利名称：具有抑制内皮细胞生长活性的重组人内皮生长抑制蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及用基因工程方法制备具有抑制内皮细胞生长活性的重组人内皮生长抑制蛋白。
胶原蛋白是脊椎动物体内含量最丰富的一种蛋白质，占体内蛋白总量的三分之一左右，它在体内以胶原纤维的形式存在。它广泛存在于各种基底膜中，已经发现的胶原蛋白有19种之多，这19种胶原蛋白有不同的组织分布特异性。胶原蛋白的重要特点就是具有胶原蛋白结构域，在一级结构上，这一结构域的特点是Gly-X-Y的重复序列。
近年来，一些研究发现某些胶原蛋白除了在形成胞外基质结构上有重要功能，它们的非胶原蛋白结构域(NC)还可以抑制内皮细胞增殖和血管生长。其中1997年由哈佛大学的O’Reilly等人发现的内皮抑素(endostatin)是胶原蛋白XVIII的羧端非胶原结构区。它可以专一抑制内皮细胞的增殖，对成纤维细胞和其它肿瘤细胞没有抑制活性(O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，Folkman，J.(1997)Cell 88，277-285.Boehm，T.，Folman，J.，Browder，T.，and O’Reilly，M.S.(1997)Nature 390，404-407.)。通过抑制血管生长，它可以抑制裸鼠肿瘤的生长和转移并且不会引起耐药性的产生。1999年，Ramchandran R等人克隆并表达了人源的胶原蛋白XV的羧端非胶原蛋白结构区，发现它不具有抑制内皮细胞生长的活性，但是它可以抑制裸鼠体内的肿瘤生长(Ramchandran，R.，Dhanabal，M.，Volk，R.，Waterman，M.，and Segal，M.(1999)Biochemical and BiophysicalResearch Commnications.255，735-739.)。2000年，胶原蛋白VI的羧端非胶原蛋白结构域(arresten)被发现同样可以抑制内皮细胞的增殖和迁移，同时在裸鼠体内它可以抑制肿瘤的生长和迁移(Colorado PC，Torre A，Kanphaus G，Cancer Reseach，2000(60)2520-2526.)。从这些例子可以看出，某些胶原蛋白的羧端非胶原结构域在血管生长的调控上可能具有重要的作用。
本发明的第一个目的是提供一种重组人内皮生长抑制蛋白，它具有抑制内皮细胞生长的活性，但蛋白序列和结构与内皮抑素等蛋白分子不同。
本发明的第二个目的是提供这种内皮生长抑制蛋白的基因工程制备方法。
本发明提供的重组人内皮生长抑制蛋白具有如下氨基酸序列QGEYLPDMGLGIDGVKPPHATGAKKGKNGGPAYEMPAFTAELTAPFPPVGGPVKFNKLLYNGRQNYNPQTGIFTCEVPGVYYFAYHVHCKGGNVWVALFKNNEPVMYTYDEYKKGFLDQASGSAVLLLRPGDRVFLQMPSEQAAGLYAGQYVHSSFSGYLLYPM。
本发明的重组人内皮生长抑制蛋白的制备方法包括如下步骤(1)用RT-PCR方法获得胶原蛋白VIII(α1)的NC1区的基因；(2)在DNA连接酶作用下与载体连接，得到重组质粒；(3)用重组质粒转化宿主细胞并在宿主细胞中进行表达；(4)表达产物的纯化。
下面对本发明作详细描述。
本发明者从人脐带中提取总RNA，通过反转录酶Superscript H-的作用反转录成互补DNA，然后以反转录产物为模板，在Ex Taq酶作用下，经PCR扩增得到两端分别带有NdeI和XhoI酶切位点的长度约500bp的片段。PCR扩增产物经NdeI和XhoI酶切后与经同样方式处理的pET24a在T4连接酶作用下进行连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选到阳性克隆，从中得到重组质粒pETVIII。
将重组质粒pETVIII转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。收集并纯化表达产物，得到纯度高于99％、分子量为19KD左右的重组人内皮生长抑制蛋白。
本发明者还利用PCR方法将内皮生长抑制蛋白的基因与人纤溶酶原信号肽序列连接，然后克隆入pCDNA3(Invitrogen)载体，再转化DH5α菌株，筛选到阳性克隆，从中得到重组质粒pCDNAVIII。
将重组质粒pCDNAVIII转染进Bel7404细胞，pCDNAVIII转染株经扩增培养，在培养上清液中证实有内皮生长抑制蛋白的表达。
本发明用于表达内皮生长抑制蛋白的表达宿主除了上面所述的大肠杆菌BL21(DE3)和Bel7404细胞外，还可以是其他原核生物细胞和真核细胞(如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等)。
按照本发明，用基因工程方法克隆并在原核生物细胞和真核细胞中表达了人胶原蛋白VIII羧端非胶原结构域164个氨基酸(重组人内皮生长抑制蛋白)，并证实了它具有抑制牛主动脉内皮细胞生长的活性并可以引起内皮细胞的凋亡。本发明提供的蛋白分子可能作为一种潜在的药物，其活性与内皮抑素等蛋白分子相似。
图1显示了编码内皮生长抑制蛋白的基因和蛋白序列。1A为胶原蛋白VIII(α1)的NC1区的基因序列；1B为胶原蛋白VIII(α1)的NC1区的氨基酸序列。
图2表示RT-PCR核酸电泳图。泳道1为PCR产物；泳道2为分子量标准。
图3为蛋白电泳图。泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为诱导前全菌蛋白；泳道3为诱导后全菌蛋白；泳道4为胞内的可溶蛋白组分；泳道5，6，7分别为10mM、20mM、40mM咪唑缓冲液洗脱峰；泳道8为250mM咪唑缓冲液洗脱峰。
图4A为真核细胞转染株核酸电泳图。图4B为真核细胞表达产物蛋白电泳图。
图5显示重组人内皮生长抑制蛋白对BAEC生长的抑制作用。-·-表示重组人内皮生长抑制蛋白；-△-表示内皮抑素。
图6显示重组人内皮生长抑制蛋白诱导BAEC凋亡的作用。A.未加药组；B.加药5μg/ml下面用实施例对本发明作进一步举例描述。在下列实施例中，使用原核表达载体在大肠杆菌中胞内表达纯化得到重组人内皮生长抑制蛋白，而且，将人胶原蛋白VIII的NC1区的基因克隆入真核表达载体，并转染真核细胞Bel7404，经检测证明其可以在真核细胞中表达。同时，证明了纯化后的原核表达产物具有抑制内皮细胞生长和诱导内皮细胞凋亡的活性。
这些实施例仅仅是例示，而不以任何形式限制本发明。在不违背本发明的基本精神和原则的前提下，对本发明的任何等同替代、改动或改进都将落入本发明待批权利要求的范围内。
实施例1内皮生长抑制蛋白的基因的制备图1显示了编码内皮生长抑制蛋白的基因和蛋白序列。我们采用RT-PCR的方法从人脐带中获得胶原蛋白VIII的NC1区的基因。用于后面PCR反应的引物均由上海Sangon合成，引物序列如下
引物(1)5’AGATATACATATGCAGGGAGAGTATCTGCCAGAT 3’NdeI引物(2)5’GTGCTCGAGCATGGGATACAATAAATATCCTGA 3’XhoI将人脐带置于液氮中研磨至粉状，取适量粉末加入1毫升Trizol试剂中，按试剂盒说明书操作抽提总RNA，溶解在DEPC处理的去离子水中，保存于-70℃。使用Gibco BRL公司的Superscript H-反转录酶，以引物(2)作为反转录引物，按说明书操作，进行反转录。反转录产物于-20℃保存。
以反转录产物为模板，利用TaKaRa公司的Ex Taq酶和引物(1)和(2)，经PCR扩增，得到两端分别带有NdeI和XhoI酶切位点的长度约500bp的片段(图2)。PCR的反应条件是94℃反应30秒，50℃反应30秒，最后在72℃延伸30秒，共重复35个循环后，于72℃下反应5分钟以完成PCR扩增。
PCR产物经NdeI和XhoI(Takara公司产品)酶切，用低熔点胶回收后与经同样方式处理的pET24a(Novagen公司产品)在T4连接酶(华美公司产品)的作用下进行连接，转化大肠杆菌DH5α菌株。筛选到阳性克隆后，经测序证明序列完全正确，得到重组质粒pETVIII。
实施例2内皮生长抑制蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达在无菌操作下进行如下试验将大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)新鲜过夜菌以1％的体积转接至LB培基中，于37℃振荡培养至OD600为0.4左右。于10,000rpm离心1分钟，收集菌体，按每1.5mL菌液加入100μl预冷的钙溶液(50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，15磅灭菌15分钟，4℃保存)，轻轻悬浮菌体，冰浴放置10分钟，4,000rpm、4℃离心10分钟，倾去上清，再加等体积钙溶液，得到感受态菌液，用于下面的转化实验。
将实施例1所得的重组质粒pETVIII1至10ng加入上述感受态菌液100μl中，混匀，冰浴放置30分钟，42℃热休克90秒，加5倍体积LB于37℃恢复培养1小时，之后取适当体积涂平板，于37℃倒置培养12小时。挑取单克隆入20mL LB中37℃培养过夜，第二天按1∶20的比例转接入200mL新鲜LB中继续培养至OD600吸收介于0.6-0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM，继续在30℃培养4小时。4,000rpm离心收集菌体。
实施例3 内皮生长抑制蛋白的纯化利用QIAGEN公司的Ni-NTA亲和柱纯化内皮生长抑制蛋白。首先将收集的菌体重悬浮于裂解缓冲液(50mM NaH2PO4，PH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)。冰浴超声10秒，重复20次，每次间隔30秒。13000rpm，4℃离心15分钟，将上清液上样于Ni-NTA柱(QIAGEN)，分别用50mM NaH2PO4(pH8.0)，300mM NaCl，10mM咪唑；50mM NaH2PO4(pH8.0)，300mM NaCl，20mM咪唑；50mM NaH2PO4(pH8.0)，300mM NaCl，40mM咪唑和50mM NaH2PO4(pH8.0)，300mM NaCl，250mM咪唑的缓冲液作梯度洗脱，收集各组分。使用15％的SDS-PAGE电泳分析各组分。结果如图3所示泳道2为诱导前全菌蛋白；泳道3为诱导后全菌蛋白，可以清楚地看到重组蛋白的含量很多；泳道4为胞内的可溶蛋白组分，可见大部分重组蛋白以可溶形式存在；泳道5，6，7为10mM、20mM、40mM咪唑缓冲液洗脱峰，含有一些杂蛋白；泳道8为250mM咪唑缓冲液的洗脱峰，内皮生长抑制蛋白占主要部分，纯度高于99％，从泳道1的蛋白分子量标准可以看到重组蛋白分子量大小在19KD左右，与理论推测一致。
实施例4 真核表达载体的构建和转染我们利用PCR方法将内皮生长抑制蛋白的基因与人纤溶酶原信号肽序列连接，然后克隆入pCDNA3(Invitrogen公司产品)载体。使用的引物序列如下引物S55’CGGGA TCCAT GGAAC ATAAG GAA 3’BamH I引物S35’AGATA CTCTC CCTGA AACAG TCCTT GACCT GA 3’内皮生长抑制蛋白5’序列引物V35’GCGAA TTCTT ACATG GGATA CAATA AATAT C 3’EcoR I首先利用TaKaRa公司的PCR试剂盒及引物S5和S3，以纤溶酶原信号肽序列为模板扩增出信号肽基因片段。PCR的反应条件是94℃反应30秒，50℃反应30秒，最后在72℃延伸10秒，共重复30个循环后，于72℃下反应5分钟以完成PCR扩增。低熔点胶回收。将回收后的信号肽片段与内皮抑素类似蛋白基因按摩尔比1∶1混匀，在不含引物的PCR体系中94℃变性30秒，37℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，然后加入引物S5和V3，进行PCR反应，反应条件是94℃反应30秒，50℃反应30秒，最后在72℃延伸30秒，共重复30个循环后，于72℃下反应5分钟以完成PCR扩增。PCR产物经EcoRI和BamHI酶切后，用低熔点胶回收并与经同样处理的pCDNA3(Invitrogen公司产品)在T4连接酶(华美公司公司产品)作用下进行连接，转化DH5α菌株，筛选到阳性克隆，经测序证明序列完全正确，命名为pCDNAVIII。
将Bel7404细胞按5×105接种于六孔板，37℃，5％CO2培养24小时，培养基为DMEM，10％FCS。分别将pCDNAVIII和pCDNA3转染进Bel7404细胞，pCDNA3转染株作为对照。转染实验利用Gibco BRL公司的Lipofectin Reagent试剂，按操作说明书进行实验，48小时后加入G418至0.6μg/ml筛选，挑取阳性克隆扩增培养。
实施例5 真核细胞表达的鉴定利用RT-PCR方法检测内皮抑制蛋白是否转录。在扩增后的细胞中加入1毫升Trizol试剂，按试剂盒说明书操作抽提总RNA，溶解在DEPC处理的去离子水中，-70℃保存。使用Gibco BRL公司的Superscript H-反转录酶，以引物Oligo dT作为反转录引物，按说明书操作，进行反转录。反转录产物于-20℃保存。
利用引物S5和V3进行PCR反应，同时将G3PDH基因(一种持家基因)进行扩增作为对照。结果如图4A所示泳道1和2显示pCDNAVIII与pCDNA3转染株细胞均扩增出G3PDH基因，泳道3显示pCDNA3转染株没有扩增出内皮生长抑制蛋白基因，泳道4显示pCDNAVIII转染株扩增出内皮生长抑制蛋白基因。
利用Weatern-blot方法检测内皮生长抑制蛋白是否在Bel7404细胞中表达并从细胞中分泌出来。将转染后的Bel7404细胞扩增后在无血清DMEM中培养48小时，取出上清液，加入TCA至终浓度为20％，于12,000rpm离心15分钟。将沉淀用上样缓冲液溶解后进行15％SDS-PAGE电泳。然后将蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，分别用一抗和二抗与之反应。最后利用ECL(上海普飞生物技术有限公司)显色。结果如图4B所示，1为pCDNAVIII转染株培养上清，其中有内皮生长抑制蛋白的表达，分子量约为17kDa左右。2为pCDNA3转染株培养上清，没有内皮生长抑制蛋白的表达。
实施例6 重组人内皮生长抑制蛋白的活性测定将牛主动脉内皮细胞(BAEC)培养于DMEM，10％FBS中。按3000个细胞/孔接种于96孔板中，待2-3小时细胞贴壁后，换成含2％FBS的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养24小时。然后加入含待测浓度重组人内皮生长抑制蛋白的DMEM，2％FBS 100μl，bFGF 5ng/ml，37℃，5％CO2培养3天。每孔加入10μlMTT(10mg/ml)，37℃，4小时，吸去180μl培基，加入100μl DMSO，振荡溶解后测定A570nm。结果表明重组人内皮生长抑制蛋白可以抑制bFGF刺激的BAEC的增殖。ED50约为0.6μg/mL(图5)。已知人内皮抑素的ED50约为0.5-0.6μg/mL，因此，重组人内皮生长抑制蛋白的抑制活性与人内皮抑素的活性基本相同。
实施例7 重组人内皮生长抑制蛋白诱导内皮细胞凋亡的作用将牛主动脉内皮细胞(BAEC)培养于含10％FBS的DMEM中。按2.5×105个细胞/培养皿接种于60mm培养皿中，待2-3小时细胞贴壁后，换成含2％FBS的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养24小时。然后加入5μg/ml重组人内皮生长抑制蛋白的含2％FBS DMEM 100μl，bFGF 5ng/ml，37℃，5％CO2培养24小时。用0.5％胰酶消化后，1,000rpm离心3分钟，将沉淀重悬于200μl结合缓冲液，加入1μl Annexin V-FITC(Clontech公司产品)(终浓度为0.5μg/ml)避光室温放置10分钟，再加入10μl PI，然后用流式细胞仪检测。从图6可以看出，加药后24小时内皮细胞凋亡数目明显增加，说明重组人内皮生长抑制蛋白可以诱导内皮细胞发生凋亡。
权利要求
1.重组人内皮生长抑制蛋白，其氨基酸序列如下QGEYLPDMGLGIDGVKPPHATGAKKGKNGGPAYEMPAFTAELTAPFPPVGGPVKFNKLLYNGRQNYNPQTGIFTCEVPGVYYFAYHVHCKGGNVWVALFKNNEPVMYTYDEYKKGFLDQASGSAVLLLRPGDRVFLQMPSEQAAGLYAGQYVHSSFSGYLLYPM。
2.权利要求1所述重组人内皮生长抑制蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)用RT-PCR方法获得目的基因；(2)在DNA连接酶作用下与载体质粒连接，得到重组质粒；(3)用重组质粒转化宿主细胞并在宿主细胞中进行表达；(4)表达产物的纯化。
3.如权利要求2所述的重组人内皮生长抑制蛋白制备方法，其中目的基因为如下序列的人胶原蛋白VIII(α1)的NC1区的基因5′-CAGGGAGAGTATCTGCCAGATATGGGGCTGGGAATTGATGGCGTGAAACCCCCCCATGCTACGGGGGCTAAGAAAGGCAAGAATGGAGGGCCAGCCTATGAGATGCCTGCATTTACCGCCGAGCTAACCGCACCCTTTCCACCGGTGGGGGGCCCAGTGAAGTTTAACAAACTGCTGTATAACGGCAGACAGAACTACAACCCGCAGACAGGCATCTTCACCTGTGAGGTCCCTGGTGTCTACTACTTTGCATACCACGTTCACTGCAAGGGGGGGAACGTGTGGGTTGCTCTATTCAAGAACAACGAGCCCGTGATGTACACGTACGACGAGTACAAAAAGGGCTTCCTGGACCAGGCATCTGGGAGTGCAGTGCTGCTGCTCAGGCCCGGAGACCGGGTGTTCCTCCAGATGCCCTCAGAACAGGCTGCAGGACTGTATGCCGGGCAGTATGTCCACTCCTCCTTTTCAGGATATTTATTGTATCCCATGTAA 3’。
4.如权利要求2所述的重组人内皮生长抑制蛋白制备方法，其中载体质粒为pET24a。
5.如权利要求4所述的重组人内皮生长抑制蛋白制备方法，其中宿主细胞为原核生物细胞。
6.如权利要求5所述的重组人内皮生长抑制蛋白制备方法，其中宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.如权利要求2所述的重组人内皮生长抑制蛋白制备方法，其中载体质粒为pCDNA3。
8.如权利要求7所述的重组人内皮生长抑制蛋白制备方法，其中宿主细胞为真核细胞。
9.如权利要求8所述的重组人内皮生长抑制蛋白制备方法，其中宿主细胞为真核细胞Be17404。
全文摘要
本发明提供一种用基因工程方法从人胶原蛋白VIII(α1)的羧端非胶原蛋白区得到的具有抑制内皮细胞生长活性的蛋白质片段。这种重组人内皮生长抑制蛋白能抑制碱性成纤维生长因子刺激的牛主动脉内皮细胞的增殖。它的抑制活性与内皮抑素(endistatin)活性大致相同,具有潜在药用价值。
文档编号C12N15/09GK1386753SQ0111296
公开日2002年12月25日 申请日期2001年5月23日 优先权日2001年5月23日
发明者甘人宝, 徐韧, 辛利, 李载平 申请人:中国科学院上海生物化学研究所