专利名称：一种kai1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
一种KAM基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应
用
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒及 其检测方法和应用
背景技术：
2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告， “认为人类在抗癌大战中是失败”，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战 失败的几个因素是1、肿瘤细胞异质性；2、肿瘤细胞耐药性；3、抗癌药物设计思路不完善 等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本发明人在研究中发现，导致 癌症死亡率不降的另二个重要原因是1、不能做到真正的早期诊断；2、转移的病理机制不 清楚。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性 癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一临床概念值得认 真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度， 1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿 瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可 能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和 单独的病灶。临床上已证实一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他 部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此， 在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶 时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时已经是晚期了，这是导致癌症死亡率 不降的真正原因。KAIl基因位于染色体llpll. 2，编码由267个氨基酸组成的KAIl蛋白(⑶82)， KAI1/CD82蛋白为细胞膜糖蛋白，属于TM4SF成员，它对肿瘤转移的抑制作用可能源于其对 细胞运动、转移和增生的影响，也与调节细胞的黏着有关。KAI 1蛋白和其他TM4SF分子可 与整联蛋白形成复合体，从而调节整联蛋白的黏着功能，并影响蛋白的介导的细胞转移。现 已证实，KAIl基因和肝癌的侵袭转移呈负相关，KAIlmRNA的表达下降可增加肝癌的侵袭转 移潜能，无肝内转移的肝细胞癌中KAIl表达明显高于有肝内转移的病例，Adadci等研究发 现KAIl阳性肝癌患者的生存率明显高于KAIl阴性者。同时有人认为KAIl基因的高表达 可能是某些低转移潜能肺癌的特征，KAIl表达可作为评估非小细胞肺癌患者预后的指标。 Hisashiyama等同样认为KAIl/⑶82在非小细胞肺癌中的表达是判断其预后的一个指标， 他们把患者分为KAI 1表达阳性、减少、阴性3组，3年生存率分别为86%，56%和66%， 后两组与表达阳性组比较有显著差异。在其他多种肿瘤如前列腺癌、卵巢癌、乳癌、食道癌 中同样发现KAIl基因下调可以作为侵袭转移和不良预后的标志。KAIl基因，NM_002231, 1715bp, mRNA. llpll. 2"，cds249··· 1052bp。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆 时)就能做到早期预测诊断。本发明采用核酸原位杂交技术检测KAIl基因，对癌细胞早期 转移、复发及诊疗后的病理演变过程判定有重要的临床意义。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种KAIl基因的原位杂交检测试 剂盒的用途。本发明的再一的目的是，提供一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒。本发明的另一的目的是，提供一种KAIl基因的原位杂交检测方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物 中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的癌症是肝癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌或食道癌。所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。所述的非放射性标记物优选自地高辛。所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交 探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种KAIl基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括仪器操作1).将待测标本放入反应槽中；2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；3).仪器自动弃去液体，自动后固定；
4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C )；5).仪器自动弃去液体，自动清洗；6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C )；7).仪器自动弃去液体，自动清洗；8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；10).取出封片镜检。本发明优点在于1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。3、本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有 显著不同。本发明可以在基因水平上检测KAIl基因异常表达，在影像医学检查未发现占位 性癌病灶复发之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基 因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早预 测。这样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌 症恶疾。
图1是本发明实施例中肝癌转移病人KAIl基因表达图片。图2是本发明实施例中非小细胞肺癌转移病人KAIl基因表达图片。图3是本发明实施例中前列腺癌转移病人KAIl基因表达图片。图4是本发明实施例中卵巢癌转移病人KAIl基因表达图片。图5是本发明实施例中乳腺癌转移病人KAIl基因表达图片。图6是本发明实施例中食道癌转移病人KAIl基因表达图片。图7是本发明实施例中正常人KAIl基因表达图片。
具体实施方式下面结合附图对本发明具体实施方式
作详细说明。实施例1一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所 述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和 标本组成如下消化液100 μ 1/管1管/i^ 无色透明液体保护液 100 μ 1/管1管/盒 无色透明液体预杂交液 1300 μ 1/ 管2 管/盒 无色透明液体正义杂交液 10μ 1/管1管/盒 无色透明液体反义杂交液 10μ 1/管1管/盒 无色透明液体封闭液 1000 μ 1/ 管:1 管/盒 无色透明液体碱性磷酸酶抗体1μl/管1管/盒 无色透明液体
9、固定液多聚甲醛40g加IX缓冲液I至11，稍加热(约50_60度)搅拌至溶 解；10、显色剂 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、显色剂 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。实施例2一种KAIl基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用一、标本处理1、用IOml的离心管，装4. 5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋 巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液=1 1.5)的离心管中，2000r/min离心IOmin ；2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的IX缓冲液I，混 勻，1500g/min 离心 IOmin ；3、弃上清·沉淀加入约两倍的1 X缓冲液I，混勻，1500g/min离心IOmin ；4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX缓冲液I洗5min。每缸 可以放16片；6、标本可保存在_20°C，或继续做实验。二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度1、将IOX缓冲液I用三蒸水按1 10稀释成IX缓冲液I ；2、将20X缓冲液II用三蒸水按1 10稀释成2X缓冲液II;按1 100稀释成0. 2X缓冲液II ；按1 200稀释成0. IX缓冲液II ；3、将IOX缓冲液III用三蒸水按1 10稀释成1 X缓冲液III ；4、10X缓冲液IV用三蒸水按1 10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、实验步骤1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次 实验做一对阳性对照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX缓冲液199.9ml，即为使用浓 度)20ml。37°C水浴预热10分钟。放进16张玻片，37°C处理12min，再用1 X缓冲液I洗 5min ；3、用0. 2%的保护液(保护液Iml加IX缓冲液I99ml即为使用浓度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在 42°C恒温水浴箱中3h以上；5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张 加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ；
7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内在42°C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 1 X缓冲液II洗两次，每次15min ；8、用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、将玻片放入保湿盒内，加0.5% 1封闭液(Iml封闭液加5ml IX缓冲液 III) IOOul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min ；10、取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1 X缓冲液III) IOOul/ 片，盖紧保湿盒在室温下作用30min ；12、取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min;13、IX缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73. 3ul，显色剂B157. 5ul加到30ml 1 X缓冲液IV中，混勻)，室温避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX缓冲液I混勻)封片镜检。四、结果判断在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。阳性对照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克 服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探 针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察 mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的KAI1 基因表达量，用来确定癌症是否发生和/或转移。临床研究表明，KAIl基因具有广谱性，因为KAIl基因在正常人中高表达。如果 KAIl基因表达低或零表达，说明癌症已经复发、转移、扩散，从而获得癌症的诊断信息。当检 测到KAIl基因的表达低于正常对照时，则可预测受试者为癌症早期转移或癌症转移易感 者，这些癌症包括肝癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌或食道癌。本发明实施例采样为肝癌转移病人5名，非小细胞肺癌转移病人5名，前列腺癌 转移病人5名，卵巢癌转移病人5名，乳腺癌转移病人5名，食道癌转移病人5名，正常对照 组5名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症 转移病人KAIl基因不表达，细胞无染色；正常对照组KAIl基因有过度表达，细胞染色。具 体结果请见图1，图2，图3，图4，图5，图6和图7。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技术(上海)有限公司<120> 一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用0144]<130>/0145]<160>10146]<170>PatentIn version3. 30147]<210>10148]<211>17150149]<212>DNA0150]<213> 智人(Homo sapiens)0151]<400>10152]ggcctgccgagtccgcggcgttccccggctgcagccggga gggggccgaggagtgactga600153]gccccgggctgtgcagtccgacgccgactgaggcacgagc gggtgacgctgggcctgcag1200154]cgcggagcagaaagcagaacccgcagagtcctccctgctg ctgtgtggacgacacgtggg1800155]cacaggcagaagtgggccctgtgaccagctgcactggttt cgtggaaggaagctccagga2400156]ctggcgggatgggctcagcctgtatcaaagtcaccaaata ctttctcttcctcttcaact3000157]tgatcttctttatcctgggcgcagtgatcctgggcttcgg ggtgtggatcctggccgaca3600158]agagcagtttcatctctgtcctgcaaacctcctccagctc gcttaggatgggggcctatg4200159]tcttcatcggcgtgggggcagtcactatgctcatgggctt cctgggctgcatcggcgccg4800160]tcaacgaggtccgctgcctgctggggctgtactttgcttt cctgctcctgatcctcattg5400161]cccaggtgacggccggggccctcttctacttcaacatggg caagctgaagcaggagatgg6000162]gcggcatcgtgactgagctcattcgagactacaacagcag tcgcgaggacagcctgcagg6600163]atgcctgggactacgtgcaggctcaggtgaagtgctgcgg ctgggtcagcttctacaact7200164]ggacagacaacgctgagctcatgaatcgccctgaggtcac ctacccctgttcctgcgaag7800165]tcaagggggaagaggacaacagcctttctgtgaggaaggg cttctgcgaggcccccggca8400166]acaggacccagagtggcaaccaccctgaggactggcctgt gtaccaggagggctgcatgg9000167]agaaggtgcaggcgtggctgcaggagaacctgggcatcat cctcggcgtgggcgtgggtg9600168]tggccatcatcgagctcctg gggatggtcc tgtccatctg cttgtgccgg cacgtccatt10200169]ccgaagactacagcaaggtccccaagtactgaggcagctgctatccccat ctccctgcct10800170]ggcccccaacctcagggctcccaggggtctccctggctccctcctccagg cctgcctccc11400171]acttcactgcgaagaccctcttgcccatcctgactgaaagtagggggctt tctggggcct12000172]agcgatctctcctggcctatccgctgccagccttgagccctggctgttct gtggttcctc12600173]tgctcaccgcccatcagggttctcttagcaactcagagaaaaatgctccc cacagcgtcc13200174]ctggcgcaggtgggctggacttctacctgccctcaagggtgtgtatattg tataggggca13800175]actgtatgaaaaattgggga ggagggggccgggcgcggtggctcacgcct gtaatcccag14400176]cactttgggaggccgaggcgggtggatcacgaggtcaggagatcgagacc atcctggcta15000177]acatggtgaaaccccgtctcC 3.3.3.3.3.3.3.3.tttagccggg cgcggtggcg15600178]ggcacctgtagtcccagcta cttgggaggctgaggcaggagaatggtgtg aacccgggag16200179]cggaggttgcagtgagctga gatcgtgctactgcactccagcctggggga cagaaagaga16800180]ctccgtctcaSLSLSLSLSLSLSLSLSLSL3.SLSLSLSL171权利要求
一种KAI1基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的癌症是肝癌、非小细胞肺癌、前列 腺癌、卵巢癌、乳腺癌或食道癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或 非放射性标记物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P 中的一种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高 辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高辛。
8.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于所述的试剂盒还包括增效剂，所述 的增效剂是碱性磷酸酶抗体。
9.一种KAIl基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的 杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
10.一种KAIl基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a、将权利要求9所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于a步骤中形成杂交复合体的条件 为核酸杂交的温度为42°C;核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本 或组织细胞标本。
全文摘要
本发明涉及一种KAI1基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种KAI1基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
文档编号C12Q1/68GK101993912SQ200910056148
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月10日 优先权日2009年8月10日 公开号200910056148.发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司