专利名称：采用植物细胞工程生产葛根素的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产葛根素的方法，具体地讲，是指建立在葛属植物离体培养无性繁殖的基础上，采用植物细胞悬浮培养生产葛根素的方法。
背景技术：
植物细胞工程是以植物细胞、组织或器官悬浮培养为基础，以获得特定产物为目的，将生物学与工程学相结合的现代化高新技术。利用植物细胞工程生产细胞次生代谢产物是植物细胞工程研究最多、应用最广的领域。
野葛(Pueraria lobata(Willd.)OhWi)，属于蝶形花科(Papilionaceae)葛属(Pueraria)多年生草质藤本植物，是我国及其它东亚国家传统的药食两用资源。其块根(俗称葛根，Puerariae radix)有效成分是以葛根素为主的异黄酮类化合物，具有解表去热，生津、止泻、健脾、提高肌体免疫力等功效，主治表症发热、无汗口渴、头痛颈强、麻疹不透、泄泻、高血压、冠心病等症，亦可抑制肿瘤，广泛应用于临床医疗和保健，市场需求较大(曾明等，葛属植物根的异黄酮类成分分析，第二军医大学学报，1998年第2期)。据统计，2000年全国医药用药中，葛根素消耗量占第34位，销售额占17.3％以上。但是也出现了许多问题(1)临床上使用的葛根素等野葛药物全部来源于野生葛属植物，由于城市的扩展和野葛资源的大肆采掘，野葛资源日渐短缺，远远不足以满足人们日益增长的需求；(2)民间广泛种植粉葛(Pueraria thomosonii Benth.，野葛的栽培变种)，其淀粉含量高，但其药效成分葛根素含量低于野葛，无法满足相应的需要。
利用植物细胞悬浮培养生产次生代谢产物的前提条件是要有分散性良好的植物细胞或很小的细胞团为材料进行离体培养，一般经过三个阶段(1)诱导离体器官形成愈伤组织；(2)愈伤组织继代培养；(3)愈伤细胞的悬浮培养。
在国内已有步骤(1)——诱导葛属离体器官形成愈伤组织的报道(如于树宏、李玲，野葛的组织培养和植株再生，植物资源与环境，1999年第1期；施和平、潘瑞炽，三裂叶野葛离体培养和植株再生，植物生理学通讯，1998年第6期)。一般步骤是取成熟的种子进行表面消毒，置于培养基上或湿润滤纸上暗萌发数天获得无菌苗；或以健康植株的叶片或茎段为外植体，先后采用75％乙醇和0.1～0.2％升汞进行表面消毒各30秒和5～15分钟(加入表面活性剂数滴)。取无菌苗的叶或经消毒的外植体切成长0.3～1厘米，放在MS或B5固体培养基中(培养基中应加入0.2～2mg/L的生长素类)，其培养条件为温度(25±2)℃，暗或弱光，10～20天愈伤组织发生。
经上述步骤形成的愈伤组织，在细胞团长到10mm大小时，可以转移到丛芽培养基上，形成丛状不定芽，然后促进单芽抽枝长叶至试管苗形成。
关于步骤(2)——野葛愈伤组织的继代培养，目前也已有报道(李玲、刘慧丽等，三裂叶野葛愈伤组织形成和异黄酮类的产生，高技术通讯，2001年第5期)，其具体步骤是以B5培养基为基本培养基，加入0.1～1mg/L的生长素类和100～400mg/L水解酪蛋白，愈伤组织置于培养基上，弱光条件下继续培养5-8天，愈伤组织的颗粒不断扩大。
但目前尚未见关于野葛愈伤细胞悬浮培养——步骤(3)的报道。由于植物材料的特异性，其它植物所用的方法并不能适用于野葛愈伤细胞的悬浮培养。如采用银杏或云南红豆杉愈伤细胞悬浮培养的方法(于荣敏等，银杏细胞悬浮培养及其银杏内酯产生，生物工程学报，1999年第2期；甘烦元等，云南红豆杉细胞的悬浮培养，植物生理学报，1997年1期)来进行野葛悬浮细胞培养，其效果甚差，表现为在极短的时间内细胞聚集成团，发生褐变，容易死亡，或融化死亡，根本不能进行扩大培养。
(三)发明的内容本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种采用植物细胞工程生产葛根素的方法，通过该方法生产葛根素具有周期短、产量高、质量好的优点。
本发明方法是在现有技术的基础上研制出适用于野葛愈伤细胞悬浮培养的方法，即步骤(3)，并对现有的步骤(1)和(2)进行改进。具体的讲，本发明方法包括如下步骤(1)诱导离体器官形成愈伤组织取成熟的种子进行表面消毒，置于湿润滤纸上暗萌发3～5天获得无菌苗，或以健康植株的叶片或茎段为外植体，先用75％乙醇表面消毒30秒，再用0.1～0.2％升汞表面消毒5～15分钟(加入表面活性剂数滴)；取无菌苗的叶或经表面消毒的外植体切成小段，放在如下配方的固体培养基中培养10～20天MS或B5、0.5～2mg/L生长素、0.5～2mg/L细胞分裂素，其培养条件为温度(25±2)℃、暗或弱光。
(2)愈伤组织的继代培养将步骤(1)中产生的愈伤组织移入如下配方的继代培养基中进行继代培养MS或B5、0.5～2mg/L生长素、0.1～1mg/L嘌呤类细胞分裂素、100～400mg/L水解酪蛋白，培养条件同步骤(1)，培养时间为5～8天，期间更换新鲜培养基1～3次，结果愈伤组织的颗粒不断扩大和疏松。
(3)愈伤细胞的悬浮培养配制如下配方的新液体培养基MS或B5、0.5～2mg/L生长素、0.1～1mg/L嘌呤类细胞分裂素、1000-5000mg/L水解酪蛋白或100～500mg/L脱乙酰几丁质或0.5～2.0mg/L茉莉酸甲酯；将配制的新鲜培养基与步骤(2)用过的同样成份的液体培养基按体积比2比1混合(即新培养基2体积份，旧培养基1体积份)，取30～200ml混合后的培养基，从经过继代培养的愈伤组织中挑选出结构疏松、生长迅速的淡黄色愈伤组织，按照每45ml接种1～3g愈伤组织量接种培养，培养条件为(25±2)℃，在光强5.34μmol·m-·2s-1下全天光照，摇床110±5r/min，培养3～9天可以获得产量高、质量好的葛根素。
在上述方法中，步骤(1)中生长素的含量最好是1mg/L，细胞分裂素的含量最好是1mg/L；步骤(2)中生长素的含量最好是1mg/L。
本发明步骤(1)中，种子的表面消毒方法为本领域通用的方法，无菌苗的叶或经表面消毒的外植体通常切成长0.3～1厘米，所用的生长素可采用吲哚类生长素、萘类生长素或苯类生长素，吲哚类生长素可选用吲哚乙酸(简称IAA)、吲哚丁酸(简称IBA)等；萘类生长素可选用萘乙酸(简称NAA)等；苯类生长素可选用2，4-二氯苯氧乙酸(简称2，4-D)、2，4，5-三氯苯氧乙酸(简称2，4，5-T)等。其中，效果最好的是采用萘乙酸或2，4，5-三氯苯氧乙酸。所述的细胞分裂素可采用2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(简称CPPU)、(4-吡喃)-1，1-嘌呤氨基-9-氢吡喃基-9H嘌呤-4-氢吡喃基(简称TDZ)、6-苄基腺嘌呤(简称6-BA)和激动素(简称KT)等，最好是采用激动素(简称KT)。在步骤(2)和(3)中，所述的生长素可采用萘类生长素萘乙酸，或苯类生长素2，4-二氯苯氧乙酸、2，4，5-三氯苯氧乙酸等；所述的嘌呤类细胞分裂素类可采用激动素(简称KT)或6-苄基腺嘌呤等。
本发明方法所用的各种药物均为本领域常用的药物，可以通过购买获得。
本发明具有如下的优点和效果1、本发明与现有技术比较，其愈伤组织发生提早2-3天，而且获得的愈伤组织生长良好，保持疏松，能够较好满足悬浮培养的要求，通过本发明能够获得产量高、质量好的葛根素。
2、由于本发明是采用植物细胞工程的技术生产天然成分的葛根素，其过程受人工控制，不受地理、气候、病虫害等环境因素的影响，有效成分变化小，产量稳定，生产周期短。
(四)具体的实施方式下面结合具体的实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式并不局限于以下所列实施例1(1)诱导离体器官形成愈伤组织取成熟的种子进行表面消毒，置于湿润滤纸上暗萌发5天获得无菌苗，取无菌苗的叶切成长0.3厘米，放在如下配方的固体培养基中培养10天MS+0.5mg/L NAA+1.0mg/L6-BA，其培养条件为温度(25±2)℃、暗或弱光。
(2)愈伤组织的继代培养将步骤(1)中产生的愈伤组织移入如下配方的继代培养基中进行继代培养B5+1.0mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+100mg/L水解酪蛋白，培养条件同步骤(1)，培养时间为8天，期间更换新鲜培养基3次，结果愈伤组织的颗粒不断扩大和疏松。
(3)愈伤细胞的悬浮培养配制如下配方的新液体培养基B5+1.0mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+5000mg/L水解酪蛋白；将配制的新鲜培养基与步骤(2)用过的同样成份的液体培养基按体积比2比1混合，取30～200ml混合后的培养基，从经过继代培养的愈伤组织中挑选出结构疏松、生长迅速的淡黄色愈伤组织，按照每45ml接种2g愈伤组织量接种培养，培养条件为(25±2)℃，在光强5.34μmol·m-·2s-1下全天光照，摇床110±5r/min，培养9天获得所需的葛根素。
实施例2其它同实施例1，步骤(1)中种子暗萌发的时间为3天，无菌苗的叶被切成1.0厘米段，培养基配方为B5+2.0mg/L IAA+0.5mg/LCPPU；步骤(2)中培养基采用MS+2.0mg/L2，4-D+0.1mg/L KT+200mg/L水解酪蛋白，培养时间为5天，期间更换新鲜培养基2次；步骤(3)中新配制的培养基采用MS+2.0mg/L2，4-D+0.1mg/L KT+1000mg/L水解酪蛋白，取30ml混合后的培养基，愈伤组织接种密度为每45ml接种1.5g，培养时间为5天。结果获得所需的葛根素。
实施例3其它同实施例1，步骤(1)中以健康植株的茎段为外植体，采用75％乙醇表面消毒30秒，再用0.1％升汞表面消毒5分钟(加入表面活性剂数滴)，培养基配方为B5+1.0mg/L2，4-D+1.0mg/L TDZ，培养时间为15天；步骤(2)中培养基采用MS+0.5mg/L2，4，5-T+0.5mg/L KT+400mg/L水解酪蛋白，培养时间为5天，期间更换新鲜培养基1次；步骤(3)中新配制的培养基为MS+0.5mg/L2，4，5-T+0.5mg/L KT+100mg/L脱乙酰几丁质，取100ml混合后的培养基，愈伤组织接种密度为每45ml接种3g，培养时间为3天。结果获得所需的葛根素。
实施例4其它同实施例3，步骤(1)中以健康植株的叶片为外植体，采用75％乙醇表面消毒30秒，0.2％升汞表面消毒15分钟(加入表面活性剂数滴)，培养基配方为B5+1.0mg/L2，4，5-T+2.0mg/L KT；步骤(3)中新配制的培养基为MS+0.5mg/L2，4，5-T+0.5mg/L KT，在培养的第3天加入500mg/L脱乙酰几丁质。结果获得所需的葛根素。
实施例5其它同实施例4，步骤(3)中新配制的培养基为MS+0.5mg/L2，4，5-T+0.5mg/L KT，在培养的第3天加入0.5mg/L茉莉酸甲酯。结果获得所需的葛根素。
实施例6其它同实施例5，步骤(3)中加入的茉莉酸甲酯用量为0.5mg/L。结果获得所需的葛根素。
根据对实施例1到6的统计，培养细胞的生物量在第8天达到12.6mg/L，细胞产率为72.3％，产生的葛根素平均含量为104mg/L。
权利要求
1.一种采用植物细胞工程生产葛根素的方法，其特征在于包括如下步骤(1)诱导离体器官形成愈伤组织取成熟的种子进行表面消毒，置于湿润滤纸上暗萌发3～5天获得无菌苗，或以健康植株的叶片或茎段为外植体，先用75％乙醇表面消毒30秒，再用0.1～0.2％升汞表面消毒5～15分钟；取无菌苗的叶或经表面消毒的外植体切成小段，放在如下配方的固体培养基中培养10～20天MS或B5、0.5～2mg/L生长素、0.5～2mg/L细胞分裂素，培养条件为温度(25±2)℃、暗或弱光；(2)愈伤组织的继代培养将步骤(1)中产生的愈伤组织移入如下配方的继代培养基中进行继代培养MS或B5、0.5～2mg/L生长素、0.1～1mg/L嘌呤类细胞分裂素、100～400mg/L水解酪蛋白，培养条件同步骤(1)，培养时间为5～8天，期间更换新鲜培养基1～3次；(3)愈伤细胞的悬浮培养配制如下配方的新液体培养基MS或B5、0.5～2mg/L生长素、0.1～1mg/L嘌呤类细胞分裂素、1000～5000mg/L水解酪蛋白或100～500mg/L脱乙酰几丁质或0.5～2.0mg/L茉莉酸甲酯；将配制的新鲜培养基与步骤(2)用过的同样成份的液体培养基按体积比2比1混合，取生长良好的愈伤组织，按照1～3g/45ml的密度接种于混合培养基中培养，培养条件为(25±2)℃，在光强5.34μmol·m-·2s-1下全天光照，摇床110±5r/min，培养3～9天，获得所需的葛根素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中生长素的含量为1mg/L，细胞分裂素的含量为1mg/L；步骤(2)中生长素的含量为1mg/L。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的生长素采用IAA、IBA、NAA、2，4-D或2，4，5-T，所述的细胞分裂素采用CPPU、TDZ、6-BA或KT；步骤(2)和(3)中，所述的生长素采用NAA、2，4-D或2，4，5-T，所述的嘌呤类细胞分裂素类采用KT或6-BA。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的生长素采用NAA或2，4，5-T，所述的细胞分裂素采用KT。
全文摘要
采用植物细胞工程生产葛根素的方法，包括如下步骤(1)诱导离体器官形成愈伤组织；(2)愈伤组织继代培养；(3)愈伤细胞的悬浮培养。每一步骤都采用特制的培养基。通过本发明方法生产葛根素具有周期短、产量高、质量好的优点。
文档编号C12N5/04GK1403572SQ0213497
公开日2003年3月19日 申请日期2002年10月17日 优先权日2002年10月17日
发明者李玲, 张春荣, 刘慧丽 申请人:华南师范大学