专利名称：工程菌株及其制备方法以及用其制备紫杉醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物菌株。
背景技术：
目前，现有用于产生紫杉醇菌株其紫杉醇产量都比较低，难以进行大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫杉醇产量高的工程菌株，并提供一种工程菌株的制备方法，以及用工程菌株制备紫杉醇的方法。技术方案本工程菌株，分类命名为树状多节孢(Nodulisporium sylviforme)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M202049。
一种制备前述工程菌株的方法，将原始菌株经紫外线诱变、甲基磺酸乙酯诱变、60钴诱变、亚硝基胍诱变后得到高产突变株，将高产突变株制备成菌丝体，酶解菌丝体制备原生质体，其中酶液用3％溶壁酶、2％蜗牛酶、1％溶菌酶组成的复合酶系，原生质体经纯化后得到原生质体悬液；原生质体悬液经纯化后，采用两种方法诱变，一种是紫外线诱变，一种是紫外线加氯化锂诱变，将紫外线诱变得到的突变株悬液进行紫外线灭活，30cm、30W紫外照射，照射85秒，将紫外线加氯化锂诱变得到的突变株悬液进行热灭活，悬液置于54度超级恒温水浴器中保温5分钟；将前面得到的两种灭活原生质体悬液融合、再生后筛选得到工程菌株。
一种用工程菌株制备紫杉醇的方法，其特征在于将工程菌株转接到固体PDA培养基上活化培养，将活化后的融合子转接到液体PDA培养基中，将种子培养液转入通用式机械搅拌罐在改良的s-7培养液中进行发酵，其中改良的S-7培养基是指在S-7培养基的基础上添加苯丙氨酸1.0mg/L、酪氨酸1.5mg/L，亚油酸1.5mg/L，将发酵液经化学萃取纯化后得到紫杉醇。
有益效果经本发明提取出的紫杉醇含量可达450μg/L以上，紫杉醇含量与现有菌株获得的紫杉醇含量相比有大幅度的提高，并且本发明的工程菌株稳定性好，工程菌株连续传代10次后，进行3批次发酵试验，该菌株紫杉醇产生能力仍能保持稳定，平均产量达到450μg/L以上。本发明所涉及的育种方法是采用物理与化学复合诱变及细胞工程的系列复合选育法，以利高速选育出紫杉醇的高产工程菌株。
本发明所涉及的工程菌株HDF-68已于2002年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为树状多节孢(Nodulisporium sylviforme)，保藏号为CCTCC NO.M202049。培养与保藏条件用PDA培养基，25-28℃培养2-3天，在4℃保藏或制成冷干菌种在-20℃冷藏，或制成孢子沙土管4℃保藏。
具体实施例方式本发明的工程菌株是由以下方法制备的。
1、原始菌株的获得，原始菌株可以直接由国外购买，本发明利用东北红豆杉分离得到原始菌株。东北红豆杉标本采自黑龙江省东宁林区和穆棱林区等地48棵树龄在百年以上的老树，按不同生态区域、不同方位、不同性别、不同部位及不同粗细的树干的树皮、韧皮部和小枝等分别取样。制备好的标本经表面消毒，分别栽种于马丁氏、查氏、PDA等固体培养基平皿上，25℃恒温培养，分离纯化获得单菌落。获得的单菌落扩大培养后采用改良的S-7液体培养基振荡培养，改良的S-7培养基是指在S-7培养基的基础上添加苯丙氨酸1.0mg/L、酪氨酸1.5mg/L，亚油酸1.5mg/L，14天后分析发酵产物中的成分。经薄层层析(TLC)与高效液相色谱(HPLC)法分析，证明其中3株内生真菌(HQD33、HQD48和HQD54)可产紫杉醇。优化发酵条件后，发酵液中紫杉醇的含量达到51.06-125.70μg/L。菌株HQD33在固体平板上生长较快，尤其在PDA培养基上菌落致密，呈茸状，全缘，初期菌落白色，后期呈深灰褐色，背面黑色。菌丝部分内生，部分表生，有隔，多分支，菌丝深褐色向顶逐渐变浅褐色到接近无色，直径为2.58～6.45μm。末见到菌核产生。分生孢子梗单生，多数呈树状分枝，褐色向顶变淡，明显有疣，长35～157μm。产孢细胞柱状，单生或轮状排列，6.25～22.50μm×2.65um～3.75μm，合轴式产孢，顶端略微膨大或不膨大，具有小的齿突。分生孢子单生，椭圆形或拟卵形，平滑或具小疣，无隔膜，5.16～7.74μm×2.58～3.35μm，分生孢子在产孢细胞的产孢点位置呈头状排列。菌株HQD33在各种培养基上培养后，未发现有性阶段。鉴定为树状多节孢，系我国的新记录菌属，是世界上首次发现该菌株可产紫杉醇。菌株HQD33选用为原始菌株。
2、高产菌株的复合诱变选育原始菌株依次经过以下诱变，得到高产突变株，培养基为PDA培养基。
紫外线诱变 孢子浓度为106个/ml，紫外灯的强度为15W，照射距离为25cm，照射时间5min。
甲基磺酸乙酯诱变 甲基磺酸乙酯用磷酸缓冲液溶解，pH为7.0-7.4，甲基磺酸乙酯处理液最终浓度达到0.1mol/L，作用时间为5min。
60钴辐照诱变 诱变剂量为800Gy，诱变时间为24h。
亚硝基胍诱变 亚硝基胍用pH6.0的磷酸缓冲液配制，处理液浓度为1mg/ml，处理时间为20min。
经过如上有序的物理、化学超诱变剂(包括原子能辐照在内)的诱变处理，而后经生长势、菌落、菌丝、孢子形态等初筛，发酵液中提取物的TLC复筛、HPLC及UV光谱分析终筛，最后筛选获得的高产诱变株，其紫杉醇产量达314.07μg/L，较原菌株的产量提高了178.7％。
3、原生质体的制备a、培养基配制(1)麦芽汁培养基；(2)查氏培养基；(3)酵母膏培养基；(4)PDA培养基；(5)CM培养基配方与配制方法参见《微生物学实验》(沈萍等，1999)。
(6)再生固体培养基培养基中加入相应的渗透压稳定剂。
(7)再生半固体培养基将再生固体培养基中的琼脂浓度降至5-6g/L即可。
b、酶液的配制蜗牛酶(Snailase)；溶菌酶(Lysozyme)；溶壁酶(Lywallzyme)。
3％溶壁酶+2％蜗牛酶+1％溶菌酶组成的复合酶系，以每300mg湿菌体加入1ml酶液的量精确称取所需的酶，用渗透压稳定剂溶解后，3000r/min低温离心15min，取上清液过滤除菌后使用。
c、渗透压稳定剂0.7mol/L NaCld、制备菌丝体将斜面上的菌种转接到装量为50ml液体培养基，容积为250ml的三角烧瓶中，采用静止培养，温度23-25℃。3天后按2％接种量，转接至装量为200ml液体培养基，容积为500ml的三角烧瓶中，静止培养3天。3000r/min，离心10min收集菌丝体。将收集的菌丝体打散，并用渗透压稳定剂洗涤，称量备用。
e、酶解菌丝体制备原生质体酶解前分别用0.2％0.5％的巯基乙醇(0.1mol/L pH6.0的磷酸缓冲溶液配制)处理菌丝体30min然后酶解。用3％溶壁酶+2％蜗牛酶+1％溶菌酶组成的复合酶系进行酶解，30℃恒温酶解7h。用该法制备原生质体，300mg湿菌体可获得2.00×107-5.80×107个原生质体。
f、原生质体的纯化将酶解液用无菌3层镜头纸过滤，滤液在3000r/min条件下离心10min，除去上清液，用渗透压稳定剂洗涤2次，然后在渗透压稳定剂中悬浮，得到纯化的原生质体悬液。
g、原生质体的再生用液体再生培养基将原生质体悬液进行10倍系列稀释，采用双层平板培养法吸取0.5ml原生质体系列稀释液于装有4.5ml高渗半固体培养基的试管中混匀，然后倾注于相应的固体高渗再生平板上，23-25℃培养3-5天。
另外，取纯化后的原生质体悬浮于未加渗透压稳定剂的液体再生培养基中处理30min，然后在未加渗透压稳定剂的固体培养基中涂布培养，作为对照，计算原生质体的再生频率。
我们的研究结果表明，用含有0.7mol/L NaCl的PDA再生培养基以双层平板法培养，原生质体再生频率可达72％。
4、原生质体诱变育种按上述方法制备原生质体悬液，进行纯化后，采用两种方法诱变(1)紫外线诱变紫外灯功率为30W，照射距离25cm，照射时间50s；(2)紫外线加氯化锂诱变紫外照射4 0s，然后培养基中加入0.6％LiCl。诱变后的原生质体用PDA高渗再生培养基进行双层平板避光培养。方法(1)获得高产突变株UV40-19，方法(2)获得高产突变株UL50-6。其紫杉醇产量提高至380-390μg/L以上。比诱变前的出发菌株有明显的提高。
5、原生质体融合育种原生质体灭活1热灭活将纯化后的UL50-6原生质体悬液置于54℃超级恒温水浴器中保温5min。
2紫外线灭活将纯化后的UV40-19原生质体悬液用30cm、30W紫外照射，照射85s。
原生质体融合的方法取浓度为107个/ml的双亲灭活原生质体悬液各0.7ml混合，3000r/min离心10min，收集原生质体，将此原生质体悬浮于0.2ml的0.7mol/L氯化钠中，加入1.8ml 30℃预热过的35％的PEG6000，同时，融合体系中Ca2+与Gly的浓度分别维持在0.01mol/L和0.05mol/L，置于超级恒温水浴保温30℃融合20min后加入6ml 0.7mol/L NaCl溶液终止融合。经0.7mol/L氯化钠洗涤后将悬浮液做适当稀释，倾注于高渗半固体和固体双层培养基平板中进行正置培养，28℃培养120小时。融合率可达6.92％。
原生质体灭活后再生将灭活后的原生质体悬液倾注于高渗半固体和固体双层培养基平板中进行双层培养，28℃培养72-120小时。
6、工程菌株的筛选大量挑取融合再生平板上长出的单菌落(数百株融合子)，初筛后得到的菌株经发酵培养，其提取物通过薄层层析复筛，复筛后获得的菌株提取物上高效液相色谱分析，结果表明，融合株HDF-68的紫杉醇产量较双亲株又有明显提高，平均达到451.20μg/L。
工程菌株制备紫杉醇的方法培养基PDA培养基、改良S-7培养基。
菌株的活化培养将工程菌株转接到固体PDA培养基上，28℃培养3天。活化2-3次。
种子培养将活化培养后的融合子转接到液体PDA培养基中，28℃振荡培养3天。
发酵以3％摇瓶接种量将种子培养液转接入改良S-7培养基中，28℃振荡培养16-18天，每隔3天定性和半定量测定紫杉醇含量。
发酵罐采用通用式机械搅拌发酵罐，此种发酵罐符合工程菌株的生物学特性，能够有效提高紫杉醇产量，并且在市场容易购买。
紫杉醇的提取方法发酵液过滤，滤渣烘干(低于50℃)，滤液称量体积。滤渣用适量乙酸乙酯萃取，滤液用1/2滤液体积的乙酸乙酯萃取(30min)，下层水层再用乙酸乙酯萃取一次，合并乙酸乙酯，减压蒸馏。用适量甲醇洗涤减压蒸馏得到的固体，再用正己烷洗涤15min，收集下层甲醇，加入乙酸乙酯和水(v∶v＝1∶1)，进行萃取(30min)，将收集的乙酸乙酯进行减压蒸馏，用一定量的乙腈洗下固体，0℃密封保存。
紫杉醇定量方法 用薄层层析定性和半定量测定紫杉醇含量，用高效液相色谱定量测定紫杉醇含量。
薄层层析分析(TLC)将各诱变株的提取液点于10-40μm粒度的硅胶层析板上，进行层析。使用氯仿-甲醇(7∶1，v/v)作为展层剂。层析后立即用含有1％香草醛的浓硫酸溶液喷雾，观察紫杉醇特征性蓝点颜色并计算迁移率，用Sigma公司制造的紫杉醇标准品作为对照。
高效液相色谱分析Waters高效液相色谱系统，二极管阵列检测器，色谱株为C18柱，200mm×4.6mm，柱温为室温，流动相为甲醇-水混合物(60∶40，v/v)，波长228nm，流速1.0ml/min，注射体积10μl。
发酵液经粗提取后用薄层层析定性和半定量测定紫杉醇含量，结果表明，内生真菌树状多节孢融合子可以采用通用式机械搅拌发酵罐来生产紫杉醇。薄层层析结果表明，发酵16d-18d紫杉醇产量基本达到最大值。发酵液经萃取分离，高压液相色谱定量测定，紫杉醇浓度稳定在400μg/L以上。
权利要求
1.一种工程菌株，分类命名为树状多节孢(Nodulisporium sylviforme)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M202049。
2.一种制备权利要求1工程菌株的方法，将原始菌株经紫外线诱变、甲基磺酸乙酯诱变、60钴诱变、亚硝基胍诱变后得到高产突变株，将高产突变株制备成菌丝体，酶解菌丝体制备原生质体，其中酶液用3％溶壁酶、2％蜗牛酶、1％溶菌酶组成的复合酶系，原生质体经纯化后得到原生质体悬液；原生质体悬液经纯化后，采用两种方法诱变，一种是紫外线诱变，一种是紫外线加氯化锂诱变，将紫外线诱变得到的突变株悬液进行紫外线灭活，30cm、30W紫外照射，照射85秒，将紫外线加氯化锂诱变得到的突变株悬液进行热灭活，悬液置于54℃超级恒温水浴器中保温5分钟；将前面得到的两种灭活原生质体悬液融合、再生后筛选得到工程菌株。
3.一种用权利要求1工程菌株制备紫杉醇的方法，其特征在于将工程菌株转接到固体PDA培养基上活化培养，将活化后的融合子转接到液体PDA培养基中，将种子培养液转入通用式机械搅拌罐在改良的s-7培养液中进行发酵，其中改良的S-7培养基是指在S-7培养基的基础上添加苯丙氨酸1.0mg/L、酪氨酸1.5mg/L，亚油酸1.5mg/L，将发酵液经化学萃取纯化后得到紫杉醇。
4.一种用权利要求工程菌株及其选育的衍生株生产紫杉醇的途径。
全文摘要
本发明涉及一种微生物菌株，用该菌株生产的紫杉醇产量高。技术方案工程菌株的分类命名为树状多节孢(Nodulisporium sylviforme)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M202049，该菌株系从东北红豆杉中自行分离的内生真菌，采用复合的常规与生物工程手段选育。工程菌株转接到固体PDA培养基上活化培养，将活化后的融合子转接到液体PDA培养基中，将种子培养基转入通用式机械搅拌罐在改良的S－7培养液中进行发酵，将发酵液经化学萃取纯化后得到紫杉醇。
文档编号C12P17/02GK1511943SQ0215887
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月30日 优先权日2002年12月30日
发明者周东坡, 平文祥 申请人:黑龙江大学