专利名称：用辅助复性的方法制备重组瑞替普酶的制作方法
技术领域：
本发明属医药领域中的重组蛋白质药物制备技术。
组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的39KD重组异构体瑞替普酶(简称r-PA)是t-PA的一种分子改造衍生物。它包含有野生型t-PA的Kringle2结构域和蛋白酶结构域，不含糖基化位点。r-PA具有t-PA的溶血栓活性，但半衰期延长，并且出血副作用小，比t-PA具有使用方便安全经济的优势，是取代t-PA的理想溶血栓药物。
因为r-PA不含糖基化位点，可以用大肠杆菌来表达。我们构建了高效表达r-PA的工程菌以表达r-PA。由于r-PA含有十对二硫键，用细菌表达的r-PA形成包含体形式，溶解变性后用常规方法复性很难正确折叠和复性成活性形式。这是由于组成十对二硫键的20个半胱氨酸在复性错误配对造成的。为了提高变性r-PA的复性率，我们发明了用二硫键异构酶(PDI)促进复性的生产工艺，我们在r-PA的复性体系中加入重组人二硫键异构酶(rhPDI)，使错误的二硫键打开重新形成正确的二硫键，从而提高复性率，最终提高r-PA的产率，降低成本，并可应用于工业化生产。
本发明原理是二硫键异构酶PDI可以特异性地作用于蛋白分子中错配的二硫键，打开该错配的二硫键，并促进其形成正确配对的二硫键，完成分子结构重排，形成正确活性形式，达到复性的目的。
本发明的目的使用二硫键异构酶催化变性的r-PA形成正确配对的二硫键，从而复性成正确的有活性的分子构型。这样可提高r-PA的复性率，降低异构体比例，简化后续纯化步骤，由此提高r-PA的产率，降低生产成本。
技术方案r-PA的工程菌菌种活化→高效表达r-PA→菌体离心收获→菌体破碎→包含体离心分离→高浓度盐酸胍按一定比例变性溶解→在复性体系中按一定比例加入重组人PDI以催化r-PA的复性→Sephardex G-25脱盐→Lys-Sepharose 4B亲和层析→CM-Sepharose阳离子交换层析→Sephadex G-25脱盐。经上述步骤即可制备得到纯度大于95％，比活性高于6×105IU/mg的r-PA。
最佳实施例r-PA复性体系如下50mM Tris，pH7～10，氧化型谷胱甘肽10～1mM，还原型谷胱甘肽1～0.1mM，r-PA蛋白浓度0.01～1mg/ml。在此复性体系中加入重组人二硫键异构酶PDI，使r-PA与PDI的摩尔比为100∶1～10∶1。在加入PDI的复性体系中进行复性，r-PA的复性率比不加PDI时有显著提高，二硫键错配造成的异构体比例大大降低，r-PA的终产率也相应提高。
r-PA的制备方法如下r-PA工程菌37℃活化12～16h，接于大肠杆菌发酵培养基中，37℃，150rpm振荡培养12～16h，菌体密度O.D600达0.5～1.0。按0.5～1.0％比例将细菌转接于新鲜培养液中，恒温37℃培养80～90分钟，当菌体密度至OD600≈0.5～0.8时，加入0.5～1mMol/l的IPTG诱导表达r-PA，诱导时间3～6h。将诱导后的发酵液在4℃条件下，5000～8000×g离心10～15min，弃上清，沉淀即为表达后的r-PA工程菌菌体。将菌体按1∶10～1∶20的比例充分悬浮于50mM Tris，pH8.0的缓冲液中，在400w的功率下超声200～300秒，菌体破碎。超声后于4℃，10000～12000×g的条件下离心30min，所得沉淀即为r-PA包含体。包含体用6～8M盐酸胍，50mMTris，100～150mM DTT变性液，经过充分匀质后，搅拌30～60分钟。于室温18～25℃条件下充分溶解4～8h。10000～12000×g，15℃条件下离心30分钟，取上清，即为变性的r-PA。
将变性的r-PA缓慢滴加到不断搅拌的复性体系中，使得r-PA终浓度0.1mg/ml，室温18-25℃过夜(12～14h)。将上述复性液用5KD膜超滤浓缩换盐后，用Lys-Sepharose亲和层析柱纯化(以50mMPB，pH8.0的缓冲液为平衡缓冲液，用含0.2M赖氨酸，0.5～1.0MNacl的平衡缓冲液为洗脱液)，收集紫外A280吸收峰。用Sephadex G-25脱盐后，再经过CM-Sepharose柱层析(平衡缓冲20mMPB，pH6.0，0～1.0M Nacl线性梯度洗脱)，最佳洗脱浓度是0.2～0.3M NaCl，收集紫外A280吸收峰。用Sephadex G-25脱盐后，得到纯度＞95％，比活性＞6×105IU/mg的r-PA。
本发明的优点本发明提供了一种用PDI辅助变性r-PA折叠复性以制备r-PA的新型工艺方法。它与国外传统的生产工艺相比具有以下特点①复性率高。②复性体系中r-PA蛋白浓度提高，复性体积减少，操作方便，节省试剂。③异构体比例低，简化了后续纯化步骤。④提高r-PA产率，降低生产成本。上述优势使本发明具有明显的技术创新性与工艺先进性，成本降低，更适合于工业化生产r-PA。
权利要求
1.用辅助复性方法制备组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体瑞替普酶(r-PA)。其特征在于在变性r-PA的复性体系中加入二硫键异构酶，以提高r-PA的复性率。
2.组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体瑞替普酶(r-PA)的制备工艺，其特征在于经过工程菌表达→菌体破碎→包含体分离→变性→PDI催化复性→脱盐→亲和层析→阳离子交换层析等步骤完成。
3.如权利要求2所述的瑞替普酶(r-PA)的变性，其特征在于用盐酸胍作为变性剂，变性体系含6M盐酸胍，20～100mM Tris，10～100mMDTT，PH7～10。
4.如权利要求2所述的PDI催化的瑞替普酶(r-PA)的复性，其特征在于复性体系采用50mM Tris，pH7～10，氧化型谷胱甘肽10～1mM，还原型谷胱甘肽1～0.1mM，r-PA蛋白浓度0.01～1mg/ml，加入的PDI为重组人PDI或其它来源的PDI，r-PA与PDI的摩尔比为100∶1～10∶1。
5.如权利要求2所述的阳离子交换层析，其特征在于采用CM-Sepharose阳离子交换柱，洗脱条件是0～1M NaCl，PH7～10，最佳洗脱浓度是0.2～0.3M NaCl。
全文摘要
本发明公开了一种用二硫键异构酶PDI辅助变性的组织型纤溶酶原激活剂39KD重组异构体瑞替普酶(r－PA)正确折叠并提高其复性率的新型方法。在优化的r－PA复性体系中加入一定比例的PDI，可以使r－PA中错误配对的二硫键打开并形成正确的二硫键，从而提高复性率，降低异构体比例，简化后续纯化工艺，提高r－PA产率。
文档编号C12N9/68GK1654643SQ200410023470
公开日2005年8月17日 申请日期2004年2月11日 优先权日2004年2月11日
发明者王革 申请人:王革