专利名称：含npt－ii标记基因转基因水稻的快速检测方法
1.发明领域本发明涉及快速检测含NPT-II选择标记基因的转基因水稻的一种方法，此种方法中使用了一种特殊的抗生素，其检测临界浓度能使转基因水稻中的非转化植株叶片黄化死亡而转化植株因含有外源基因能抵抗抗生素的伤害而存活；或者使转基因水稻种子和幼胚中的非转化种子或幼胚芽白化死亡，而转化种子或幼胚因含有外源基因能抵抗抗生素的伤害而正常生长发育。公开的检测方法抗生素临界浓度有益于水稻基因工程研究者和水稻育种工作者。
2.背景技术在水稻基因工程中，为了把转化体筛选出来，最直接的方法是根据转化质粒或目的基因直接对个体进行分子检测，一般有PCR检测或分子杂交。但分子检测速度慢，耗资大，随着转基因水稻后代群体的扩大，分子检测方法受到了一定的限制，因此，探索一种快速、简单、准确检测转基因水稻的方法是很有必要的。
在水稻遗传转化中，一般在表达载体中构建一个以上的选择标记基因，通过相对应的选择试剂对转基因水稻进行筛选，未转化的细胞不能正常生长发育，而携带选择标记基因(携带转化质粒)的转化细胞因对选择试剂产生抗性而不受其影响，能正常生长、发育和分化，从而把转化体选择出来。这样得到的转化植株既携带目的基因，同时也携带有选择基因。
新霉素磷酸转移酶基因一NPT-II基因是最早引入水稻研究的，也是在植物转基因研究中应用最为广泛的选择标记基因之一。它来源于细菌转座子Tn5上的aphA2。该基因编码氨基糖苷-3′-磷酸转移酶(aminnoglycoside-3′-phosphotransferase II)，又称Npt-II(neomycinphosphotransferase II)，该酶通过酶促磷酸化使某些氨基糖苷类抗生素如卡那霉素、新霉素、G418等磷酸化而失活。此类抗生素对植物细胞表现毒性的机理是与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，影响70S起始复合体生成，干扰叶绿体及线粒体的蛋白质生物合成，最终导致植物细胞死亡。Npt-II使ATP分子上的γ-磷酸基转移到抗生素分子上，影响抗生素与核糖体亚基的结合，从而使抗生素失活。使用Npt-II基因转化植物，可以使植物细胞产生对上述抗生素的抗性。
由于不同作物对不同抗生素的敏感程度不一样，且同一作物不同外植体对某一抗生素敏感程度不同，因此在基因工程中对转化植株进行检测所采用的抗生素浓度也有差异。
3.发明内容本发明的一个目的在于提供一种快速检测含NPT-II转基因水稻的方法，通过G418溶液或含G418的培养基可实现该目的。
本发明的另一个目的在于实现对转基因水稻整个生育期的检测。通过不同浓度的G418溶液或含G418的培养基可实现对转基因水稻后代的叶片、种子、幼苗和幼胚的快速检测。
4.本发明详细说明本发明提供在转基因水稻整个生育期各个阶段的检测，在对转基因水稻进行检测前，首先应该确定抗生素筛选的临界浓度，其浓度一方面可以杀死转基因水稻中的非转化植株，另一方面又能保证转基因水稻中转化株的正常生长。
用于实施本发明的抗生素是G418，其检测试剂包括检测叶片和种子的溶液和检测幼胚和幼苗的培养基，检测方法是以转基因水稻和其对应的转化受体为材料，对G418设定一系列的浓度梯度，确定检测转基因水稻的最佳临界浓度。
根据本发明中通过检测叶片来检测转基因水稻，将G418浓度设为0，40，60，80，100，150，200mg/l七个不同的处理浓度，每处理随机分别取含NPT-II转基因水稻材料(以下用R表示)和其转化受体对照材料(以下用CK表示)大田生长分蘖期同一部位绿色健康叶片3片，每片叶剪成2cm左右长的叶段三段(两端均留有剪刀口)放入装有G418溶液的培养皿中，每皿中放的3个叶段均来源于为同一叶片。将叶片置于室内室温下(光强约为10000μmol.m-2·s-1，光照时间约为12h·d-1，温度约为25℃)，定期观察其变化情况。
水稻叶段用不同浓度的G418处理后，CK的叶段均出现不同程度的褐化、黄化，并且随着G418浓度和处理时间的增加，叶段褐化或黄化程度加重。处理4天后，60mg/l以上G418处理的CK叶面全部变黄，80mg/l时整个叶面黄化；到200mg/l时，叶段已枯黄，而R在各个处理浓度叶面基本上没有出现黄化。使用60mg/l以上浓度G418时，R与CK叶段耐G418的能力开始出现明显差异，故把70-90mg/l的G418作为检测转基因水稻叶片的最适浓度(处理结果见表1)。
根据本发明中通过检测种子来检测转基因水稻，G418浓度分别设置0，150，200，250，300，350mg/l五个不同处理，每处理分别取R和CK各20粒种子，设3次重复，浸种培养至破胸时，分放在装有不同浓度G418溶液的培养皿中，培养皿底覆盖有两层滤纸。将种子置于光照培养箱内(光强约为10000μmol.m-2·s-1，光照时间约为12h·d-1，温度约为29℃)，定期观察其发芽情况，7天后统计发芽率和白化死亡率。
处理后的CK种子发芽率随G418浓度的增加而降低，相应芽的白化死亡率随G418浓度的增加而升高；但R种子的发芽率和芽的白化死亡率在各个处理浓度基本不受G418的影响。在G418为0mg/l和100mg/l时，CK的发芽率和白化死亡率都没有受到影响。到150mg/l以上时，其发芽率开始出现下降，部分发出的芽开始出现白化死亡。对于CK种子的白化死亡率，G418浓度在300mg/l以上各处理与300mg/l以下各处理呈显著差异，浓度为350mg/l时，白化死亡率达到100％。故把280-320mg/l的G418作为检测转基因水稻种子的最适浓度(处理结果见表2)。
根据本发明中通过检测幼胚来检测转基因水稻，以R和CK开花授粉后12～15天的幼胚为材料，G418浓度分别设置0，100，150，200，250mg/l五个不同处理，每处理分别取转基因水稻R和CK各20颗幼胚，重复3次。用0.1％升汞灭菌12分钟后用无菌水冲洗3～5次，然后接种于1/2MS+0.5mg/l 6-BA+1.5％蔗糖培养基上，4天后，在无菌条件下将开始萌发幼胚接种于加有G418的相同培养基上。将幼胚置于光照培养室内(光强约为10000μmol·m-2·s-1，光照时间约为12h·d-1，温度约为25℃)，定期观察其发芽情况，10天后统计发芽率和白化死亡率。
利用不同浓度的G418对水稻幼胚进行敏感性检测。结果表明R发芽率基本上不受G418浓度的影响，只是当浓度达到300mg/l时，有个别幼胚出现白化死亡。而CK则随着G418浓度的增加，幼胚发芽率渐渐下降，相应的白化死亡率也逐步上升，到200mg/l以上时，白化死亡率达到了85％以上，且200mg/l以上各处理与200mg/l以下各处理呈显著差异。因此本试验中取180-220mg/l的G418作为筛选转基因水稻幼胚的临界浓度(处理结果见表3)。
根据本发明中通过检测幼苗来检测转基因水稻，G418浓度分别设置0，100，150，200，250mg/l五个不同处理，取R和CK成熟胚在1/2MS+0.5mg/l 6-BA+1.5％蔗糖培养基上培养成幼苗(约4叶期)，每处理分别取R和CK各60棵幼苗，在无菌条件下将幼苗接种于加有G418的相同培养基上。将幼苗置于光照培养室内(光强约为10000μmol·m-2·s-1，光照时间约为12h·d-1，温度约为25℃)，定期观察其生长变化情况。
在G418浓度分别为0和100mg/l时，培养不同天数CK幼苗生长发育正常；G418浓度为150mg/l和200mg/l时，CK在4天后叶尖开始卷曲，8天后叶片开始变黄，12天后整株黄化；当G418浓度为250mg/l时，到第12天幼苗整株枯死。而不同G418浓度处理的R在整个培养过程中均没有明显变化。第12天，在G418浓度为150mg/1时，R和CK之间表现出明显差异，因此把130-170mg/l的G418作为筛选转基因水稻幼苗的最适浓度(处理结果见表4)。5本发明的分子检测验证根据以上发明方法，取G418筛选阳性叶片对应的植株60株(对R和CK各占60株的混合群体进行叶片筛选)、G418筛选发芽种子后的存活苗65株(对R和CK种子各60粒混合后进行筛选)、幼胚发芽筛选后的存活苗67株(对R和CK幼胚各60颗混合后进行筛选)和幼苗筛选后的62株(对R和CK幼苗各60株混合后进行筛选)分别提取DNA，根据NPT-II基因的核苷酸序列设计引物进行PCR扩增。结果表明大部分G418筛选阳性株扩增出了与NPT-II基因序列长度完全一致DNA特征带。
在验证叶片检测方法中，通过对60株成株所提DNA进行PCR检测，发现阳性株为60，跟80mg/l G418条件下的检测结果完全一致。在验证种子筛选方法中，发现PCR呈阳性的种子有60粒，占整个存活种子的92.31％，适合大批量种子的快速检测。在验证幼胚筛选方法中，发现PCR呈阳性的幼胚有60颗，占整个存活幼胚的89.55％，在验证幼苗筛选方法中，发现PCR呈阳性株幼苗也有60株，占整个存活幼苗的96.77％，适合室内组培苗的快速检测(检测结果见表5)。
本发明的优越性操作简便、快速、费用低、省时省力、准确性高。
6.实施范例范例一该抗生素对转基因水稻叶片的筛选以R为父本，明恢63(MH63)、9311、培矮64s(PA64s)、288、E32为母本，杂交后获得F1代，再以MH63、9311、PA64s、288和E32为轮回亲本，与F1代回交获得BC1F1代，应用本研究建立的标记基因叶片快速检测技术，以70～90mg/l浓度的G418对BC1F1群体中个体的叶片进行筛选，同时同一群体的各个个体提DNA进行PCR检测，效果非常明显。到第4天，G418筛选的部分叶片保持正常绿色，而部分叶片黄化死亡。经PCR检测验证，G418筛选的正确率达99.32％，因此G418筛选后保持正常绿色的基本上为转基因阳性株(检测结果见表6)。
范例二该抗生素对转基因水稻种子的筛选以转基因水稻R为父本，明恢63(MH63)、9311、培矮64s(PA64s)、288、E32为母本，杂交后获得F1代，再以MH63、9311、PA64s、288和E32为轮回亲本，经两次回交获得BC2F1代种子，应用本研究建立的标记基因种子快速检测技术以280～320mg/l浓度的G418对BC2F1种子进行筛选，同时取存活苗提DNA进行PCR检测，效果非常明显。7天后，部分种子发出的芽能正常地分化出幼苗，而部分种子发出的芽白化死亡，经PCR验证，G418筛选的正确率达94.68％。因此G418筛选后的存活苗基本上为转基因阳性株(检测结果见表7)。
范例三该抗生素对转基因水稻幼胚的筛选将转基因水稻R(父本)分别与明恢63(MH63)和9311(母本)杂交后获得F1代，以MH63和9311为轮回亲本再经三次回交获得BC3F1幼胚；将转基因水稻R(父本)分别与E32、288(母本)杂交后获得F1代，以E32、288为轮回亲本再经二次回交获得BC2F1幼胚。应用本研究建立的标记基因幼胚快速检测技术以180～220mg/l浓度的G418对BC3F1和BC2F1群体的幼胚进行筛选，同时取存活苗提DNA进行PCR检测，效果非常明显。10天后，部分幼胚发出的芽能正常地分化出幼苗，而部分幼胚发出的芽白化死亡。经PCR验证，G418筛选的正确率达93.30％。因此G418筛选后的存活苗基本上为转基因阳性株(检测结果见表8)。
范例四该抗生素对转基因水稻幼苗的筛选将转基因水稻R(父本)分别与明恢63(MH63)和9311(母本)杂交后获得F1代，再经三次回交获得BC3F1种子；将转基因水稻R(父本)分别与E32、288(母本)杂交后获得F1代，再经二次回交获得BC2F1种子。应用本研究建立的标记基因幼苗快速检测技术以130-170mg/l浓度的G418对BC3F1和BC2F1群体的幼苗进行抗性鉴定，同时取存活苗提DNA进行PCR检测，效果非常明显。12天后，部分幼苗能正常生长，而部分幼苗黄化死亡。经PCR验证，G418筛选的正确率达96.36％。因此G418筛选后的存活苗基本上为转基因阳性株(检测结果见表9)。
表1水稻叶片对G418敏感性的测定结果
注“-”无变化；“+”切口处褐化；“++”叶面浅黄；“+++”整个叶面黄化；“++++”叶段枯死表2水稻种子对G418敏感性的测定结果
同一性状不同处理下有相同字母表示无显著性差异，字母完全不同表示有显著性差异(P＜0.01)。
表3水稻幼胚对G418敏感性的测定结果
同一性状不同处理下有相同字母表示无显著性差异，字母完全不同表示有显著性差异(P＜0.01)表4水稻幼苗对G418敏感性的测定结果
注“-”无变化；“+”叶尖开始卷曲；“++”叶面开始变黄；“+++”整株黄化；“++++”整株枯死表5 R和CK的PCR检测结果
表6 G418和PCR检测BC1F1叶片结果
表7 G418和PCR检测BC2F1种子结果
表8 G418和PCR检测BC2F1和BC3F1幼胚结果
表9 G418和PCR检测BC2F1和BC3F1幼苗结果
权利要求
1.一种快速检测含NPT-II标记基因转基因水稻的方法，此方法是使用一种抗生素，这种抗生素可以提供在转基因水稻整个生育期各个阶段的检测，其特征在于在对转基因水稻进行检测前，首先应该确定该抗生素检测的临界浓度，其浓度一方面可以杀死转基因水稻中的非转化植株，另一方面又能保证转基因水稻中转化株的正常生长。此种方法包括对转基因水稻叶片、种子、幼胚和幼苗的检测。
2.权利要求1所述的方法中包括一种抗生素G418的溶液或培养基。
3.权利要求2所述的溶液中只含有抗生素G418。
4.权利要求2所述的培养基为MS培养基。
5.权利要求4中的MS培养基含有抗生素G418、0.5mg/l 6-BA和1.5％蔗糖。
6.根据权利要求1和3所述的快速检测转基因水稻叶片，其特征在于叶片为成株离体叶片，检测试剂是临界浓度为70-90mg/l的G418溶液。
7.根据权利要求1和3所述的快速检测转基因水稻种子，其特征在于种子为刚破胸的活种子，检测试剂是临界浓度为280-320mg/l的G418溶液。
8.根据权利要求1和4所述的快速检测转基因水稻幼胚，其特征在于幼胚为刚萌发的无菌幼胚，检测培养基中含有临界浓度为180-220mg/l的G418。
9.根据权利要求1和4所述的快速检测转基因水稻幼苗，其特征在于幼苗为三叶或三叶以上的无菌苗，检测培养基中含有临界浓度为130-170mg/l的G418。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测含NPT－II标记基因转基因水稻的方法，此方法能实现转基因水稻在整个生育期各个阶段的快速检测，此方法包括一种抗生素溶液或含这种抗生素的培养基，此抗生素为G418。水稻不同外植体对G418的敏感性不同，因此检测的浓度有差异。本发明确定了通过G418溶液或含G418的培养基检测转基因水稻的临界浓度，其浓度一方面可以杀死转基因水稻中的非转化植株，另一方面又能保证转基因水稻中转化株的正常生长。本发明的优越性在于操作简便、快速、费用低、省时省力、准确性高。
文档编号C12Q1/68GK1706965SQ20041002329
公开日2005年12月14日 申请日期2004年6月10日 优先权日2004年6月10日
发明者易自力, 王紫萱, 蒋建雄, 覃静萍, 张昊, 谭炎宁 申请人:易自力, 王紫萱, 蒋建雄