专利名称：用β－葡萄糖苷酶和膜技术生产大豆异黄酮苷元的方法
技术领域：
本发明涉及由大豆异黄酮生产大豆异黄酮苷元的方法。更具体地，本发明涉及采用酶水解和用超滤(UF)或透析的膜技术分离纯化的方法由大豆异黄酮生产大豆异黄酮苷元的方法。该方法是一种适于产业化生产大豆异黄酮苷元的实用技术。
背景技术：
目前发现有500多种植物中含有异黄酮类化合物，多集中在豆科蝶状花亚科的植物中，大豆之中异黄酮含量比较丰富。异黄酮类化合物存在于各种豆科植物，特别是大豆之中。大豆中的异黄酮分为游离型的苷元(Aglycon)和结合型的糖苷(Glycosides)两类，苷元占总量的2％-3％，包括大豆苷元(Daidzein)、染料木素(Genistein)、大豆黄素(Glycitein)。糖苷占总量的97％-98％，主要含有大豆苷(Daidzin)、染料木苷(Genistin)、和大豆黄苷(Glycitin)(参见家森幸男等.大豆イソフラボン[M]幸书房等)。大豆异黄酮是一种植物雌激素，可促进激素和生长因子的分泌，具有改善妇女绝经期综合症、预防骨质疏松的活性。异黄酮的糖苷也具有医用价值，但最具医用价值的是没有与糖结合的苷元。
近年来人们认识到植物蛋白如大豆中所含的大豆异黄酮可以抑制人体癌细胞如乳腺癌细胞和前列腺癌细胞的生长(例如可参见Peterson等人，Biochemical and Biophysical Research，Communications，Vol.，No.1，p661-667，1991；和Peterson等人，The Prostate，Vol.22，p335-345，1993等)。因此，大豆异黄酮成为重要的医药中间体和保健食品添加剂。
现有技术已有将异黄酮苷转化成异黄酮苷元的方法。例如可采用酸碱水解的方法(需人生主编，天然物化学，科学出版社，1996，p603-604)。
蛋白质技术国际公司的中国专利ZL97120435.7公开了使用酶水解制备异黄酮苷元的方法。该专利使用可裂解1，4-糖苷键的酶制备异黄酮苷元，所述裂解1，4-糖苷键的酶来源于黑曲霉、米曲霉、乳克鲁维氏酵母和脆壁克鲁维氏酵母，优选的酶是α-半乳糖酶、β-半乳糖酶、葡糖淀粉酶和果胶酶。
金凤燮申请的中国专利申请号CN03133637.X公开了用微生物发酵的方法水解大豆异黄酮苷糖，以制备大豆异黄酮苷元。其中所使用的微生物包括细菌、霉菌、酵母菌和担子菌，在其实施例中使用的微生物包括高温好氧菌酶Clostridium thermocopriea、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、假丝酵母和大肥菇菌(Agaricusbitorguis)，酶解产物用乙醇沉淀或正丁醇萃取进行分离，即可得到大豆异黄酮苷元。该方法的转化率为50-80％。
与已有技术相比，本发明的方法可以使用不同纯度的原料，易于操作，酶水解效率高，且选用了超滤或透析的膜分离技术，因此转化率高(＞90％)，产品纯度高(＞95％)。另外，在进行超滤或透析处理时得到的截留液是酶蛋白，其主要成分是β-葡萄糖苷酶(Lactasephlorizin hydralase，简称为LPH)，可以循环使用，从而可减少酶的用量，提高酶的利用率，降低了生产成本。因此，本发明的方法更适合于工业化生产发明内容本发明的目的是提供一种适合于工业化生产的，以高产率和高纯度生产大豆异黄酮苷元的方法。
进一步地，本发明的目的是提供一种利用酶水解生产大豆异黄酮苷元的方法。
更进一步地，本发明的目的是提供一种利用酶法进行水解，并利用超滤或透析等膜技术进行酶水解液的后处理，从而以高产率和高纯度生产大豆异黄酮苷元的方法。
具体的，本发明的方法是以大豆异黄酮粉为基本原料，用培养霉菌释放的胞外酶β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮，并利用超滤或透析等膜技术处理酶水解液，得到大豆异黄酮苷元。
更具体地，本发明的方法是以不同纯度的大豆异黄酮粉为水解(发酵)底物；用黑曲霉Aspergillus niger van Tighem和米曲霉Aspergillusoryzae Cohn进行液态和固态发酵，以大豆蛋白或大豆异黄酮作为菌种培养的诱导剂，制备得到的β-葡萄糖苷酶；以此酶为水解酶，对大豆异黄酮粉进行酶水解；得到的发酵液用超滤或透析等膜技术处理。以高转化率得到高纯度的大豆异黄酮苷元。
更具体地，本发明生产大豆异黄酮苷元的方法包括以下步骤1.用液态发酵法或固态发酵法提取和精制β-葡萄糖苷酶；2.酶水解大豆异黄酮粉以20～90％，优选40-80％纯度的大豆异黄酮为底物，加入由上述步骤1获得的β-葡萄糖苷酶，所述酶与底物之比为1500～5000U/g，水解温度为40～60℃，pH值为5.5～8.0，搅拌速度为60～120rpm，大豆异黄酮水解率＞90％。
3.过滤酶水解液，得到酶水解液的滤过液；4.将所述滤过液用超滤膜或渗透析装置进行纯化，所得透过液经过离心分离，浓缩沉淀物，然后进行喷雾干燥，或在干燥后进行超微粉碎，得到大豆异黄酮苷元粉。
其中上述过滤和纯化工艺包括(1)精过滤酶水解液用PP线绕过滤系统或聚丙烯中空纤维过滤系统过滤上述酶水解液，得到酶水解液的滤过液；(2)用超滤膜或透析法处理酶水解液，截留液为酶蛋白液，透过液为异黄酮苷元液；(3)离心分离，将超滤膜或透析法处理酶水解液所得到的透过液进行离心分离，得到的沉淀物为大豆异黄酮苷元；(4)将所得到的沉淀物喷雾干燥，或在进行其它干燥工艺如负压干燥或冷冻干燥后进行超微粉碎，例如粉碎至100目，得到大豆异黄酮苷元粉，苷元总含量(染料木素、大豆苷元和黄豆黄素)＞95％。
下面对本发明生产大豆异黄酮苷元的方法进行具体描述。
基本原料本发明方法的基本原料是大豆异黄酮粉，主要的成份是大豆异黄酮，还含有一定数量的大豆皂苷、少量的蛋白质和低聚糖等杂质，其中异黄酮含量为20～90％，优选40-80％，例如黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司的产品，其产品质量符合该公司Q/HSS01-2002企业标准。
所述大豆异黄酮粉可按照下述方法制备以低温脱溶豆粕为原料，采用不同浓度的乙醇溶液进行梯度萃取，得到的提取液经微滤和超滤系统除去大豆蛋白等高分子杂质，再用高浓度的乙醇沉析和丙酮、乙酸乙酯萃取纯化即得到所需要的大豆异黄酮粉。
菌种本发明采用的菌种为黑曲霉(Aspergillus niger van Tighem)，菌种的名称是As3.4309、As3.3882、IFFI 2241和IFFI 2272；和米曲霉(Aspergillus oryzae Cohn)，菌种的名称是As3.384、As 3.800、IFFI 2011和IFFI 2012。所述的菌种均为霉菌(属于小型丝状真菌)(参见《菌种目录》科技出版社，198286-87和《中国工业菌种目录》，198641-47)。所述菌种用原种培养基(麦芽汁琼脂培养基)进行原种传代培养，糖度为5°BX。
所述原种培养基可按下述方法制备选普通大麦浸泡24小时，置草筐内，上面盖一层湿布，温度18～25℃，每天冲水1-2次至芽长为大麦本身一倍时即可，然后风干，粉碎，即得大麦芽粉，大麦芽粉与水按1∶4，55～60℃糖化，至加碘不呈现兰色为止，糖化时间为6～7小时，离心分离，装入三角瓶中，加棉塞后于0.1MPa灭菌30min，并使其杂质沉淀，用糖量计测定糖度，得到麦芽汁。取无沉淀物的麦芽汁100ml加入1.5～2％琼脂，加热溶化后装入试管中，加棉塞后于0.1MPa灭菌30min，趁热摆成斜面。(上述麦芽汁制备方法是购买菌种时由中国微生物菌种保藏中心提供)。
β-葡萄糖苷酶的提取与精制
A.液态发酵法将可溶性淀粉5～10g、大豆蛋白或大豆蛋白水解物(例如黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司产品，其产品质量符合Q/HSS05-2002企业标准)30～70g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·4H2O0.01g、KCl 0.5g和K2HPO41g用反渗透水溶解后稀释至1000ml，加入0.5～1.5％的含量为20％的大豆异黄酮粉(例如黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司产品，其产品质量符合Q/HSS01-2002企业标准)，然后煮沸灭菌30min，冷却至35～40℃，pH值5.5～8.5，接种量为0.5％～5％，优选1％～3％，进行搅拌和通气培养，搅拌速度为30～120rpm，通气量Qm为1～3mmolO2/g(干菌丝)·h，培养72～96小时。
Qm的计算方法见如下公式培养需氧量按下式计算N＝Qm·XN——需氧速率mmolO2/hQm——氧最大比消耗速率mmolO2/g(干菌丝)·hX——菌液浓度g(干菌丝)/L(培养液)当达到对数生长期时，此时所需氧气量为最大，Qm＜3.0mmolO2/g(干菌丝)·h，菌液浓度也为最大，终止培养。
B.固态发酵法(1)制取粗酶粉首先制备固体培养基，采用麦麸和大豆蛋白(例如黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司产品，其产品质量符合Q/HSS05-2002企业标准)比例为0.5～2.5∶9.5～7.5，加水量为料量的1.2～1.6倍，加入0.5～1.5％的含量为20％的大豆异黄酮粉(例如黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司产品，其产品质量符合Q/HSS01-2002企业标准)，混匀后装入器皿，采用压力0.1MPa，灭菌时间30min。
将上述固体培养基取出后装入木槽中，冷却至32～40℃拌入菌种，拌种量为料量的1～5％，混匀后装入木盒中，培养温度为30～40℃，湿度60％～90％，培养时间为25～50小时，自然pH，当出现大量白色菌丝(即未长出孢子)时即为对数生长期，终止生长，60℃干燥后粉碎，为粗酶粉。
(2)提取β-葡萄糖苷酶向粗酶粉中兑入反渗透水，固液比为1∶9，充分搅拌溶解，采用过滤或离心方式除去菌丝和其它杂质，得到粗酶液。
C.酶提取液的过滤、干燥和粉碎液态发酵法和固态发酵法的产品按照下述方法纯化(1)过滤-粗过滤，即液-固分离采用真空鼓式过滤机系统，速度为800L/m2。去除菌丝等杂质。
-精过滤采用PP线绕过滤系统或聚丙烯中空纤维过滤系统，孔径0.1～60μm、工作压力为0.1～0.6MPa、除去培养液中的微细颗粒和胶溶杂质等，得到滤过液。
(2)精制-用超滤膜精制所用超滤膜元件的孔径＜20nm，可除掉上述滤过液中的无机盐等杂质，透过液为无机杂质，截留液浓缩为酶提取液。或-透析法精制选用中空纡维透析膜装置在压力(0.1MPa)作用下，使酶提取液流过透析膜，所述的透析膜是可载留分子量≤3万，例如1-3万的中空纡维透析膜。通过透析作用，使分离的液体在无相变的情况下得到浓缩和纯化。
(3)干燥与粉碎-冷冻干燥将截留液即酶提取液进行冷冻干燥，压强为0.1～0.8Torr、温度为-20～-40℃、升华温度为40～60℃、干燥时间为10～30小时，得到固体β-葡萄糖苷酶；或-负压干燥与粉碎采用负压干燥，压强为0.06～0.098MPa、温度为45～65℃、干燥时间为1～4小时，将干燥后的物料进行粉碎，通过80-100目筛，得到固体β-葡萄糖苷酶粉。
D.β-葡萄糖苷酶活力的测定方法--对硝基苯酚-β-D葡萄糖苷作为底物的方法把1.2mL，0.1mol/L，pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液0.4mL，8mmol/L的对硝基苯酚-β-D葡萄糖苷(p-NPG)水溶液和0.4mL的酶液混合，在45℃恒温水浴中保温30min。加入2mL、0.5mol/L的碳酸钠终止反应。在400nm测对硝基苯酚光吸收值。用对硝基苯酚纯品配制不同浓度(15-300μmol/L)的标准溶液，分别取2mL各浓度对硝基苯酚标准溶液2mL，加0.5mol/L的碳酸钠显色，绘制标准曲线。计算出对硝基苯酚含量。
酶单位(U)在1min内催化生成1μmol/L对硝基苯酚的酶量为1个酶单位。
比活力(U/mg蛋白)单位酶蛋白具有的酶活力单位。
对所得到的β-葡萄糖苷酶进行酶活力测定，评定所得到的β-葡萄糖苷酶的生物效价，以便指导酶水解工艺中的加酶量，控制生产工艺参数。
适合用于本发明方法的酶活力单位应＞3.5万。
E、大豆异黄酮水解率按下式计算W＝(R-F)/Q×100％式中W-水解率；R-水解后总苷元重量；F-水解前底物中的苷元重量；Q-底物中异黄酮重量。
酶水解生产大豆异黄酮苷元酶水解生产大豆异黄酮苷元的方法包括以下步骤(1)用如上所述的液态发酵法或固态发酵法提取和精制β-葡萄糖苷酶；(2)酶水解
以大豆异黄酮粉为基本原料，加入上述步骤(1)制备得到的β-葡萄糖苷酶，调节酶与大豆异黄酮粉的比例为1500～5000U/g，水解温度40～60℃，pH5.5～8.5，搅拌速度为30～120rpm，水解时间为2～8小时，得到酶水解液；(3)过滤酶水解液，得到酶水解液的滤过液；(4)将所述滤过液用超滤膜或渗透析装置进行纯化，然后进行喷雾干燥，得到大豆异黄酮苷元粉；或采用其它干燥方法，例如负压干燥或冷冻干燥等方法干燥后再进行超微粉碎，得到大豆异黄酮苷元粉。
其中所述的β-葡萄糖苷酶可以液体酶或固体酶的形式使用。所述的液体酶是指液态发酵法或固态发酵法中最后干燥之前的、经过纯化的液体酶。所述的固体酶是指液态发酵法或固态发酵法的最终产品，也包括固态发酵法的中间产品粗酶粉，只是在使用粗酶粉时，因其活性不足可能需要加大使用量。
在酶水解生产大豆异黄酮苷元的工艺过程中，超滤或渗透析工艺的透过液为所需大豆异黄酮苷元产品，截留液为酶蛋白，其主要成分是β-葡萄糖苷酶。该截留液可以直接作为β-葡萄糖苷酶(LPH)使用，使用时可根据其活性适当加大其使用量；或者将该截留液与固态发酵法或液态发酵法发酵后得到的酶提取液合并，一起进行纯化，然后在酶水解工艺中使用。上述两种方法均可实现所述截留液的循环利用，从而提高了本发明水解酶的利用率，降低了成本。
纯化操作使用超滤技术时，所用超滤膜元件的孔径＜20nm。使用透析法技术进行纯化操作时，所用透析膜是可载留分子量≤3万，例如1-3万的中空纡维透析膜。透析操作可在大约0.1MPa压力下进行。
实施例下面用具体实施方式
进一步说明本发明的方法，可以理解的是，本发明的具体实施方式
不会构成对本发明保护范围的任何限制。
实施例1采用液态发酵法，用黑曲霉As3.4309制备β-葡萄糖苷酶(1)制备液体培养基在可溶性淀粉5g(北京精求化工有限责任公司产品)和大豆蛋白50g(符合黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司企业标准Q/HSS05-2002)中加入0.5％的纯度为20％的大豆异黄酮(符合黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司企业标准Q/HSS01-2002)，再向其中加入MgSO4·7H2O 0.5g(分析纯)、FeSO4·4H2O 0.01g(分析纯)、KCl 0.5g(分析纯)和K2HPO41g(分析纯)，用反渗透水(自制，其电导率5.0)溶解后稀释至1000ml，煮沸灭菌30min，冷却至40℃，得到液体培养基。
(2)菌种培养于pH值大约为5.5，接种黑曲霉As3.4309，接种量为3％，进行搅拌和通气培养，搅拌速度为60rpm，通气量为1.5mmolO2/g(干菌丝)·h。
当达到对数生长期时，所需氧气量Qm为3.0mmolO2/g(干菌丝)·h，菌液浓度也为最大，在此时终止培养。培养时间65小时，得到β-葡萄糖苷酶提取液。
(3)酶提取液的过滤、干燥和粉碎将所得到的酶液用真空鼓式过滤机系统，速度为800L/m2，进行液-固分离，并除去菌丝等杂质；然后采用PP线绕过滤系统过滤，孔径50μm，工作压力为0.1MPa，除去培养液中的微细颗粒和胶溶杂质等，得到滤过液；将上述滤过液用孔径＜20nm的超滤膜元件过滤，除掉上述过滤液中的无机盐等杂质，透过液为无机杂质，截留液为酶提取液；将该提取液经减压浓缩，然后进行冷冻干燥，干燥时的压强为0.8Torr，温度为-40℃，升华温度为40℃，干燥时间为24小时，得到固体β-葡萄糖苷酶。
实施例2采用固态发酵法，用黑曲霉As3.3882制备β-葡萄糖苷酶(1)制备固体培养基在比例为2∶8的麦麸和大豆蛋白(符合黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司企业标准Q/HSS05-2002)中加水，加水量为固体料量的1.6倍，再向其中加入0.5％的纯度为20％的大豆异黄酮(符合黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司企业标准Q/HSS01-2002)，混匀后装入器皿，在压力0.1MPa下灭菌30min。
(2)制取粗酶粉将上述固体培养基取出后装入木槽中，冷却至40℃拌入菌种黑曲霉As3.3882，拌种量为料量的3％，混匀后装入木盒中，培养温度35℃，湿度75％，培养时间为40小时，自然pH，当出现大量白色菌丝(即未长出孢子)时即为对数生长期，终止生长，于60℃干燥后粉碎，为粗酶粉。
(3)提取β-葡萄糖苷酶向粗酶粉中兑入反渗透水，固液比为1∶9，充分搅拌溶解，搅拌速度60rpm，搅拌时间3小时，得到β-葡萄糖苷酶液。
(4)酶提取液的过滤和干燥将上述酶液用真空鼓式过滤机系统过滤，速度为800L/m2；得到的酶液用PP线绕过滤系统过滤，孔径50μm，工作压力为0.1MPa，进行过滤，以除去培养液中的微细颗粒和胶溶杂质等。
得到的滤过液用孔径＜20nm的超滤膜元件过滤，除去其中的无机盐等杂质，透过液为无机杂质，截留液为酶提取液。
截留液经减压浓缩后进行冷冻干燥，干燥时的压强为0.4Torr，温度为-40℃，升华温度为60℃，干燥时间为24小时，得到固体β-葡萄糖苷酶(LPH)。
实施例3采用固态发酵法，用米曲霉As3.384制备β-葡萄糖苷酶按照上述实施例2的方法，只是用米曲霉As3.384作为菌种代替其中的黑曲霉As3.3882，制备得到固体β-葡萄糖苷酶(LPH)。
实施例4采用液态发酵法，用米曲霉As3.800制备β-葡萄糖苷酶按照上述实施例1的方法，只是用米曲霉As3.800作为菌种代替其中的黑曲霉As3.4309，以及用透析法代替超滤法进行纯化工艺，在透析工艺中使用的中空纤维透析膜装置在压力为0.1MPa下进行操作，所述透析膜为可截留分子量1万的中空纡维透析膜，制备得到固体β-葡萄糖苷酶(LPH)。
实施例5β-葡萄糖苷酶(LPH)活力的测定按照上文所述β-葡萄糖苷酶活力测定方法分别测定实施例1-4获得的β-葡萄糖苷酶的活力，所得测试结果如下
实施例6用液体酶水解生产大豆异黄酮苷元称取100g 40％大豆异黄酮粉(符合黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司企业标准Q/HSS01-2002)放入到从上述实施例1液态发酵法获得的液体酶2000ml中，调节酶与底物比为5000U/g，水解温度为60℃，pH5.5，搅拌速度为60rpm，水解时间为4小时，水解率达到90％以上。终止酶水解反应，得到酶水解液。
用PP线绕过滤系统滤除酶水解液中的微细颗粒和胶溶杂质等，得到酶水解液的滤过液。再经超滤膜装置(孔径＜20nm)进行纯化，得到透过液。将该透过液进行离心分离，速度为400rpm，离心分离获得的沉淀物经喷雾干燥(7kg/小时)得到大豆苷元粉25.65g，大豆异黄酮苷元含量为96％(其中大豆苷元为36.45％、染料木素56.23％、黄豆黄素3.32％)。
超滤工艺中的截留液为酶蛋白，其主要成分为β-葡萄糖苷酶(LPH)，将其与实施例1的酶提取液合并后一起进行精制，使其得到循环利用。
实施例7用固体酶水解生产大豆异黄酮苷元称取100g 40％大豆异黄酮粉，加入实施例2获得的最终产物固体酶2.0g，用反渗透水(用反渗透膜自制，电导率为5.0)2000ml，搅拌(搅拌速度为60rpm)溶解，水解条件温度为60℃、pH值为5.5、水解时间为4小时。终止酶水解反应，得到酶水解液。
采用PP线绕过滤系统滤除去酶水解液中的微细颗粒和胶溶杂质等，得到酶水解液的滤过液，再经超滤膜装置(孔径＜20nm)进行纯化，透过液即为大豆异黄酮苷元。将此溶液进行离心分离，得到的沉淀物经喷雾干燥(7kg/小时)后得到大豆异黄酮苷元粉24.6g。苷元总含量为95.5％(大豆苷元35.9％、染料木素56.9％、黄豆黄素2.7％)。
实施例8用超滤截留液水解大豆异黄酮生产大豆异黄酮苷元称取100g 40％大豆异黄酮粉，加入实施例7超滤处理步骤中的截留液(即酶蛋白液)500ml，加反渗透水(用反渗透设备自制，电导率为5.0)至2000ml，使酶与底物比达到3750U/g，搅拌(搅拌速度为60rpm)使其充分溶解，进行水解。水解条件温度为60℃，pH值为5.5，水解时间为4小时。酶水解反应终止后得到酶水解液。采用PP线绕过滤系统滤除去酶水解液中的微细颗粒和胶溶杂质等，得到酶水解液的滤过液，再经超滤膜装置(孔径＜20nm)纯化，将透过液用反渗透水洗涤离心得到的沉淀物即为大豆异黄酮苷元，此沉淀物溶液经过喷雾干燥(7kg/小时)得到大豆异黄酮苷元粉23.8g，水解率＞90％。苷元总含量为94.8％(大豆苷元35.2％、染料木素56.7％、黄豆黄素2.9％)。
通过上述具体实施方案的描述充分说明了本发明方法相对于现有技术的特征和优异效果。本领域普通技术人员根据本发明的教导，特别是参照本发明的具体实施方式
可以在不背离本发明实质的情况下，对本发明的实施方案作各种修饰和变化，这些修饰和变化都在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种用酶水解生产大豆异黄酮苷元的方法，该方法以大豆异黄酮粉为基本原料，以大豆蛋白和大豆异黄酮作诱导剂，用培养霉菌释放的胞外酶β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮，并利用选自超滤和透析的膜技术进行酶水解液的后处理，得到大豆异黄酮苷元。
2.按照权利要求1的方法，其中所述的β-葡萄糖苷酶可以液体酶或固体酶的形式使用。
3.按照权利要求1的方法，其中所述的β-葡萄糖苷酶是通过用黑曲霉(Aspergillus niger van Tighem)和米曲霉(Aspergillus oryzae Cohn)进行液态发酵或固态发酵获得的。
4.按照权利要求3的方法，其中所述的黑曲霉选自As3.4309、As3.3882、IFFI 2241和IFFI 2272；所述的米曲霉选自As3.384、As3.800、IFFI 2011和IFFI 2012。
5.按照权利要求1-4任意一项的方法，该方法包括以下步骤(1)用液态发酵法或固态发酵法提取和精制β-葡萄糖苷酶；(2)酶水解以大豆异黄酮粉为基本原料，加入β-葡萄糖苷酶，调节酶与大豆异黄酮粉的比例为1500～5000U/g，水解温度40～60℃，pH5.5～8.5，搅拌速度为30～120rpm，水解时间为2～8小时，得到酶水解液；(3)过滤酶水解液，得到酶水解液的滤过液；(4)将所述滤过液用超滤膜或渗透析装置进行纯化，再进行离心分离，浓缩离心分离得到的沉淀物，然后进行喷雾干燥，或在干燥后进行超微粉碎，得到大豆异黄酮苷元粉。
6.按照权利要求5的方法，其中所述超滤膜的孔径＜20nm，所述渗透析装置使用截留分子量为1-3万的中空纤维透析膜。
7.按照权利要求5或6的方法，其中超滤或渗透析工艺的截留液的主要成分是β-葡萄糖苷酶，可直接循环应用于大豆异黄酮的酶水解或在纯化后用于大豆异黄酮的酶水解。
8.按照权利要求5的方法，其中所述的液态发酵法包括如下步骤(1)制备液体培养基将可溶性淀粉5～10g、大豆蛋白或大豆蛋白水解物30～70g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·4H2O 0.01g、KCl 0.5g和K2HPO41g用反渗透水溶解，加入0.5～1.5％含量为20％的大豆异黄酮粉，然后稀释至1000ml，煮沸灭菌30min，得到液体培养基；(2)发酵培养于32～40℃，pH值5.5～8.5在上述培养基中接种，菌种量为0.5％～5％，进行搅拌和通气培养，搅拌速度为30～120rpm，通气量Qm为1-3mmolO2/g(干菌丝)·h，培养72～96小时，得到酶提取液；(3)酶提取液的精制所述酶提取液经过滤后，用超滤膜元件或渗透析装置进行精制，精制后的酶提取液按照常规方法干燥、粉碎后得到固体β-葡萄糖苷酶粉。
9.按照权利要求5的方法，其中所述的固态发酵法包括如下步骤(1)制备固体培养基将麦麸和大豆蛋白或大豆蛋白水解物以0.5～2.5∶9.5～7.5的比例加水混合，加水量为固体料量的1.2～1.6倍，同时加入0.5～1.5％含量为20％的大豆异黄酮粉，混匀后装入器皿，在压力0.1MPa下灭菌，时间30min，得到液体培养基；(2)发酵将上述固体培养基装入木槽中，于32～40℃拌入菌种，拌种量为料量的1～5％，混匀后装入木盒中培养温度为30～40℃，湿度60％～90％，培养时间为25～50小时，自然pH，当出现大量白色菌丝时即为对数生长期，在此时终止生长，60℃干燥后粉碎，得到粗酶粉；(3)提取粗酶液向所述粗酶粉中兑入反渗透水，固液比为1∶9，充分搅拌溶解，采用过滤或离心方式除去菌丝和其它杂质，得到粗酶液；(4)粗酶液的精制所述粗酶液经过过滤后，用超滤膜元件或渗透析装置进行精制，得到酶提取液，按照常规方法干燥、粉碎后得到固体β-葡萄糖苷酶粉。
10.按照权利要求8或9的方法，其中所述超滤膜的孔径＜20nm，所述渗透析装置使用截留分子量为1-3万的中空纤维透析膜。
全文摘要
本发明公开了利用酶水解由大豆异黄酮生产大豆异黄酮苷元的方法。更具体地，本发明涉及采用β－葡萄糖苷酶酶水解大豆异黄酮制取大豆异黄酮苷元，并采用选自超滤或透析的膜技术对酶提取液进行进一步的纯化，从而可以高产率和高纯度获得大豆异黄酮苷元。在本发明的方法中，水解酶可以循环使用，提高了酶的利用率，降低了生产成本。本发明的方法是适于产业化生产大豆异黄酮苷元的一种实用技术。
文档编号C12N9/24GK1733926SQ200410058379
公开日2006年2月15日 申请日期2004年8月13日 优先权日2004年8月13日
发明者王哲, 白志明, 关海君, 许浮萍, 张永忠 申请人:黑龙江双河松嫩大豆生物工程有限责任公司