专利名称：可用于转基因农产品检测的基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种可用于转基因农产品检测的基因芯片。
背景技术：
自1992年Adam提出表达序列标签(expressed sequence tags，EST)概念(Nature，355，642-644)和多种模式生物基因组测序的完成以及生物技术的发展，越来越多的抗虫、抗除草剂基因通过分子生物学技术克隆到相应的植物中，并产生了相应的转基因植物，象转基因大豆、玉米、棉花、油菜和番茄等。但由于转基因生物及其产品的潜在风险，以及转基因技术及其产品的越境转移等问题，各国相应地制订了转基因食品安全的相关法律或法规。为保护广大消费者的权益，满足其选择权、知情权以及出于国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视。但是由于基因重组技术的复杂性和多样性，给转基因食品的检测带来了很大的困难，因此建立国际间标准的快速、准确的检测方法，已成为各国政府和研究者亟待解决的问题。
1995年10月Patrick Brown和他的同事(Bio Techniques，19(1995)，442-447)提出了cDNA微阵列技术，M.Schena(Science 1995；270(5235)，467-470)和D.Shalon(Genome Research 1996；6(7)，639-645)等首次制造了cDNA阵列，随后这项技术得到了飞速的发展。目前DNA芯片因具有强有力性、灵活性、敏感性和相对简单等特点而被应用在许多领域，如DNA序列测定、基因多态性检测、新基因的发现、疫苗和药物研究(M.J.Cunningham et al.，J.Pharmacol.and Toxicol.Methods 2000；44，291-300)、植物的抗逆性研究(P.M.Schenk，et al.，PNAS 2000；9711655-11660)。
用于制备DNA芯片(DNA阵列)的已知方法包括，例如，一种方法，在该方法中在芯片的固相上的预先确定的位置合成了一种单链的DNA，还包括另一种方法，在该方法中在芯片的各项上的预先确定的位置上定位有一种事先制备的单链或者双链DNA。对于上述的高密度寡核苷酸阵列，需要一种用于高密度固相合成的大型设备。进一步，合成一种该方法的长核苷酸链由于其合成产量而十分困难。对于具有被定位的双链DNA的样点阵列，一个将固定化于DNA芯片的双链DNA变性成为单链DNA的步骤是必不可少的，这复杂化了分析过程。对于具有被定位的单链DNA的样点阵列，需要在将其固定化于固相之前从双链DNA制备单链DNA，这复杂化了该芯片的制备过程。如上所述，传统的DNA芯片和制备这样的DNA芯片的传统方法存在诸多问题。
另外，提供在其上排列和固定化有一些含有开放读码框(此后称为ORF)的DNA以在一种生物体的全基因水平上测定基因表达模式或者基因产物的功能的DNA芯片是需要的。但是，排列和固定化有不同链长度的DNA的DNA芯片存在一些问题，例如，微弱的杂交信号以及短DNA的低固定化速度。因此，提供产生高固定化速度和强杂交信号的DNA芯片是需要的。
在生物学领域中所涉及的基因芯片技术，是一种同时将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的效率信息进行高效的解读和分析的方法。这类技术在对基因表达谱的分析、突变检测、多态性分析、基因测序和基因组文库作图等方面已有应用的报道。随着生物技术的快速发展，通过将外源基因导入天然农作物遗传基因，实现对其原有基因进行改造，以期得到能增加营养成分含量、提高抗逆性等改良和优化性状的农作物新品种，并进而提高以其为原料的食品在相应方面的品质和/或功能，目前已在进行广泛的研究和应用。与此同时，对这类通过转基因技术得到的植物和/或以其为原料的食品的使用安全性问题也日益引起了人们的关注。因此，如何通过植物检疫的方法对转基因植物进行判断和鉴定的问题，也相应提出并正在研究和探索之中。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于转基因农产品检测的基因芯片。
它是在平面型支撑载体的平面上被覆有带正电荷材料的膜，在该膜层的表面设有点阵，在点阵上排布有如下供转基因植物判断用的外源基因探针1)35S启动子，2)FMV35S启动子，3)Nos终止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。
所说的点阵为排布的凹窝状结构，点阵之间保持有空间间隔，所说的各供转基因植物判断用的外源基因探针分别被覆于各凹窝状结构内。带正电荷材料的膜层为聚赖氨酸材料或氨基硅烷材料膜层。平面型支撑载体为玻片、硅片、尼龙膜或硝酸纤维素膜。
本发明的优点1)本发明能够同时检测包括1)35S启动子，2)FMV35S启动子，3)Nos终止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段的一个或几个基因。2)本发明采用长度大于50个核苷酸的单链寡核苷酸进行点制19种外源基因探针的，同时每种外源基因设置三种浓度，每种浓度重复点制三次，保证检测结果的可靠性。
图1是本发明可用于转基因农产品检测的基因芯片的一种结构示意图；图2是本发明可用于转基因农产品检测的基因芯片图1的方阵结构放大示意图。
具体实施例方式
本发明可用于转基因农产品检测的基因芯片，其结构是在平面型支撑载体的平面上被覆有带正电荷材料的膜层，在该膜层的表面以点阵方式排布有转基因农产品检测用的外源基因探针。其中所说的该平面型支撑载体，可以采用目前同类技术中已有使用的玻璃片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜等材料制成的片状支持基体中的一种。该平面型支撑载体上被覆的带正电荷材料的膜层，可以为聚赖氨酸材料或氨基硅烷材料等膜层中的一种。以点阵方式排布于该膜层表面处的供转基因农产品用的外源基因探针，可以采用平面附着的方式位于所说的该带正电荷的材料膜层的表面，也可以使所说的带正电荷材料的每次表面具有按点阵形式排布的凹窝状结构，所说的各供转基因农产品检测用的外源基因探针以被覆于各凹窝状结构内凹表面的形式，或者以其它需要或适当的形式分别位于各凹窝状结构内。根据使用目的和/或领域的不同，所说的以点阵方式排布的供转基因农产品检测用的外源基因探针可以集中于所说的带正电荷材料膜层的一个区域内，也可以使各点阵方式排布的供转基因农产品检测用的外源基因探针为分布在所说的该带正电荷材料膜层表面处保持有空间间隔距离的复数个区域内的形式。
由于目前在植物转化方面通常采用的一种方法，是以根癌农杆菌Ti质粒作载体，介导转化双子叶植物，如大豆、棉花、番茄等农作物。另一种方法是直接采用质粒载体通过电转化单子叶植物，如玉米、水稻等粮食作物。无论采用哪种方法，植物转化载体必须包含选择标记基因，如氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。报告基因，如GUS基因、GFP基因等，以及适用于植物的基因启动子，如植物病毒35S RNA基因的启动子等基本要素，这些序列随同被转化、整合到转基因植株的染色体上。由于在植物转化中所用的标记基因数目有限，且都已成为一些标准技术，故而通过检测在植株中是否存在有这些外来的基因序列(DNA序列)，原则上也就能鉴定该植株是天然的，还是转基因植株。因此，在上述的用于转基因鉴定的基因检测芯片中，所说的供转基因植物判断用的外源基因探针可以包括氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、GUS基因、绿色荧光素基因(GFS)、35SRNA启动子DNA序列、根癌农杆菌Nos基因终止子DNA序列等。这些基因可广泛应用于水稻、大豆、烟草、番茄、棉花等转基因植物。使用本发明上述结构形式的基因检测芯片可以实现对上述多种转基因的外源性基因作出快速、准确和定性的判断分析。
如图1所示的可用于转基因农产品检测的基因芯片中，在常用的玻片、硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜的平面型支撑载体1的平面上，被覆有带正电荷材料的膜层2、该带正电荷材料的膜层可以为聚赖氨酸材料或氨基硅烷材料膜层中的一种。在该膜层2的表面上以平面附着的点阵方式排布有供多种转基因植物进行判断用的外源基因探针，这些探针包括1)35S启动子，2)FMV35S启动子，3)Nos终止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因。该点阵方式排布是每个外源基因探针集中于该带正电荷材料膜层2表面处的一个区域内的形式。也可以将多个以点阵方式排布的外源基因探针分别以保持有空间间隔距离的的形式分布在该带正电荷材料膜层2的表面处复数个不同区域内的形式。
图2所示的可用于转基因农产品检测的基因芯片在结构是图1的一个方阵的结构放大示意图，所说的该带正电荷材料的膜层2的表面处具有按点阵形式排布的凹窝状结构4，所说的供转基因植物检测用的各外源基因探针分别以被覆于相应各凹窝状结构4内凹表面处的形式，或以其它所需要或适当的方式设置位于各凹窝状结构4内。每个外源基因探针以三种不同的浓度点制，每种浓度重复3或多次。
具体制备方法
(一)可用于转基因农产品检测的基因芯片的制备将预先合成好的单链寡核苷酸片段(长度大于50bp)(由上海生工生物工程公司合成)稀释成浓度为0.2μg/μl，按照实验要求将各种浓度、各种不同基因的单链寡核苷酸片段排列于96孔PCR板中，用于生物芯片的点制；这些基因包括1)35S启动子，2)FMV-35S启动子，3)Nos终止子，4)NPT II基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因。该19个基因均在互联网上公开，详见http//www/ncbi.nlm.nih.gov。生物芯片由arrayer(Genomic Solution，USA)机器手，使用直径为0.4mm的96针点制，生物芯片载体为尼龙膜(Millipore NylonN+)，所有的点点制为36×24的一级方阵，每种基因的三种不同浓度在3×3的二级阵中平行三次重复以验证试验的重复性。
(二)分子杂交及信号检测聚合酶链式反应(PCR)扩增产物约5μg 100℃煮沸5min进行变性后，直接放入冰上冷却3-5min，以备探针杂交用；将检测用生物芯片用0.25M的磷酸缓冲液(pH7.2)进行润湿后，加入预杂交液(0.25mol/L磷酸缓冲液，pH7.2，1mmol/L EDTA，pH8.0，7％SDS，1％BSA)，60℃进行预杂交1-2小时；接着加入制备好的5μg变性探针DNA(该探针未进行任何标记，如同位素、生物素等)，60℃进行杂交10-12小时；用洗膜液I(2×SSC(0.3mol/LNaCl，0.03mol/L柠檬酸钠，pH7.0)，0.1％SDS)洗涤2次，每次20min；用洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)洗涤15min；将芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE缓冲液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))中染色5-10min；用TE缓冲液漂洗5-10min，重复2次；在254nm紫外光下或荧光显微镜下进行信号检测。
权利要求
1.一种可用于转基因农产品检测的基因芯片，其特征在于，在平面型支撑载体(1)的平面上被覆有带正电荷材料的膜(2)，在该膜层的表面设有点阵(3)，在点阵(3)上排布有如下供转基因植物判断用的外源基因探针1)35S启动子，2)FMV35S启动子，3)Nos终止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。
2.如权利要求1所述的一种可用于转基因农产品检测的基因芯片，其特征在于所说的点阵(3)为排布的凹窝状结构(4)，点阵(3)之间保持有空间间隔，所说的各供转基因植物判断用的外源基因探针分别被覆于各凹窝状结构(4)内。
3.如权利要求1所述的一种可用于转基因农产品检测的基因芯片，其特征在于所说的带正电荷材料的膜层(2)为聚赖氨酸材料或氨基硅烷材料膜层。
4.如权利要求1所述的一种可用于转基因农产品检测的基因芯片，其特征在于所说的平面型支撑载体(1)为玻片、硅片、尼龙膜或硝酸纤维素膜。
全文摘要
本发明公开了一种可用于转基因农产品检测的基因芯片。它是在平面型支撑载体的平面上被覆有带正电荷材料的膜层，在该膜层的表面以点阵方式排布有供转基因农产品检测用的外源基因探针，这些外源基因探针包括1)35S启动子，2)FMV－35S启动子，3)Nos终止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4－EPSPS基因，8)35s－CTP2，9)CP4－EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因。该实用新型使用方便，操作简单，具有快速、特异、敏感、准确、实用等优点，因而具鉴别诊断价值，且便于大规模生产。
文档编号C12Q1/68GK1661103SQ20041009313
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年12月17日
发明者李德葆, 骆红梅, 戴承恩, 姜玉新, 董海涛 申请人:浙江大学