专利名称：默诺霉素的纯化方法
技术领域：
本发明涉及默诺霉素的纯化方法研究，使用本发明方法可以从微生物发酵产物中制备高纯度的默诺霉素。
背景技术：
默诺霉素(moenomycin)，又名黄霉素，斑伯霉素，1955年由Lindetr从Streptomycesbambergiensis发酵产物中分离得到(K.H.Wallhausser，G.Nesemann，P.Prave，and A.Steigler，Moenomycin，a New Antibiotic Fermentation and Isolation，Farbwerke Hoechst，AG.，Frankfart amMain，Germany)。外观为白色无定型粉末，易溶于水、甲醇、二甲基甲酰胺等。
默诺霉素主要有五个组分，即A，A12，C1，C3和C4，以A为主，含量超过50％，五个组分均有类似的抗菌活性。默诺霉素的毒性小，口服给药后不被消化道吸收，24小时后几乎全部从粪便中排出，无残留。目前主要作为动物生长促进剂使用。默诺霉素在很低剂量下即可显著促进动物生长，提高饲料的转化率。作为促动物生长的饲料添加剂，在我国已使用多年，是至今仍被欧共体批准使用的少数抗生素之一。尤其最近发现默诺霉素可控制幽门螺旋杆菌感染，而幽门螺旋杆菌感染是人类胃炎和胃溃疡的主要原因，专利US6077830报道，默诺霉素的铋盐适于治疗和预防胃病，因此默诺霉素也可以人类用药。
从微生物发酵的菌丝体中纯化默诺霉素，国内尚无该技术。国外专利主要是关于默诺霉素A的纯化方法。专利GB1068639和DE1236726报道，应用纤维素基质的离子交换剂纯化默诺霉素，但纤维素载体耐压较差，导致该纯化方法大量制备时缺乏实用性。德国专利1617466和美国专利5986089应用阴离子交换树脂为吸附剂，采用线性梯度洗脱，洗脱液为缓冲液加有机溶剂如异丙醇，溶剂用量大，且无法回收使用。另外，由于使用缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐等，洗脱下来的含有默诺霉素的流份需用中性树脂进一步脱盐。默诺霉素属磷酸多糖类抗生素，水溶液浓缩非常困难，脱盐后的水溶液需冷冻干燥。这样的实验室方法限制默诺霉素的大量制备。
默诺霉素五个主要组分的结构式见图1、图2。
发明内容
本发明提供一种溶剂用量小且易于回收，分离过程简单，提取得率高，产品纯度高的从微生物发酵产物中制备默诺霉素的方法。
本发明的技术方案是，首先对发酵产物进行前处理，过滤发酵液，收集菌丝体，用极性溶剂从菌丝体中提取抗生素，然后对粗提物应用不同的层析色谱法，去除杂质，脱色，分离和纯化默诺霉素。
提取菌丝体中的抗生素，可以采用超声提取或搅拌提取。极性溶剂选择低级脂肪醇或不同浓度的低级脂肪醇水溶液，例如甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇等。提取液浓缩回收溶剂，得到粗提物。
粗提物在柱层析纯化之前，可以先用有机溶剂萃取，加以预纯化。粗提物先以弱酸性水溶液溶解，萃取选择弱极性有机溶剂如石油醚、乙醚等去杂质，也可以选择极性溶剂如正丁醇萃取，得到正丁醇萃取物，即抗生素粗品。
以不同的层析法将抗生素粗品纯化，本发明首次应用硅胶减压柱层析。将抗生素粗品中默诺霉素与其它非极性或弱极性杂质分离，选择低级脂肪醇的碱溶液作为洗脱剂，改善柱层析拖尾情况，既提高分离效率，又节省溶剂。应用活性炭或硅酸镁等吸附剂脱色。通过反相色谱法使得与默诺霉素理化性质相近的其它类似物分离。洗脱剂选择常用的甲醇、乙腈和水，反相色谱填料优选Rp-8或Rp-18，且填料可重复使用。
本发明根据默诺霉素的理化性质及杂质的情况，应用多种层析方法，有效去除杂质。纯化默诺霉素过程中每种层析方法针对性强，有效成分提取得率高。应用本发明提供的方法制备默诺霉素，产品颜色为白色，产品纯度达到99％以上，且默诺霉素五个主要组分的相对比例恒定。
具体实施例方式实施例1发酵产物处理将发酵培养液10升过滤，得1000g(湿重)菌丝体，加入2000ml 50％甲醇，浸泡菌丝体，超声提取30分钟，过滤，菌丝体用50％甲醇重复提取一次，合并提取液，减压浓缩去除甲醇。
剩余水溶液约2000ml加10％硫酸，调节pH值至2.5～3.0，加入等体积正丁醇，萃取4次，合并正丁醇液，减压浓缩至干，称重29g，默诺霉素的含量为50％(HPLC法测定)。
实施例2硅胶减压柱层析法分离默诺霉素上述抗生素粗品8.0g，经20g硅胶拌样，干法上240g硅胶装填的减压柱(φ6.5×20)，以正丁醇/2M氨水溶剂系统进行梯度洗脱，收集溶剂配比为8∶2的流份600ml，溶剂配比为8∶3的流份共1800ml，合并流份，减压浓缩得粗品4.4g，默诺霉素的含量为85％(HPLC法测定)。
实施例3硅酸镁柱层析法脱色上述粗品9.0g经18g硅酸镁拌样，湿法上140g硅酸镁装填的层析柱(φ2.5×55)，以甲醇洗脱，洗脱液2500ml，减压浓缩回收溶剂，得到粗品5.2g，默诺霉素的含量为95.2％(HPLC法测定)。
实施例4反相柱层析纯化默诺霉素默诺霉素粗品2.6g，以20％甲醇水溶液溶解，直接加至200gRp-18装填的层析柱(φ2.5×50)，依次以不同浓度的甲醇溶液洗脱，收集含有默诺霉素的流份减压浓缩，得到默诺霉素纯品1.55g(含量＞99％，HPLC法测定)。
图1默诺霉素五个主要组分结构式的基本母核。
图2表示图1中取代基R1、R2的结构。
权利要求
1.制备默诺霉素的方法，该方法首先通过产生默诺霉素的微生物的发酵，对发酵产物进行有机溶剂提取获得粗提物、对粗提物进行萃取，随后正相色谱和反相色谱层析法相结合，分离和纯化默诺霉素。
2.权利要求1所述的方法，有机溶剂提取使用超声提取或搅拌提取，有机溶剂选择低级脂肪醇或不同浓度的低级脂肪醇水溶液。
3.权利要求1或2所述的方法，其中有机溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇等。
4.权利要求1或2所述的方法，其中在柱层析色谱前，先通过极性溶剂萃取粗提物。
5.权利要求4所述的方法，其中极性溶剂选自正丁醇、石油醚或乙醚。
6.权利要求1或2所述的方法，正相色谱法包括硅胶加压柱层析色谱法和减压柱层析色谱法。
7.权利要求6所述的方法，采用硅胶减压柱层析色谱法。
8.权利要求1或2所述的方法，反相色谱法采用经化学修饰的硅胶做填料。
9.权利要求8所述的方法，采用Rp-8或Rp-18做填料。
10.权利要求1或2所述的方法，其中在反相色谱层析前，先通过吸附剂活性炭或硅酸镁脱色处理。
全文摘要
本发明涉及一种从微生物发酵产物中制备默诺霉素的方法。该方法首先对发酵产物进行前处理，过滤发酵液，收集菌丝体，用极性溶剂从菌丝体中提取抗生素，然后对粗提物应用不同的层析色谱法，去除杂质，脱色，分离和纯化默诺霉素。该方法溶剂用量小且易于回收，分离过程简单，提取得率高，产品纯度达到99％以上。由本发明所述方法制备的产品可作为质量标准物质，控制同类产品的质量，也可用作药物默诺霉素铋盐的原料药。
文档编号C12P19/00GK1683549SQ20051005138
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月9日 优先权日2005年3月9日
发明者郑应华, 李文欣, 张国栋, 齐鹏, 肖进, 杨秀玉, 赵晖 申请人:中牧实业股份有限公司