专利名称：基于过氧化氢的井冈霉素优化发酵方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程与技术领域的方法，具体是一种基于过氧化氢的井 冈霉素优化发酵方法。
背景技术：
在1970年日本武田株式会社农药研发部门的Iwasa等人通过筛选对瘟枯病病原 菌丝核菌的抑制作用获得了能够产生抗水稻纹枯病代谢物的链霉菌菌株，经鉴定为吸水 Ι β^ τβ^ Ψ (Streptomyces hygroscopicus var. Iimoneus T—7545) 。ι^Ι^ Ι 了有效霉素的Α，B组分，并且较为系统的研究了该菌株的生长特性，并初步探索了生产抗 生素的条件。我国上海农药所在1973年在井R山地区筛选到吸水链霉菌的一个亚种，研 究表明该菌能够产生一种与有效霉素理化性质类似的新型抗生素，取名吸水链霉菌井冈 变种，并于1975年成功的开发了农药制剂，我国独立研发的这种抗生素被称为井网霉素 (Jinggangmycin)。随后的研究证明井网霉素与有效霉素具有相同的组分和化学性质。有效霉素并非一个单一组分，1988年报道了有效霉素Α，B, C，D，Ε，F等组分的结 构，随后又报道了 G和H，他们都是在相同的骨架结构上进行的一系列衍生，其中A组分的抗 菌活性最强，Α，B两个组分占全部同系物的79%以上。井R霉素自发现以来，国内外对井R霉素的菌种选育，培养基优化，发酵条件调 控，分离纯化以及制剂研究等方面都做了大量的卓有成效的研究。随后经过20多年的不断 选育和优化，工业产量不断提高。通过菌种选育可以大幅度的提高抗生素的产量，井R霉素 产生菌同样也表现出了巨大的增产潜力。从1973年产有效霉素出发菌的数百单位的产量， 经过一年的筛选便达到了 1万个单位。30年来通过各种方法不断进行的选育，目前的有效 霉素高产菌株发酵稳定在2万单位效价左右。发酵培养基也是影响抗生物生产的重要因 素，在国内利用吸水链霉菌井网变种生产有效霉素的研究与实践中，科研人员逐步探索出 了一系列经过优化的高产培养基。发酵温度会直接或间接影响培养细胞的生理生化，从而 最终影响发酵目标产物的生产量。我们研究发现在高温发酵条件下会在发酵前期带来快速 的蛋白合成，快速的糖消耗，快速的PH上升，而这三者恰好与最快速的有效霉素产生阶段 相互重合。这说明高温发酵对细胞的整个代谢造成了全局性的影响，其中包括对有效霉素 合成的巨大提高。细胞在收到氧化压力刺激下，会产生大量的活性氧，活性氧可作为信号分子进一 步激活下游基因的转录，从而调节了细胞的多个过程。在植物细胞中已报道通过各种方法 刺激活性氧的产生，活性氧作为信号分子促进了代谢产物的大量合成。微生物细胞也可通 过以下压力相应的sigma因子调节相应的基因表达，从而促进次级代谢产物的合成。而在 氧化压力下，细胞还可以改变其代谢流的流向，使代谢流由糖酵解途径流向戊糖磷酸途径。 而井R霉素合成的前体7-磷酸景天庚酮糖正是戊糖磷酸途径中的中间代谢物。因此，我们 通过外源添加过氧化氢策略的优化提高了井R霉素的产量。经过对现有技术的检索发现，在野油菜黄单孢菌中次氯酸的添加诱导了活性氧的产生对黄原胶的产量起到了促进作用，黄原胶产率有210%的提高，总产量也有20%以上 的提高。目前该技术尚未见其应用到井R霉素发酵生产过程。吸水链霉菌5008是一株有 潜力的井R霉素生产菌株，但目前其产量还较低，发酵周期较长。经过42摄氏度的高温发 酵，虽然其产量有一定提高，但高温必然带来大的能量消耗。如何在较低温度下进一步提高 井冈霉素发酵产量以及缩短其发酵周期是一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于过氧化氢的井R霉素优化发 酵方法，通过过氧化氢添加时间和浓度的优化，使井R霉素发酵产量提高40%左右，同时发 酵周期也缩短一天，提高了设备利用率，降低了能耗。此方法应用到调节基因突变的菌株 中，也可提高突变株的井R霉素产量。本发明为提高井R霉素产量提供了一种简便有效的 方法，为在工业生产中的应用提供基础。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过在吸水链霉菌井R变种孢子的发 酵培养阶段滴加过氧化氢溶液实现产量优化。所述的吸水链霉菌井R变种孢子是指取吸水链霉菌井R变种孢子的悬液划线平 板在37摄氏度环境下培养5天；所述的孢子悬液为零下20摄氏度保存的吸水链霉菌井R变种孢子悬液所述的发酵培养阶段是指将吸水链霉菌井R变种孢子接种于发酵培养液中并在 30摄氏度、220转速度下旋转培养24小时后发酵培养5天；所述的接种是指以种子液发酵培养液为1 10 (ν/ν)的比例接种培养，所述的滴加过氧化氢溶液是指将质量百分比为30%的过氧化氢稀释到ImM并过 滤除菌后在发酵培养过程的8-24小时时间段内滴加至浓度达到50微摩尔/升。经上述方法优化发酵得到的井R霉素产量提高达30%以上，并且井R霉素的最高 浓度提前到了第四天，与对照组相比提前了一天。
图1为过氧化氢添加时间对井冈霉素产量的影响示意图。图2为过氧化氢添加浓度对井R霉素产量的影响示意图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。实施例1实验材料采用的菌种吸水链霉菌井冈变种(Sti^ptomyces hygroscopicus var jingganggensis5008)(菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号 CGMCC4. 1026)实验步骤
(1)菌种活化与平板培养取冻存的甘油孢子悬液用接种环在黄豆饼粉甘露醇固体 培养基平板上划线，接种后37°C活化5天，待孢子铺满整个平板后备用。培养基配方为每升 培养基中含黄豆饼粉20g、甘露醇20g以及琼脂粉20g。(2)种子培养将活化后的菌种用接种环挑出一环接种到种子培养基中，30°C，220rpm培养24小 时。种子培养成份为玉米粉3%、黄豆饼粉1. 1%、酵母粉0. 5%、氯化钠0. 2%、磷酸二氢钾 0. 08%，装液量 50mL。(3)发酵培养将30°C培养24小时的种子取5mL接种到装有50mL的发酵培养基的250mL的摇 瓶中，于37°C培养220rpm培养5天。发酵培养基成分为玉米粉9%、黄豆饼粉4%、酵母粉 1%、氯化钠0. 1%、磷酸二氢钾0. 1%。在培养基配制前将不锈钢弹簧卷曲呈环状，置于摇 瓶底部。(4)过氧化氢添加时间的优化将30%的过氧化氢稀释到ImM，过滤除菌。分别在 发酵0，8和24小时添加1. 25mL到发酵摇瓶中使其终浓度为50微摩尔。(5)样品处理及检测方法将取好的ImL发酵液SOOOrpm离心5分钟，上清液用于 残糖和井R霉素产量的分析，残糖用浓硫酸_苯酚法测定，井R霉素产量用HPLC方法测定， 取0. 5mL样品加入ImL氯仿充分振荡使蛋白沉淀，12000rpm离心5分钟，吸取上层水相，稀 释5倍，用一次性滤膜过滤后用C18反相柱检测，测定条件为流动相为0. 005摩尔的pH7. 0 的磷酸盐缓冲液与甲醇比例98. 5 1. 5，流速lml/min，检测波长210nm。(6)结果表明，不同时间添加过氧化氢后井R霉素产量均有提高，当在第8h添加 时效果最好，与对照相比有35%左右的提高。实施例2采用的菌种同实施例1菌种活化及种子培养同实施例1发酵培养同实施例1过氧化氢添加时间的优化将30%的过氧化氢分别稀释到0. 4mM, ImM, 2mM,过滤 除菌。分别加1. 25mL到发酵8小时后的50mL的摇瓶中，使其终浓度为10、25以及50 μ Μ。样品处理及检测方法同实施例1结果表明当不同浓的过氧化氢添加后井R霉素产量与对照相比均有较大提高，当 过氧化氢添加浓度为25 μ M时效果最好井R霉素产量有37%左右的提高。实施例3采用的菌种吸水链霉菌井冈变种(Sti^ptomyces hygroscopicus var jingganggensis 5008)及其调节基因valPQ缺失及回补菌株。valPQ是井冈霉素合成基因 簇中的调节基因，当它缺失后井R霉素产量与对照相比会有所提高。本发明通过在该突变 株中添加过氧化氢，以期望进一步提高井R霉素的产量。菌种活化及种子培养同实施例1发酵培养同实施例1过氧化氢的添加将30%的过氧化氢稀释到ImM，过滤除菌。在发酵8小时分别添 加1. 25mL到吸水链霉菌井R变种野生菌株及valPQ缺失突变及回补菌株中，使其终浓度为25微摩尔。样品处理及检测方法同实施例1 (结果见表1)。结果如表1所示在野生型菌株中井网霉素产量有近40%的提高，在valPQ缺失 突变株中井R霉素产量又会有21%的提高。表1 在吸水链霉菌井R变种5008野生型及valPQ缺失突变及回补突变菌株中添
加过氧化氢对井R霉素合成的影响。
权利要求
一种基于过氧化氢的井冈霉素优化发酵方法，其特征在于，通过在吸水链霉菌井冈变种孢子的发酵培养阶段滴加过氧化氢溶液实现产量优化。
2.根据权利要求1所述的基于过氧化氢的井R霉素优化发酵方法，其特征是，所述的 吸水链霉菌井R变种孢子是指取吸水链霉菌井R变种孢子的悬液划线平板在37摄氏度 环境下培养5天。
3.根据权利要求2所述的基于过氧化氢的井R霉素优化发酵方法，其特征是，所述的 孢子悬液为零下20摄氏度保存的吸水链霉菌井R变种孢子悬液。
4.根据权利要求1所述的基于过氧化氢的井R霉素优化发酵方法，其特征是，所述的 发酵培养阶段是指将吸水链霉菌井R变种孢子接种于发酵培养液中并在30摄氏度、220 转速度下旋转培养24小时后发酵培养5天。
5.根据权利要求1所述的基于过氧化氢的井R霉素优化发酵方法，其特征是，所述的 接种是指以种子液发酵培养液为1 ο (ν/ν)的比例接种培养。
6.根据权利要求1所述的基于过氧化氢的井R霉素优化发酵方法，其特征是，所述的 滴加过氧化氢溶液是指将质量百分比为30%的过氧化氢稀释到ImM并过滤除菌后在发酵 培养过程的8-24小时时间段内滴加至浓度达到50微摩尔/升。
全文摘要
一种生物工程技术领域的基于过氧化氢的井冈霉素优化发酵方法，通过在吸水链霉菌井冈变种孢子的发酵培养阶段滴加过氧化氢溶液实现产量优化。本发明通过过氧化氢添加时间和浓度的优化使井冈霉素发酵产量提高40％左右，同时发酵周期也缩短一天，提高了设备利用率，降低了能耗。
文档编号C12P19/46GK101914600SQ201010264100
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者白林泉, 邓子新, 钟建江, 魏振华 申请人:上海交通大学