专利名称：一种山桐子的组织培养方法
技术领域：
本发明涉及到一种植物的组织培养方法，具体地说，是涉及山桐子(Idesia polycarpaMaxim.)的组织培养方法。
背景技术：
在现有技术中，没有有关山桐子组织培养方法的报道，山桐子现有繁殖方法是用种子繁殖，由于种子发芽率低，苗木质量参差不齐，无法达到良种壮苗的要求；同时该树种为雌雄异株，雌株的果实多观赏价值更高，而播种育苗雌雄混杂，分不清雌雄，通过组培的方法，可选择雌株进行大量繁殖。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山桐子组织培养的方法。
本发明的技术方案如下。
一种山桐子的组织培养方法，它基本上由下列步骤组成步骤1将培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒(120-125℃，1.1KG/CM2)20分钟待用，步骤2采用经选育的国内外优良的种源优良单株(生长速度快、果实多观赏价值高、抗逆性强)的腋芽茎段为外植体，经70％酒精消毒(30-45)秒，再用0.12％的升汞溶液消毒，(一般8-10分钟)，用无菌水冲洗4-5次，步骤3在超净的工作台上，无菌条件下，将消毒的外植体接种在步骤1的含有接种、启动培养基的玻璃瓶中，将其置于日光为光源、光照强度为1500-2000lx下，每日照光12小时，温度20-28℃、湿度为60％，培养35天，分化长成芽苗，步骤4将从步骤3中长成的芽苗，剪切，按步骤3接种于按步骤1的方法消毒的含有增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养，不断增殖，视繁殖生产需要100-2000瓶时进入下一步，步骤5将步骤4中培养的试管芽苗，剪切，按步骤3接种于按步骤1的方法消毒的含有壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养，30-35天后进入下一步，
步骤6将步骤5中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-5片叶片，按步骤3接种子按步骤1的方法消毒含有生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天，生根率达92％以上。
步骤7将步骤6中生长的带有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有砻糠灰∶黄心土＝1∶1(体积比)的基质中，浇透水，保持温度25-28℃，相对湿度80％以上，遮光(前10天)70％，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达85％以上，35-45天，全光照。
上述的接种、启动培养基为基本培养基添加噻苯隆(TDZ)至0.02-0.05毫克/升、添加6-苄基嘌呤(BA)至1.0-1.2毫克/升和添加α-萘乙酸(NAA)至0.05-0.2毫克/升，上述的增殖培养基为基本培养基添加TDZ至0.02-0.08毫克/升添加BA至1.5-2.5毫克/升和添加NAA至0.1-0.5毫克/升，上述的壮苗培养基为基本培养基添加TDZ至0.02-0.03毫克/升添加BA至0.8-1.2毫克/升和添加NAA至0.1-0.5毫克/升，上述的生根培养基为基本培养基添加NAA至0.3-0.5毫克/升和添加吲哚丁酸(IBA)至0.5-0.8毫克/升，上述的每升基本培养基中含有如下物质种类和质量硝酸钾(KNO3)600-800毫克，硝酸铵(NH4NO3)500-650毫克，二水氯化钙(CaCl2·2H2O)220-330毫克，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)200-370毫克，磷酸二氢钾(KH2PO4)75-90毫克，乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)49.8毫克，硫酸亚铁(FeSO4)37.1毫克，四水硫酸锰(MnSO4·4H2O)12毫克，七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)4.5毫克，硼酸(H3BO3)6.2毫克，碘化钾(KI)0.42毫克，二水钼酸钠(Na2MO4·2H2O)0.25毫克，五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025毫克，六水氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025毫克，盐酸硫胺素0.18毫克，烟酸1.0毫克，盐酸吡哆醇0.5毫克，肌醇80毫克，甘氨酸2毫克，蔗糖20毫克，卡拉胶6.5克。
本发明的特点在于；采用低盐浓度的培养液，在各培养阶段添加不同种类、浓度的植物生长调节剂，分别组成接种、启动培养基，增殖培养基，壮苗培养基，生根培养基等。整个培养周期35-40天，培养倍数大于4.5天，高度大于3.85cm，试管内生根率大于92％，试管苗炼苗移栽的成活率大于85％，可实现山桐子的大规模工厂化生产。
具体实施例方式
实施例1.山桐子的组织培养所用的基本培养基如下(每升中所含物质种类和质量)硝酸钾600毫升，硝酸铵500毫克，二水氯化钙220毫升，七水硫酸镁200毫克，磷酸二氢钾75毫克，乙二胺四乙酸二钠49.8毫克，硫酸亚铁37.1毫克，四水硫酸锰12毫克，七水硫酸锌4.5毫克，硼酸6.2毫克，碘化钾0.42毫克，二水钼酸钠0.25毫克，五水硫酸铜0.025毫克，六水氯化钴0.025毫克，盐酸硫胺素0.18毫克，烟酸1.0毫克，盐酸吡哆醇0.5毫克，肌醇80毫克，甘氨酸2毫克，蔗糖20毫克，卡拉胶6.5克，并最终调pH为5.8-6.0.
接种、启动培养基为上述基本培养基添加TDZ 0.02+BA 1.0+NAA 0.05(毫克/升)增殖培养基为上述基本培养基添加TDZ 0.02+BA 1.5+NAA 0.1(毫克/升)壮苗培养基为上述基本培养基添加TDZ 0.02+BA 0.8+NAA 0.1(毫克/升)生根培养基为上述基本培养基添加NAA 0.3+IBA 0.8(毫克/升)山桐子的组织培养方法由以下步骤组成步骤1将上述接种、启动培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒(120-125℃，1.1KG/CM2)20分钟，待用。
步骤2采用经选育的国内外引进的优良种源优良单株(生长速度快、果实多观赏价值高、抗逆性强)的腋芽茎段为外植体，经70％酒精消毒(30-45)秒，再用0.12％的升汞溶液消毒，(一般8-10分钟)，用无菌水冲洗4-5次。
步骤3在超净的工作台上，无菌条件下，将消毒的外植体接种在步骤1的含有培养基的玻璃瓶，将其置于以日光为光源，光照强度为1500-2000lx，每日照光12小时，温度20-28℃、湿度为60％的培养基中，培养40天，分化长成芽苗。
步骤4将从步骤3中长成的芽苗，剪切，按步骤3接种于按步骤1的方法消毒的含有增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养增殖倍数为4.8，不断增殖。视繁殖生产需要达100-2000瓶时，进入下一步。
步骤5将步骤4中培养的试管芽苗，剪切，按步骤3接种于按步骤1的方法消毒的含有壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养，40天高度为4.4CM，进入下一步。
步骤6将步骤5中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-5片叶片，按步骤3接种于按步骤1的方法消毒的含有生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养15天，生根率达94％。
步骤7将步骤6中生长的带有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有砻糠灰∶黄心土＝1∶1(体积比)的基质中，浇透水，保持温度25-28℃，相对湿度80％以上，遮光(前10天)70％，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达88％以上，35-45天后，全光照。
实施例2.山桐子的组织培养所用的基本培养基如下(每升中所含物质种类和质量)硝酸钾800毫升，硝酸铵650毫克，二水氯化钙330毫升，七水硫酸镁370毫克，磷酸二氢钾90毫克，乙二胺四乙酸二钠49.8毫克，硫酸亚铁37.1毫克，四水硫酸锰12毫克，七水硫酸锌4.5毫克，硼酸6.2毫克，碘化钾0.42毫克，二水钼酸钠0.25毫克，五水硫酸铜0.025毫克，六水氯化钴0.025毫克，盐酸硫胺素0.18毫克，烟酸1.0毫克，盐酸吡哆醇0.5毫克，肌醇80毫克，甘氨酸2毫克，蔗糖20毫克，卡拉胶6.5克，并最终调pH为5.8-6.0.
接种、启动培养基为上述基本培养基添加TDZ 0.05+BA 1.2+NAA 0.2(毫克/升)，增殖培养基为上述基本培养基添加TDZ 0.08+BA 2.5+NAA 0.5(毫克/升)，壮苗培养基为上述基本培养基添加TDZ 0.03+BA 1.2+NAA 0.5(毫克/升)，生根培养基为上述基本培养基添加NAA 0.5+IBA 0.5(毫克/升)，山桐子的组织培养方法由以下步骤组成步骤1将上述接种、启动培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒(120-125℃，1.1KG/CM2)20分钟，待用。
步骤2采用经选育的国内外引进的优良种源优良单株(生长速度快、果实多观赏价值高、抗逆性强)的腋芽茎段为外植体，经70％酒精消毒(30-45)秒，再用0.12％的升汞溶液消毒，(一般8-10分钟)，用无菌水冲洗4-5次。
步骤3在超净的工作台上，无菌条件下，将消毒的外植体接种在步骤1的含有培养基的玻璃瓶，将其置于以日光为光源，光照强度为1500-2000lx，每日照光12小时，温度20-28℃，湿度为60％的培养基中，培养35天，分化长成芽苗。
步骤4将从步骤3中长成的芽苗，剪切，按步骤3接种于按步骤1的方法消毒的含有增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养，增殖倍数为5.3，不断增殖，视繁殖生产需要100-2000瓶，进入下一步。
步骤5将步骤4中培养的试管芽苗，剪切，按步骤3接种于按步骤1的方法消毒的含有壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养，35天生长高度为4.2CM，后进入下一步，步骤6将步骤5中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-5片叶片，按步骤3接种于接步骤1的方法消毒的含有生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养12天，生根率达96.5％。
步骤7将步骤6中生长的带有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有砻糠灰∶黄心土＝1∶1(体积比)的基质中，浇透水，保持温度25-28℃，相对湿度80％以上，遮光(前10天)70％，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达92％以上，35-45天后，全光照。
权利要求
1.一种山桐子的组织培养方法，其特征是它基本上由下列步骤组成步骤1将培养基注入玻璃瓶中，经高温高压消毒待用，步骤2采用经选育的优良种源的优良单株的腋芽茎段为外植体，经酒精和升汞溶液消毒，用无菌水冲洗4-5次，步骤3无菌条件下，将消毒的外植体接种在步骤1的含有接种、启动培养基的玻璃瓶中，将其置于日光为光源、光照强度为1500-20001x下，每日照光12小时，温度20-28℃、湿度为60％，培养35天，分化长成芽苗，步骤4将从步骤3中长成的芽苗，剪切，按步骤3的方法接种于按步骤1的方法消毒的注入增殖培养基的玻璃瓶中，进行增殖培养，不断增殖，视繁殖生产需要100-1000瓶时，进入下一步，步骤5将步骤4中培养的试管芽苗，剪切，按步骤3的方法接种于按步骤1的方法消毒的注入壮苗培养基的玻璃瓶中，进行壮苗培养，30-35天后进入下一步，步骤6将步骤5中的试管壮苗，去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-5片叶片，接种于按步骤1的方法消毒的注入生根培养基的玻璃瓶中，进行生根培养10-15天，步骤7将步骤6中生长的带有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有体积比为砻糠灰∶黄心土＝1∶1的基质中，浇透水，保持温度25-28℃，相对湿度80％以上，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，35-45天后，全光照。上述的接种、启动培养基为基本培养基添加噻苯隆至0.02-0.05毫克/升、添加6-苄基嘌呤至1.0-1.2毫克/升和添加α-萘乙酸至0.05-0.2毫克/升，上述的增殖培养基为基本培养基添加噻苯隆至0.02-0.08毫克/升、添加6-苄基嘌呤至1.5-2.5毫克/升和添加α-萘乙酸至0.1-0.5毫克/升，上述的壮苗培养基为基本培养基添加噻苯隆至0.02-0.03毫克/升、添加6-苄基嘌呤至0.8-1.2毫克/升和添加α-萘乙酸至0.1-0.5毫克/升，上述的生根培养基为基本培养基添加α-萘乙酸至0.3-0.5毫克/升和添加吲哚丁酸至0.5-0.8毫克/升，上述的每升基本培养基中含有如下物质种类和质量硝酸钾600-800毫克，硝酸铵500-650毫克，二水氯化钙220-330毫克，七水硫酸镁200-370毫克，磷酸二氢钾75-90毫克，乙二胺四乙酸二钠49.8毫克，硫酸亚铁37.1毫克，四水硫酸锰12毫克，七水硫酸锌4.5毫克，硼酸6.2毫克，碘化钾0.42毫克，二水钼酸钠0.25毫克，五水硫酸铜0.025毫克，六水氯化钴0.025毫克，盐酸硫胺素0.18毫克，烟酸1.0毫克，盐酸吡哆醇0.5毫克，肌醇80毫克，甘氨酸2毫克，蔗糖20毫克，卡拉胶6.5克。
全文摘要
一种山桐子的组织培养方法，它基本上由下列步骤组成1.将培养基高温高压消毒待用，2.采用优良种源优良单株的腋芽茎段为外植体，经酒精和升汞溶液消毒，用无菌水冲洗，3.将消毒的外植体接种培养基中，置于人工提供的日光灯下，分化长成芽苗，4.将芽苗剪切，接种于增殖培养基中，进行增殖培养，5.将试管芽苗，剪切，接种于壮苗培养基中，进行壮苗培养，6.将试管壮苗去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3－5叶片，接种于生根培养基中，进行生根培养，7.将带有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有砻糠灰+黄心土的基质中，浇透水，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达85％以上，35－45天后，全光照。本发明方法可实现山桐子的大规模工厂化生产。
文档编号C12N5/04GK1802903SQ20061003780
公开日2006年7月19日 申请日期2006年1月16日 优先权日2006年1月16日
发明者蒋泽平, 梁珍海, 吴纲, 季永华, 刘根林, 朱学雷, 李玉巧, 李劲, 李淑琴, 杨勇, 仇曙光, 袁芳 申请人:江苏省林业科学研究院