专利名称：用于组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物反应器，具体地说涉及一种医学和组织工程学中体外构建软骨的气液两相生物反应器。
背景技术：
关节软骨主要由软骨细胞、蛋白多糖、胶原以及水分组成，其中蛋白多糖和胶原成分使关节软骨能够抵抗所受到的压力和张力。作为人体活动最频繁的关节软骨，其受损伤以及患关节炎的概率较高。由于关节软骨是无神经和无血管的组织，其自身修复能力很差，目前通常只能采用外科手术移植来治疗受损软骨，但因来源有限，很多患者难以得到治疗，因此，研究组织工程软骨日益迫切。
组织工程软骨的研究始于二十世纪八十年代，至今已开发出了多种具有临床价值的软骨替代物。理想的软骨替代物体内移植后除了能够修复软骨缺损外，还应该具有较好的力学性能。但对于尺寸较大的软骨损伤，构建支架内新的基质和细胞均匀连续分布的软骨替代物仍是一项很大的挑战。其主要原因在于构建大尺寸的软骨替代物需要良好的营养物及氧的传递，以及合适的培养力学环境。
为了能大规模制备组织工程软骨以满足临床需求，开发物质传递混合性能好且力学环境适宜的适用于体外构建人工软骨的生物反应器系统是组织工程软骨走向临床应用的必经之路。
Freed(L.E.Freed，G.Vunjak-Novakovic，J.C.Marquis and R.Langer.Kinetics ofChondrocyte Growth in Cell-Polymer Implants.Biotechnology and Bioengineering，1994(43)，597-604.)采用传统的转瓶，将细胞接种到PGA多孔材料上静态培养9天后，转移到转瓶中在85rpm转速下培养6周。但这种培养方法气液界面更新较慢，氧传递速率很低，并且由于湍流涡旋的作用会在材料表面形成絮状结构，影响基质在材料上的沉积。
此外，Freed(L.E.Freed，A.P.Hollander，et al.Chondrogenesis in aCell-Polymer-Bioreactor System.Experimental Cell Research，1998(240)，58-65.)还采用NASA开发的旋转壁式反应器构建工程化软骨。该类型反应器尽管能提供较好的物质传递性能和合适的力学刺激，但是由于该反应器的流场特性决定了其组织生长并不均匀，培养较长时间形成的组织替代物与材料的初始形状差别很大，同时受反应器空间尺寸限制，实际生产时放大能力有限，目前主要供实验室研究使用。
Nastaran Mahmoudifar(Nastaran Mahmoudifar，Pauline M.Doran.Tissue Engineeringof Human Cartilage in Bioreactors Using Single and Composite Cell-Seeded Scaffolds.Biotechnology and Bioengineering，2005(91)，338-355.)采用灌注式反应器构建工程化软骨。该反应器在培养初期能够提供良好的营养物质以及氧的传递以及足够的剪切力刺激，同时能够及时将代谢产物排放出来。但培养后期由于细胞生长和基质分泌，细胞—支架复合物内部因灌注速率较低造成局部营养缺乏，若提高灌注速率则会使剪切力过大，导致细胞坏死，基质脱落，不利于组织形成。
可见，目前用于软骨组织体外构建的生物反应器均存在营养物质传递混合效果差、缺乏必要的力学环境、不利于放大和规模化制备等缺点，不能满足组织工程软骨的体外构建需要，因此开发能很好地模拟体内力学环境，并具有良好的物质传递和混合效果的生物反应器，对体外构建功能化软骨组织是十分重要的。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种用于组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统，以克服现有技术在规模化、大尺寸构建组织工程软骨中存在的的缺欠，以满足临床应用的需求。
本发明的技术构思是这样的通过调节反应器内培养基的装液量，使反应器中下部为液体培养，上部为新鲜空气，当将细胞—材料复合物置于反应器内，由磁力搅拌装置带动旋转，使该复合物交替进入液相和气相。由于材料在液相和气相中其内部浸润的液体所受合力不一样(如重力、离心力以及浮力)，促进材料内部的液体在多孔介质尺度上的微观流动，有利于代谢物质的排放和营养以及氧的传递；同时材料和细胞复合物在液相和气相中其所受到的剪切力也是交替变化的，这与人体内的关节软骨所受到的力学环境类似，有利于细胞分泌胞外基质，使制备出的软骨组织更接近天然的组织学结构和生理功能。本发明的生物反应器，还可通过培养基灌注和气体控制系统，保持培养环境稳定，有利于规模化构建组织工程软骨。此外，本发明的生物反应器系统还具有放大简单的特点，不仅可以放大单个反应器的尺寸，增大制备的软骨尺寸，还可由多个反应器并联，实现产品数量的增加，因此，可以从真正意义上实现体外大规模生产软骨组织。
本发明的软骨体外构建用两相生物反应器系统至少包括两相生物反应器、加液装置、供气装置、收液装置和检测装置；所说的两相生物反应器包括设有上盖的封闭容器；设置在封闭容器一端的下部的液体入口；设置在封闭容器另一端底部的液体出口；设置在封闭容器一端的上部的气体入口；设置在封闭容器另一端顶部的气体出口；加液装置与液体入口相连通；供气装置与气体入口相连通；收液装置与液体出口相连通；水平设置在封闭容器中的旋转轴，其两端与封闭容器的内壁U型凹槽连接，转子固定于旋转轴的一端，细胞材料复合物固定于旋转轴上；设置在封闭容器转子一端外的磁力搅拌装置；检测装置分别与加液装置与收液装置相连接；本发明的系统是这样使用的反应器内装液量为反应器体积的一半，液体上方为空气，将用于软骨构建的支架材料或细胞材料复合物垂直并排固定在旋转轴上，并通过磁力搅拌装置旋转，使支架材料或者细胞材料复合物在旋转轴的驱动下交替进入液相和气相。
本发明的反应器系统结构简单、易于放大，可进行湿热灭菌，能长时间维持无菌环境，有利于软骨的体外构建。
图1为两相生物反应器主体的结构示意图。
图2为体外软骨构建用两相生物反应器系统整体结构组成示意图。
具体实施例方式
参见图1和图2，本发明的软骨体外构建用两相生物反应器系统至少包括两相生物反应器、加液装置、供气装置、收液装置和检测装置；所说的两相生物反应器包括
设有上盖4的封闭容器11；设置在封闭容器11一端的下部的液体入口2；设置在封闭容器11另一端底部的液体出口9；设置在封闭容器11一端的上部的气体入口1；设置在封闭容器11另一端顶部的气体出口6；液体入口2和气体入口1设置在封闭容器11同一端，液体出口9和气体出口6设置在封闭容器11另一端；水平设置在封闭容器11中的旋转轴5，其两端与封闭容器11的内壁U型凹槽连接，转子7固定于旋转轴5的一端，细胞材料复合物3固定于旋转轴5上；设置在封闭容器11内转子7一端外的磁力搅拌装置8；设置在封闭容器11底部的支撑装置10，用于支撑封闭容器11。
加液装置与液体入口2相连通；供气装置与气体入口1相连通；收液装置与液体出口9相连通；检测装置分别与加液装置与收液装置相连接；由图2可见，所说的加液装置包括加液蠕动泵15和与其相连接的加液储液瓶18，加液储液瓶18通过管线与两相生物反应器的液体入口2相连通，设置在加液储液瓶18和加液蠕动泵15之间管路上的加液控制阀16，用于控制加液量；所说的供气装置包括依次相互连接的空气泵12、空气流量计13和空气过滤器14，空气过滤器14与两相生物反应器的气体入口1相连接；所说的收液装置包括收液蠕动泵20、收液储液瓶23和收液控制阀19，收液蠕动泵20的进口与两相生物反应器的液体出口9相连通，收液蠕动泵20的出口与收液储液瓶23的入口相连通，收液控制阀19设置在收液储液瓶23与储液蠕动泵20之间的管线上，用于控制收液量；所说的检测装置包括插在加液储液瓶18、收液储液瓶23中的溶氧电极17和收液储液瓶23中的pH电极22，溶氧电极17和pH电极22分别与溶氧测定仪和pH测定仪连接，以检测和控制加液储液瓶18、收液储液瓶23中培养基的溶氧浓度和pH。
权利要求
1.一种用于组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统，至少包括两相生物反应器、加液装置、供气装置、收液装置和检测装置，其特征在于，所说的两相生物反应器包括设有固定的旋转轴，可用于固定软骨构建的支架材料或细胞材料复合物，并通过磁力搅拌装置旋转，使支架材料或者细胞材料复合物在旋转轴的驱动下交替进入液相和气相。
2.根据权利要求1所述的用于组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统，其特征在于，所说的两相生物反应器包括设有上盖(4)的封闭容器(11)；设置在封闭容器(11)一端的下部的液体入口(2)；设置在封闭容器(11)另一端底部的液体出口(9)；设置在封闭容器(11)一端的上部的气体入口(1)；设置在封闭容器(11)另一端顶部的气体出口(6)；水平设置在封闭容器(11)中的旋转轴(5)，其两端与封闭容器(11)的内壁U型凹槽连接，转子(7)固定于旋转轴(5)的一端，转子(7)与封闭容器(11)的另一端的内壁相连接；设置在封闭容器(11)设有转子(7)一端外的磁力搅拌装置(8)；加液装置与液体入口(2)相连通；供气装置与气体入口(1)相连通；收液装置与液体出口(9)相连通；检测装置分别与加液装置与收液装置相连接。
3.根据权利要求1所述的用于组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统，其特征在于，所说的两相生物反应器的液体入口(2)和气体入口(1)设置在封闭容器(11)同一端，液体出口(9)和气体出口(6)设置在封闭容器(11)另一端。
4.根据权利要求1所述的用于组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统，其特征在于，所说的加液装置包括加液蠕动泵(15)和与其相连接的加液储液瓶(18)，加液储液瓶(18)通过管线与两相生物反应器的液体入口(2)相连通，设置在加液储液瓶(18)和加液蠕动泵(15)之间的管路上的加液控制阀(16)。
5.根据权利要求1所述的用于组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统，其特征在于，所说的供气装置包括依次相互连接的空气泵(12)、空气流量计(13)和空气过滤器(14)，空气过滤器(14)与两相生物反应器的气体入口(1)相连接。
6.根据权利要求1所述的组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统，其特征在于，所说的收液装置包括收液蠕动泵(20)、收液储液瓶(23)和收液控制阀(19)，收液蠕动泵(20)的进口与两相生物反应器的液体出口(9)相连通，收液蠕动泵(20)的出口与收液储液瓶(23)的入口相连通，收液控制阀(19)设置在收液储液瓶(23)与储液蠕动泵(20)之间的管线上。
7.根据权利要求1所述的组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统，其特征在于，所说的检测装置包括插在加液储液瓶(18)、收液储液瓶(23)中的溶氧电极(17)和收液储液瓶(23)中的pH电极(22)，溶氧电极(17)和pH电极(22)分别与溶氧测定仪和pH测定仪连接。
8.根据权利要求1～7任一项所述的组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统的应用方法，其特征在于，反应器内装液量为反应器体积的一半，液体上方为空气，将用于软骨构建的支架材料或细胞材料复合物垂直并排固定在旋转轴上，并通过磁力搅拌装置旋转，使支架材料或者细胞材料复合物在旋转轴的驱动下交替进入液相和气相。
全文摘要
本发明公开了一种用于组织工程软骨体外构建的两相生物反应器系统，包括加液装置、两相生物反应器、收液装置和供气装置；加液装置与两相生物反应器的液体进口相连接，收液装置与两相生物反应器的液体出口相连接，供气装置通过管线与两相生物反应器的气体入口相连通；装液体积为反应器体积的一半，培养基上方为空气，将用于组织工程软骨构建的支架材料或细胞—材料复合物垂直并排固定于反应器内的旋转轴上，使支架材料或细胞—材料复合物交替进入液相和气相。本发明的反应器系统结构简单、易于放大，可进行湿热灭菌，能长时间维持无菌环境，可应用于体外规模化构建组织工程软骨。
文档编号C12N5/08GK1974750SQ20061011840
公开日2007年6月6日 申请日期2006年11月16日 优先权日2006年11月16日
发明者江华, 谭文松, 周燕, 陈亭 申请人:华东理工大学