专利名称：三分三莨菪碱6β-羟化酶基因及其编码的蛋白质和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，特别是涉及在三分三中表达的莨菪碱6P-羟化酶 基因、蛋白及其应用。
背景技术：
莨菪烷生物碱主要是从茄科植物如莨菪及三分三T AA /SOCf〃SacuteA gu/us^等植物中提取到的，在医用方面是作用于副交感神经系统的抗胆碱药，具有麻醉、解痉、止痛的功能。此外,还具有改善微循环的作用，临床 上可用于治疗微循环障碍性疾病。由于我国学者的努力，莨菪烷生物碱的临床应用遍及内科、外科、妇产科、神经科、皮肤科、耳鼻喉科等，能治疗100 多种疾病，市场需求十分巨大。莨菪碱(外消旋体阿托品)和东莨菪碱是结构相 关的两类莨菪烷生物碱，由于两者对中枢神经系统有不同的作用，目前在国内 外市场上东莨菪碱的需求量是莨菪碱的10倍，而东莨菪碱在资源植物中的含 量比莨菪碱低得多，如莨菪中的东莨菪碱的含量只有万分之几。因此，东茛菪碱的价格也远远高于莨菪碱(约为10倍)，致使其在临床上的应用受到r极大的限制。近年来基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技 术提高东莨菪碱含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将东莨菪碱 生物合成途径中的关键酶基因导入资源植物中，获得转基因植株，并进行大 规模的培养，是实现从根本上提高东莨菪碱含量的最佳途径之一。由于莨菪碱6(3-羟化酶(Hyoscyamine邻-Hydroxylase, H6H)是整个东莨 菪碱生物合成途径中最后一步的催化酶,也是最为关键的一个酶，它通过两步连续反应催化莨菪碱转变成更有价值的东莨菪碱。因此，克隆莨菪碱6p-羟化酶的编码基因并利用基因工程技术来提高药用植物如三分三等中莨菪碱6(3-羟化酶的活性或含量，从而提高转基因植物如三分三中东莨菪碱的含量，这 有着十分重要的医学价值。在对现有文献的分析中，The Journal of Biological Chemistry (生物化学 杂志)，1991， 266(7): 46484653报道了从莨菪中克隆了莨菪碱6j3-羟化酶基 因，但至今尚未有任何从我国云南特有的药物植物三分三中分离克隆出莨菪 碱6p-羟化酶基因的文献报道。由于这个基因编码的酶催化东莨菪碱合成的最 后一步并对东莨菪碱的合成效率具有决定性影响，因此，这一步是利用基因 工程技术来调控东莨菪碱生物合成的重要切入点。发明内容所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种三分三莨菪碱6(3-羟化酶基因及 编码的蛋白与用途，以填补尚未有任何从我国云南特有的药物植物三分二中 分离克隆出莨菪碱6p-羟化酶基因的空白，克服三分三中东茛菪碱有效成分较 低的缺陷。发明提供三分三莨菪碱6(3-羟化酶的核苷酸序列、包含所说基因的 融合基因构建体、携带该构建体的新的重组表达载体、所说的表达载体转化 的植物细胞、以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代(包括 植物种子及植物组织)，所获得的转基因植物将具有显著提高的东莨菪碱含技术方案本发明的技术方案之一是提供一种莨菪碱6(3-羟化酶基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的 同源序列，或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。本发明的技术方案之二是提供一种三分三莨菪碱6p-羟化酶蛋白质，由i: 述的基因序列所编码。其优选方案为，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明的技术方案之三是提供一种含有上述技术方案之一的三分三良菪 碱6p-羟化酶基因全序列或部分片段的质粒。本发明的技术方案之四是提供一种含有上述技术方案之一的三分三茛菪 碱6p-羟化酶基因全序列或部分片段的植物表达载体。本发明的技术方案之五是提供一种宿主细胞，该细胞含有上述技术方案 之一或之三或之四中任一项所述的基因序列。优选所说的细胞为大肠杆菌细 胞，或者优选为农杆菌细胞，或者优选为三分三发根细胞。本发明的技术方案之六是提供一种三分三莨菪碱6p-羟化酶基因的应用， 包括用技术方案之四所述的植物表达载体转化三分三细胞、或者用上述的农 杆菌与三分三细胞共培养、或者用上述的含有所述基因序列的三分三发根细 胞培育雄性不育植株。或者，技术方案之六也可以是提供一种转基因三分三， 该三分三含有所述的莨菪碱6(3-羟化酶基因序列。具体而言，本发明的技术方案中涉及的概念的定义如下在本发明所说的三分三茛菪碱6(3-羟化酶基因的DNA分子包括编码具 有三分三茛菪碱6(3-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列 与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第125-1159位的核苷酸序列有至少70%的同源 性；或者所述的核苷酸序列能在40—55"C条件下与SEQ ID NO. 1中从核苷较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO. 1屮 从核苷酸第125-1159位的核苷酸序列。本发明分离出的三分三莨菪碱6(3-羟化酶多肽包括具有SEQ ID NO. 2 氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。 较佳地，该多肽是具有SEQIDNO. 2序列的多肽。本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，"分离的"、"纯化的"DNA是指，该DNA或片段已从天然状 态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态，.伴 随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，术语"三分三莨菪碱6P-羟化酶(或多肽)基因"指编码 具有三分三莨菪碱6p-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1屮 第125-1159位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的编码框第125-1159位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨 基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 1中第125-1159位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编 码出SEQ ID NO. 2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO. 1 中从核苷酸第125-1159位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第125-1159位的核苷酸序列的同源性至少70。/。，较佳 地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。还包括能编 码具有与天然的三分三莨菪碱6p-羟化酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若千个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、 插入和/或取代，以及在5，和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为 30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，术语"三分三莨菪碱6p-羟化酶蛋白或多肽"指具有二分 三莨菪碱6(3-羟化酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与 天然三分三莨菪碱6P-羟化酶相同功能的SEQ ID N0.2序列的变异形式。这 些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更 佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端 和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳 地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行 取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加^ 个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括三分三莨菪碱 6(3-羟化酶的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动 子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。本发明的三分三莨菪碱6p-羟化酶多肽的变异形式包括同源序列、保守 性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件F 能与三分三莨菪碱6p-羟化酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用三 分三莨菪碱6p-羟化酶多肽的血清获得的多肽或蛋白。在本发明中三分三莨菪碱6p-羟化酶保守性变异多肽指与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基 酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1.保守性变异多肽中的取代残基最初的残基代表性的取代优选的取代Ala (A)Val; Leu; lieValArg (R)匕ys; Gin; AsnLysAsn (N)Gin; His; Lys; ArgGinAsp (D)GluGluCys (C)SerSerGin (Q)AsnAsnGlu (E)AspAspGly (G)Pro; AlaAlaHis (H)Asn; Gin; Lys; ArgArgHe (I)Leu; Val; Met; Ala; Phel_euLeu (L)lie; Val; Met; Ala; PhelieLys (K)Arg; Gin; AsnArgMet阔Leu; Phe; lieLeuPhe (F)Leu; Val; lie; Ala; TyrLeuPro (P)AlaAlaSer (S)ThrThrThr (T)SerSerTrp (W)Tyr; PheTyrTyr (Y)Trp; Phe; Thr; SerPheVal (V)lie; Leu; Met; Phe; AlaLeu发明还包括三分三莨菪碱6(3-羟化酶或多肽的类似物。这些类似物与天然莨菪碱6P-羟化酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序 列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变 异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产 生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还 包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天 然存在的或合成的氨基酸(如(3、 y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽 并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进 一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴 露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式 还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序 列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域己知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的三分三莨菪碱6P-羟化酶多肽时，可以将三分三良菪 碱6p-羟化酶基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成三分三 莨菪碱6(3-羟化酶表达载体。如本发明所用的"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某 些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA 作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操 作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编 码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地 连于编码序列。 一般，"可操作地连于"意味着相邻，而对于分泌前导序列则意 味着在阅读框中相邻。在本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包 括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。还可用Northern印迹法技术分析三分三莨菪碱6|3-羟化酶基因产物的表 达，即分析三分三莨菪碱6(3-羟化酶的RNA转录物在细胞中的存在和数量。此外，本发明中可用作探针的核酸分子通常具有三分三莨菪碱6p-羟化酶 核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码三分三莨菪碱6P-羟化酶的核酸分子' 本发明涉及检测样品中是否存在三分三莨菪碱6p-羟化酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于三分三莨菪碱6p-羟化酶核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的三分三莨菪碱6P-羟化酶核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选三分三莨菪碱6p-羟化酶源基因或同源蛋白。为了得到与三分三莨菪碱6p-羟化酶基因相关的三分三cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选三分三cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P 对三分三莨菪碱6(3-羟化酶基因的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合 于筛选的cDNA文库是来自三分三的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织 的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA 文库也可以购买到，例如购自Clontech， Stratagene, Palo Alto, Cal.。这种筛 选方法可以识别与三分三茛菪碱6(3-羟化酶的基因家族的核苷酸序列。本发明的三分三莨菪碱6p-羟化酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本 发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市 售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模 板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969) Solid-Phase P印tide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield丄(1963)丄Am Chem. Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City, CA)来自动合成肽。可以分别化 学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。 利用本发明的三分三莨菪碱6p-羟化酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与 三分三莨菪碱6(3-羟化酶发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。有益效果本发明提供的莨菪碱6p-羟化酶基因是首次从三分三中克隆制备的，可以 通过基因工程技术用来提高三分三等植物中东莨菪碱的含量，结果显示，转 基因组织中东莨菪碱的提高效果显著。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授 的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形 式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如
Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
三分三莨菪碱6p-羟化酶基因的克隆
1. 组织分离(isolation)
三分三植株来源于云南丽江，采取幼嫩根后立即置于液氮中冷冻保存。
2. RNA的分离(RNA isolation)
取部分组织用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后， 再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents, G旧CO BRL, USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在 分光光度计上测定RNA含量。
3. 基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA) 根据莨菪及其它茄科植物的H6H氨基酸保守序列,设计简并引物,利用同
源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全 长克隆，分三个阶段进行 (1)3'-RACE
PCR (UPM+F2)得到AaH6HF2'(876bp)，回收,连接到T-Easy载体上， 用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye， Perkin-曰mer, USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer, USA)上进行测序。测序结果 用GCG软件包(Wisconsin group, USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有200610118927.0
的数据库(Genebank+EMBL),知其核酸序列及编码蛋白与已知莨菪碱6|3-羟 化酶基因(如莨菪莨菪碱6p-羟化酶等)的同源性很高，故初步认为它是一个良 菪碱6(3-羟化酶基因。 (2) 5'-RACE
根据3'RACE结果，设计反向特异引物R2，经PCR (UPM+R2)得到 AaH6HR2' (647bp)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或 T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye， Perkin-Elmer, USA)的方法， 在ABI 377测序仪(Perkin-曰mer, USA)上进行测序。将测序结果与3'RACE 结果比序并进行拼接，得到全长片段序列。
(3)将5'RACE测序结果与3'RACE测序结果比序并进行拼接，得到全 长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增AaH6H编码区 (AaH6HKF1+AaH6HKR1)得到AaH6H编码区(1032bp)(过程同步骤(1))。
BLAST的结果证明从三分三中新得到的基因确为一个莨菪碱邻-羟化酶 基因。由于已知的同源的来源于莨菪的莨菪碱邻-羟化酶基因具有提高东茛菪 碱的功能(Hashimoto等，1994; Sato等，2001)，故推测此基因具有相同 的功能。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的三分三AaH6H蛋白的全长编 码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引 物AaH6HF1:5'國ACAGAAAATTAGAGCAGTGTTCTC-3'(SEQ ID N0.3)为正 向引物，寡核苷酸AaH6HR1:5'-AACACAAAGAAACAATAAGACATA-3'(SEQ IDN0.4)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR 条件为94°C 5分钟，随之以94°C 1分钟、60°C 1分钟和72°C 2分钟进行35个循环，最后以72。C延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增 片段长度为1364bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得 SEQ ID NO. 1所示的序列。
实施例2
三分三莨菪碱6p-羟化酶基因的序列信息与同源性分析 本发明新的三分三莨菪碱6p-羟化酶全长cDNA的长度为1364 bp,详细 序列见SEQ ID NO. 1 ，其中开放读框位于125-1159位核苷酸。根据全长cDNA 推导出三分三莨菪碱6p-羟化酶的氨基酸序列，共344个氨基酸残基，分子量 38.769KD, pl为5.09。详细序列见SEQ ID NO. 2。
将三分三莨菪碱6p-羟化酶的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST 程序在Non-redundant GenBank +EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+ SwissProt+Superdate+PIR数据库中进 行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与莨菪H6H基因(GenBank Accession No.M62719)具有92%的同源性(见表2);在氨基酸水平上，它与 莨菪H6H(GenBank Accession No.ABG89397)的第1-344位氨基酸残基有 890/。的相同性和95%的相似性(见表3)。由上可见，三分三莨菪碱6|3-羟化酶 基因与莨菪莨菪碱6p-羟化酶基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的 同源性，故可以认为三分三莨菪碱6(3-羟化酶在提高资源植物中东莨菪碱的含 量上也具有相似的作用。
表2.本发明的三分三AaH6H与莨菪(Hyoscyamus niger) Hn H6H
的核苷酸序列的同源比较(GAP)表
Query 125ATGGCTACTCTTGTCTCAAATTGGTCTACTAACMTGTTTCTGAMGCTTTAAAGCACCA 184Sbjct 45
104
Query 185 TTAGAGAAMGGGCAGAAAAGGACGTTCCTTTAGGAMTGATGTCCCTATCATTGATCT(: 244 Sbjct 105TTACAGAAAAGAGCAGAAAAAGATGTTCCCGTAGGAMTGATGTCCCTATTATTGATCTC 164
Query 245CAACMGATCACCATCTTGTTGTTCMCAAATCACCAMGCTTGTCAAGATTTTGGTCT(: 3(M
lim HI1 HHMU i'卜，i;i丄i !'
Sbjct 165CAACMCATCATCATCTTCTTGTTCAACAMTCACCAAAGCTTGTCAAGATTTTGGTCT(: 224
Query 305 TTTCAGGTGATCMCCATGGATTTCCAGAAAAGCTAATGGCAGAGACAATGAAAGTGTGC 364 Sbjct 225TTTCAGGTGATCAATCATGGATTTCCAGAAGAACTAATGTTAGAGACAATGGAAGTGTG(: 284
Query 365 MAGAGTTTTTTGCACTGCCTGCTGAGGAGAMGAAMGCTTCAGCCAMAGGAAAGCCA 424 Sbjct 285AAAGAGTTCTTTGCACTGCCAGCTGAGGAAAAGGAAAAGTTTMGCCAMAGGAGAGGCA 344
Query 425 GCTMATTTGMCTTCCTCTCGAGCAGAAAGCAAAGCTATATATTGAAGGAGAACAACTC 484 Sbjct 345GCTAAATTTGAACTTCCTCTTGAGCAGAAAGCAAAGCTATATGTTGAAGGAGAACAACTC 404
Query 485 TCTAACGGGGAGCTCTTT，CTGGAAAGACACTTTGGCTCATGGTTGTCATCCTCTGGAT 54.4 Sbjct 405 TCTAACGAGGAGTTCTTATACTGGMAGACACTTTGGCTCATGGTTGTCATCCTCTTGAT
Query 545 GAAGAGTTAGTCAACTCCTGGCCTGAAAAACCAGCAACATATAGAGAGGTGGTGTCTAAA 6()4 Sbjct 465CAAGACTTAGTCAATTCCTGGCCTGAAAAACCAGCAAMTATAGAGAGGTGGTTGCTAAA 524
Query 605 TATTCAGTGGAAGTGAGGMGTTGACCATGAGGATGCTCGACTATATCTGTGMGGACTT 6M Sbjct 525TATTCAGTAGMGTGAGGMGTTGACCATGAGGATGCTGGACTACATCTGTGAAGGACTT 584
Query 665GGGCTTAMTTGGGTTACTTTGATMTGAGCTTAGCCAMTTCAGATGATGCTGGCTMC 724
mm!iii!hi mi::!:n卜'i'mm imm: n1
Sbjct 585GGGCTTAMTTGGGCTACTTTGATAATGAACTTAGCCAAATTCAGATGATGCTGACTAAC 64.4
Query 725 TATTACCCACCATGTCCAGACCCAAGTTCMCATTGGGTTCAGGAGCACACTATGATGGT 784 Sbjct 645TATTACCCACCATGCCCAGACCCAAGTTCMCATTGGGATCAGGAGGACACTATGATGGT 7(M
Query 785MCGT|ATMCTTTGCT，MCAAGACTTGCCTGGTTTG(^ACAACTTATTGTTAAGGAT 844
15Sbjct 705AACCTTATMCTTTGCTTCAACAAGACTTGCCTGGTTTGCAACMCTCATTGTTAAGGAT 764
Query 845GACMCTGGATTGCTGTTGMCCTATCCCTACTGCTTTTGTGGTCMTTTGGGATTGACT 904
. I I 111! 11111 i 111 I i! I i; i I」；ii i: s I: ; I i: i i i! i!: i;: i:!(:..
Query 905TTAAAGGTTATTACCAATGMMGTTTGAAGGTTCTATCCATAGGGTGGTGACMATCCA 964
immi!iummm出Mi.h ":u:出imM h出
Sbjct 825CTAAAGGTTATTACCAATGAAAAGTTTGAAGGTTCTATCCATAGGGTAGTGACAGATCCA 884
Query 965ACAAGAGACAGGGTTTCMTTGCCACTTTGATTGGTCCTGATTATTCTTGTACCATTGM 1024
MMiiimmm!mm mm;:iU;Mmmi; mhim h
Sbjct 885ACAAGAGACAGGGTTTCAATTGCTACTTTGATTGGTCCTGATTATTCATGTACCATTGM 944
Query 1025 CCTGCTAAAGAACTACTCAGCCMGACAACCCCCCACTCTACAAACCTTATCCATATGCT 1084
Sbjct 945
Query 1085 GAGTTTGCTGAGATTTACCTAAGTGACAAATCAGGCTATGATGCTGGTGTTMGCCATAT 1144
iii!mmi !im mum m!:!!: ;mm mm:MhH:H
Sbjct 1005 GAGTTTGCTGACATTTATCTAAGTGATAAATCAGACTATGATTCTGGTGTTAAGCCATAT 1064 Query 1145 AAAATCAATGCCTMGCAAATMGTTAATATATT 1178 Sbjct 1065 AAAATCAATGTCTAAGCAAATMCTTAATATATT 1098
其中，Query表示三分三AaH6H的核酸序列；Sbjct表示莨菪HnH6H的核酸序列 (GenBankAccession No.M62719)。
结果在1054个核苷酸的比对中两者有92%的相似性。
表3.本发明的三分三的莨菪碱6(3-羟化酶与莨菪的莨菪碱6p-羟化酶
氨基酸序列的同源比较(FASTA)表
Query 1 MATLVSNWSTNNVSESFKAPLEKRAEKDVPLGNDVPIIDLQQDHHLVVQQITKACQDF(;L 60
MAT VSNWST +VSESF APL+KRAEKDVP+GNDVPIIDLQQ HHL+VQQITKACQDFGL Sbjct 1 MATFVS丽STKSVSESFIAPLQKRAEKDVPIGNDVPI:IDLQQHHHLLVQQITKACQDF(;L 60
Query 61FQVINHGFPEKLMAETMKVCKEFFALPAEEKEKLQPKGKPAKFELPLEQKAKLYIEGEQL 120
FQV丽GFPE+LM ETM+VCKEFFALPAEEKEK +PKG+ AKFELPLEQ認LY+EGEQL Sbjct 61FQVINHGFPEELMLETMEVCKEFFALPAEEKEKFKPKGEAAKFELPLEQKAKLYVEGEQL 120
16Query121SNGELFYWKDTLAHGCHPLDEELVNSWPEKPATYREVVSKYSVEV亂TMRMLDYICEGL180
SN E YWKDTLAHGCHPLD++LVNSWPEKPA YREVV+KYSVEVRKLTMRMLDYICEGL
Sbjct121SNEEFLYWKDTLAHGCHPLDQDLVNSWPEKPAKYREVVAKYSVEVRKLTMRMLDYICEGL180
Query181GLKLGYFDNELSQIQMMLANYYPPCPDPSSTLGSGAHYDGNVITLLQQDLPGLQQLIVK1)240
GLKLGYFDNELSQ顯L NYYPPCPDPSSTLGSG HYDGN+ITLLQQDLPGLQQLIVKD
Sbjct181GLKLGYFDNELSQIQMMLTNYYPPCPDPSSTLGSGGHYDGNLITLLQQDLPGLQQLIVKD240
Query241DNWIAVEPIPTAFVVNLGLTLKVITNEKFEGSIHRVVTNPTRDRVSIATLIGPDYSCTIE300
WIAV+PIPTAFVVNLGLTLKVITNEKFEGSI冊VVT+PTRDRVSIATLIGPDYSCTIE
Sbjct241ATWIAVQPIPTAFVVNLGLTLKVITNEKFEGSI冊VVTDPTRDRVSIATLIGPDYSCTIE300
Query301PAKELLSQDNPPLYKPYPYAEFAEIYLSDKSGYDAGVKPYKIN 343
PAKELL+QDNPPLYKPY Y+EFA+IYLSDKS YD+GVKPYKIN
Sbjct301PAKELLNQDNPPLYKPYSYSEFADIYLSDKSDYDSGVKPYKIN 343
其中，Query表示三分三AaH6H的核酸序列；Sbjct表示莨菪HnH6H的核酸序列 (GenBankAccession No. ABG89397);相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
结果在343个氨基酸的比对中，两者分别有89%的相同性和95。/。的相似性。
实施例3
三分三莨菪碱6p-羟化酶或多肽在大肠杆菌中进行原核表达及提纯 在该实施例中，将全长的三分三AaH6H编码序列或片段构建入商品化的 蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。 原核表达载体的构建以及转化大肠杆菌
根据三分三AaH6H的核苷酸序列，设计扩增出蛋白编码区的引物，并在 正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)， 以便构建表达载体'。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后， 将三分三AaH6H基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体
17(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌BL21 ，筛选鉴 定得到含有pET32a(+)-AaH6H表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-AaH6H。 表达Trx-AaH6H重组蛋白的工程菌的分离鉴定
挑取单菌落的BL21- pET32a(+)-AaH6H工程菌于3mL含100 ng/mL氨
苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1: 100的浓度吸取培养液于新的 LB培养基(含100 ^g/mL氨苄青霉素)中培养约3小时，至006()()达0.5后， 加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37 i:分别培养0， 1， 2， 3小时。取培 养时间不同的1mL菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2xSDS上样缓冲 液50pL，蒸馏水45pL， 二巯基乙醇5(iL)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分 钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12。/。SDS-PAGE胶中电泳。染色后观 察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达 Trx-AaH6H融合蛋白的工程菌。
Trx-AaH6H融合蛋白的提取纯化
按上述方法诱导表达Trx-AaH6H融合表达蛋白的工程菌 BL21-pET32a(+)-AaH6H，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen) 的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可 用溶解缓冲液(50mM CAPS， pH 110,0.3% N-lauroylsarcosine)来溶解，再用 透析缓冲液(200mMTris-HCI,pH8.5沐透析。然后用组氨酸结合(His'Bind) 树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole, 500mM NaCI， 20mM Tris-HCI pH 7.9 )洗脱来收集Trx-AaH6H融合蛋白。融合蛋白经肠激酶2CTC 酶切16小时后即可分离获的AaH6H的表达蛋白。200610118927.0
实施例4
三分三莨菪碱6p-羟化酶或多肽在三分三中进行真核细胞表达及转基因
发根中东莨菪碱含量测定
含目的基因(三分三莨菪碱6(3-羟化酶基因)的表达载体的构建,根据三分 三莨菪碱6p-羟化酶的全长序列(SEQ ID NO. 1)，设计扩增出完整编码阅读框 的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载 体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR 扩增后，将三分三莨菪碱6p-羟化酶基因cDNA克隆至中间载体(如 pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的 pCAMBIA1304)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其 转入农杆菌中，遗传转化资源植物三分三。利用发根农杆菌Ri质粒介导的三 分三的遗传转化
1) .发根农杆菌C58C1。使用前自冰箱取出,传代2次，传代用固体培养基 为YEB培养基。菌种在使用前接种于YEB液体培养基中,28t:培养过夜。
2) .经种子萌发生长8周左右的三分三的无菌嫩叶片。
3) .经过夜培养的菌液,用转化液稀释为100个细菌/mL。取无菌三分三叶 片，用无菌的解剖刀划以"+"字形伤口，放入上述转化中，60rpm/min振荡培养8h 取出，用无菌水冲洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素和不同浓度 6-BA(0.5mg/L-3mg/L)的B5培养基中，每2周转移到新鲜培养基中1次,待长 出毛状根后分离毛状根,转移至含250-500mg/L卡那霉素无激素的B5培养基 中培养,转移4-5次直至无细菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素B5 培养基中培养。4) .把在固体培养基中的毛状根的继代培养物，接种于装有IOOmL无激素 B5，培养基的500mL三角瓶中,培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组 织液体悬浮培养条件相同,培养20天，将毛状根从培养基上取出放入冷冻千燥 机中进行干燥，然后称重,贮存于-7(TC备用。
5) 含三分三莨菪碱6p-羟化酶基因的转基因发根的东莨菪碱含量测定 我们进一步对表达三分三莨菪碱6p-羟化酶基因的转基因发根进行东莨
菪碱含量测定。按Zhang等(PNAS，2004)的方法对表达三分三莨菪碱6(3-羟化酶基因的转基因发根进行东莨菪碱含量测定。结果表明，在表达三分三 莨菪碱6(3-羟化酶基因的转基因发根中东茛菪碱含量同非转基因对照上的相 比显著提高(P<0.05)。因此转基因结果证明，三分三莨菪碱6p-羟化酶基因 对促进东莨菪碱含量的提高有明显作用，三分三莨菪碱6p-羟化酶基因可用于 利用转基因技术来提高东莨菪碱含量的研究和产业化中。核苷酸序列表 SEQUENCE LISTING
〈110>上海师范大学
〈120〉三分三莨菪碱6 e -羟化酶基因及其编码的蛋白质和应用
<160〉 4
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 1380
<212> ■
〈213〉 三分三(Anisodus acutangulus) 〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (125).. (1159)
<223〉
〈400> 1
acag犯aatt卿gcagtgttctccctcttcaactctcgcttctaaattt60
atccacaacgtaacttctttcttatttaagacttttgttccctgaaaa￡igcagsa犯atc120
acaaatggctactcttgtctcaaattggtcgtttctgaaetgctttaaagc180
accattagagaa犯ggscgttcctttaggaaatgatgtccctatcattga240
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aaccttt.ttgtatgtcttattgtttctttgaaaaaaaaaaL380
〈210〉 2
〈211〉 344
〈212〉 PRT
<213> 三分三(Anisodus
acutangulus)
〈400〉 2 Met Ala Thr 1
Phe Lys Ala
Asn Asp Val 35
Gin Gin lie 50
Asn His Gly 65
Lys Glu Phe
Leu Val Ser Asn Trp Ser Thr Asn Asn Val Ser Glu Ser
Pro
20
Pro
5
Leu lie
Thr Lys
Phe Pro
Phe
Ala 85
Glu Lys Arg
lie Asp Leu 40
Ala Cys Gin 55
Glu Lys Leu 70
Leu Pro Ala
Ala
25
Gin
10 Glu
Lys Asp Vai
Gin Asp His
Asp Phe (;ly
Met Ala
Glu
Glu 90
Glu
75
Lys
Leu
60
Thr
His
45
Phe
Pro
30
Leu
15 Leu
Met Lys Val
Gly
Val Val
Gin Val lie
Glu Lys Leu
Cys 80 Gin Pro 95
22Lys Gly Lys Pro Ala Lys Phe Glu Leu Pro Leu Glu Gin Lys Ala Lys
100 105 110
Leu Tyr lie Glu Gly Glu Gin Leu Ser Asn Gly G丄u Leu Phe Tyr Trp
115 120 125
Lys Asp Thr Leu Ala His Gly Cys His Pro Leu Asp G]u Glu Leu Val
130 135 140
Asn Ser Trp Pro Glu Lys Pro Ala Thr Tyr Arg Glu Val Val Ser Lys 145 150 155 160
Tyr Ser Val Glu Val Arg Lys Leu Thr Met Arg Met Leu Asp Tyr lie
165 170 175
Cys Glu Gly Leu Gly Leu Lys Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Gin lie Gin Met Met Leu Ala Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Asp Pro
195 200 205
Ser Ser Thr L,eu Gly Ser Gly Ala His Tyr Asp G]y Asn Va丄lie Thr
210 215 220
Leu Leu Gin Gin Asp Leu Pro Gly Leu Gin Gin Leu lie Val Lys Asp 225 230 235 240
Asp Asn Trp lie Ala Val Glu Pro lie Pro Thr Ala Phe Val Va] Asn
245 250 255
Leu Gly Leu Thr Leu Lys Val lie Thr Asn Glu Lys Phe Glu Gly Ser
260 265 270
l丄e His Arg Val Val Thr Asn Pro Thr Arg Asp Arg Val Ser lie A丄a
275 280 285
Thr Leu lie Gly Pro Asp Tyr Ser Cys Thr lie Glu Pro Ala Lys G〗u
290 295 300
Leu Leu Ser Gin Asp Asn Pro Pro Leu Tyr Lys Pro Tyr Pro Tyr Ala 305 310 315 320
Glu Phe Ala Glu lie Tyr Leu Ser Asp Lys Ser Gly Tyr Asp Ala GJy .325 330 335Val Lys Pro Tyr Lys lie Asn Ala 340
〈210〉 3 <211〉 24 〈212〉 廳
<213〉三分三(Anisodus acutangulus) 〈400> 3
acagaaaatt agagcagtgt tctc 24
〈210〉 4 <211> 24 〈212〉 画
〈213> 三分三(Anisodus acutangulus) <400> 4
aac3c3朋ga aacaataaga cats 2权利要求
1.一种三分三莨菪碱6β-羟化酶基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列，或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2. —种三分三莨菪碱6e-羟化酶蛋白，由权利要求1所述的基因序列所编码。
3. 根据权利要求2所述的莨菪碱6P-羟化酶蛋白质，其特征在于，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨 基酸的同源序列。
4. 一种含有权利要求1所述的三分三莨菪碱6 P -羟化酶基因全序列或部分片 段的质粒。
5. —种含有权利要求1所述的三分三莨菪碱6 P -羟化酶基因全序列或部分片 段的植物表达载体。
6. —种宿主细胞，该细胞含有权利要求1或4或5中任一项所述的基因序列。
7. 根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所说的细胞为大肠杆菌细胞。
8. 根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所说的细胞为农杆菌细胞。
9. 根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所说的细胞为三分三发根 细胞。
10. —种三分三莨菪碱6P-羟化酶基因的应用，包括用权利要求5所述的表达 载体转化三分三细胞、或者用权利要求8所述的农杆菌与三分三细胞共培 养、或者用权利要求9所述的三分三发根细胞培育三分三植株。
全文摘要
本发明公开了一种三分三莨菪碱6β-羟化酶基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，以及由SEQ ID NO.1所编码或者有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的莨菪碱6β-羟化酶蛋白质。本发明还公开了上述的莨菪碱6β-羟化酶基因在三分三中进行真核细胞表达及在转基因发根中提高东莨菪碱含量的应用，显著地提高了资源植物中的有效成分含量，可用于中药材三分三等的品质改良。
文档编号C12N15/52GK101538575SQ20061011892
公开日2009年9月23日 申请日期2006年11月30日 优先权日2006年11月30日
发明者伟 周, 周根余, 开国银, 礼 李, 陈军峰 申请人:上海师范大学