专利名称：一种鉴定转基因抗虫植物抗虫性的生物测定方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定转基因抗虫植物抗虫性的生物测定技术。属生物工程、生物遗传工程技术。
背景技术：
虫害是制约农作物高产、稳产的重要因素。如何有效地控制害虫，减少损失受到各国政府和科学家的普遍重视。传统化学防治的弊端已越来越突出，化学农药的非特异性作用方式，不但杀死了害虫，也杀死了有益的昆虫和害虫的天敌；大量施用化学杀虫剂的结果，导致害虫产生了抗药性，使用药量越来越大，形成了恶性循环；过量使用化学农药，不仅严重破坏了自然生态平衡，而且直接威胁着人畜的安全。而生物防治却能克服上述缺点。目前，生物防治的途径主要有三条，即生物杀虫剂、生态防治和培育抗虫品种，其中最有效的方法是培育抗虫品种。但常规抗虫育种周期长，种质资源有限，加上抗虫机制不明了等原因，其利用受到极大的限制。采用基因工程技术将外源抗虫基因导入植物中，使其在植物细胞内稳定地遗传和表达，并形成植物抗虫新品系或新品种是植物抗虫育种领域最有前途的方法。在这个过程中，转基因抗虫植物的检测和鉴定是一个必不可少的环节。通常采用两种方法鉴定转基因抗虫植物，即分子检测和生物测定。分子检测阳性，并不意味着在田间即能表现出抗虫性，即基因的整合并不一定有抗虫性，抗性的高低与整合的拷贝数也并非成正比，抗性的高低可能取决于整合的位置和表达的水平。所以通过抗虫性鉴定作进一步选择。目前转基因抗虫杨树的生物测定主要是通过室内抗虫性测试完成，室内杀虫试验易于控制，重复性好，结果比较准确，但这种测定是在转化工作的后期进行，此时鉴定出转化植株抗虫性较差或没有抗虫性，就意味着整个实验的失败。如果将生物测定的检测时间提前，就能做到既缩短实验周期，又减少实验支出。
发明内容
本发明的目的是为转基因抗虫植物的抗虫性提供一种实验结果稳定精确的鉴定技术，该技术具有操作简便快捷、节省人力物力的特征。
实现本发明目的的一种鉴定转基因抗虫植物抗虫性的生物测定方法，其特征是以离体培养的昆虫细胞为试材，采用MTT分析法，测定转基因抗虫植株的抗虫性。
所述的转基因抗虫植物抗虫性的生物测定方法，其特征是通过测定转基因抗虫植株蛋白质对昆虫离体细胞的毒杀作用，测定转基因抗虫植株的抗虫性。
所述的转基因抗虫植物抗虫性的生物测定方法的测定步骤为步骤1、取未转化植株和经PCR(聚合酶链式反应)检测为阳性的转化植株的新鲜叶片，配植物蛋白提取液，提取植物总蛋白；步骤2、用转化植株的蛋白液和未转化植株的蛋白液处理昆虫离体细胞液，再用由无血清细胞培养基配成的MTT[3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑]混合液，分别沉淀结晶经转化植株的蛋白液和未转化植株的蛋白液处理过的昆虫离体细胞液，用十二烷基硫酸钠-酸化异丙醇溶解结晶产物，在570纳米波长处测定吸光度OD值；步骤3、用细胞存活率和细胞相对死亡率表示转基因抗虫植物的抗虫性，计算公式如下 细胞相对死亡率(％)＝1-细胞相对存活率。
本发明测定转基因抗虫植物抗虫性所用试验材料及用品植物材料中嘉8号杨(Populus deltoids，I-63×I-69)转BtCry1A基因植株；昆虫细胞粉纹夜蛾细胞(T.ni Hübner)BTI-TN-5B1-4细胞，又称TnH5细胞或Hi5细胞；昆虫细胞培养基(Grace)称3克组织培养用酵母浸粉和3克水解乳蛋白，加入800毫升去离子水使之充分溶解，然后缓缓加入100克Grace粉剂，边加入边搅拌，待完全溶解后，再缓缓加入0.35克NaHCO3使之溶解，用1摩尔/升NaOH调pH值至6.5(该过程也需边加边搅拌，避免产生沉淀)，接着用去离子水定容至1000毫升，用孔径为0.45微米的滤膜抽滤，最后加终浓度为10％的进口胎牛血清，4℃保存备用。
化学试剂(1)噻唑蓝[化学名3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，简称MTT]母液50毫克MTT溶于10毫升Puck’s(盐平衡溶液)，抽滤后4℃遮光保存；(2)植物蛋白提取液1.33克Na2CO3，0.19克DTT(1，4-二硫代苏糖醇)，1.46克NaCl，0.5克Vc，加去离子水250毫升，pH8.5；(3)十二烷基硫酸钠(SDS)-酸化异丙醇配置3％SDS(克/100毫升)溶液，取2毫升SDS溶液与10毫升异丙醇混合(4)胰蛋白酶(trypsin)；主要仪器高速冷冻离心机、分光光度计、酶联免疫检测仪；本发明测定转基因抗虫植物抗虫性的操作步骤为第一步、提取植物总蛋白取未转化植株和经PCR检测为阳性植株的新鲜叶片，置于研钵中加液氮和聚乙烯吡咯烷酮(简称PVP)，迅速研磨至粉状；再向研钵中加入植物蛋白提取液，继续充分研磨后，将其研磨混合物于4℃下静置过夜；然后在4℃下以5000转/分钟速度离心，取上清液于4℃下以10000转/分钟离心；最后，取上清液用Bradford法测蛋白浓度；第二步、测定蛋白毒力在96孔酶联板中接种Hi5细胞，细胞液浓度为2-3×105细胞/毫升，每孔100微升，于28℃培养过夜；弃去细胞培养液，分别加入转化植株的蛋白液和未转化植株的蛋白液各100微升，蛋白质溶液先用终浓度为0.5毫克/毫升的胰蛋白酶处理一小时，以二倍稀释后设五个浓度，每个浓度设三个重复；处理2小时，于分光光度计下每15分钟观察一次；弃孔中液体，各孔加入用无血清细胞培养基配成的0.5毫克/毫升MTT混合液100微升；培养4小时后观察孔底有无沉淀产生，若有沉淀弃去处理液，各孔加入100微升十二烷基硫酸钠-酸化异丙醇，溶解MTT与活细胞产生的紫色结晶物；在ELISA仪下读每孔在570纳米波长处吸光度(OD)值，通过与对照组(未转化植株的蛋白液)的比较用上述计算公式计算实验组的细胞存活率和细胞相对死亡率。
本发明转基因抗虫植物抗虫性的生物测定技术，其稳定性表现在以离体培养的粉纹夜蛾细胞(Trichoplusia ni Hübner)为试材，采用MTT分析法对中嘉8号杨(Populusdeltoids，I-63×I-69)转BtCry1A基因植株进行抗虫性鉴定，并用经过碱和胰蛋白酶降解后活化的Bt晶体毒素蛋白处理离体培养的粉纹夜蛾细胞，结果发现，用中嘉8号杨(Populusdeltoids，I-63×I-69)转BtCry1A基因植物蛋白处理的粉纹夜蛾细胞表现出的病理变化与直接用Bt晶体毒素蛋白处理的细胞所表现出的病理变化相同。同时进行室内生物测定，数据统计表明，用MTT分析法对转基因植株进行抗虫性鉴定的结果与室内用昆虫个体进行抗虫鉴定的结果一致，之后经多次反复试验进一步得到确认。
转基因抗虫植物抗虫性的生物测定技术具有较高的精确性MTT分析法用作转基因抗虫植物的生物测定，选用离体培养的昆虫细胞来检测转基因植物的抗虫性。其原理是以活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶与外源性的MTT[3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑]发生还原反应，生成不溶于水的蓝紫色结晶产物甲臜，甲臜颜色的深浅与活细胞数成正比，用十二烷基硫酸钠-酸化异丙醇能溶解细胞中的紫色结晶物，通过在570nm的波长处测定吸光度值(OD)值，可间接地反映活细胞数量，测算出活细胞的数目，而死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原。利用昆虫细胞测定转基因抗虫植物的抗虫性，便于从分子水平观察分析转基因抗虫植物的杀虫机理。离体培养的昆虫细胞相对于饲养或田间的活体昆虫而言，其均一性好，不易受外界环境和活体昆虫体壁、肠道内蛋白酶活性、体液pH值等因素的影响。此法可同时测试几个样品，操作简单、便捷，节省人力、物力。这种酶与底物结合的反应，使实验结果更加精确。
图1正常Hi5细胞图2A被转基因植株蛋白质(1975.0微克/毫升)处理0.5小时的Hi5细胞图2B被转基因植株蛋白质(1975.0微克/毫升)处理1小时的Hi5细胞图2C被转基因植株蛋白质(1975.0微克/毫升)处理2小时的Hi5细胞图3被非转基因植株蛋白质(1975.0微克/毫升)处理2小时的Hi5细胞图4转基因抗虫植物生物测定程序具体实施方式
转基因抗虫植物抗虫性的生物测定程序如图4所示。操作步骤依次为1、提取植物总蛋白①取1.0克经PCR(聚合酶链式反应)检测为阳性植株的新鲜叶片，置于研钵中加液氮和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，迅速研磨至粉状；
②向研钵中加入3.5毫升植物蛋白提取液，继续研磨30秒钟；③将上述混合物置于4℃过夜；④在4℃下，5000转/分钟离心10分钟；⑤取上清液于4℃下，10000转/分钟离心20分钟；⑥取上清液用Bradford法测蛋白浓度。
2、测定蛋白毒力①在96孔酶联板中接种Hi5细胞(2-3×105细胞/毫升)，每孔加细胞培养液100微升，28℃培养过夜；②弃去细胞培养液，分别加入转化植株的蛋白液和未转化植株的蛋白液(对照组)各100微升(蛋白质溶液先用终浓度为0.5毫克/毫升的胰蛋白酶处理一小时)，以二倍稀释后设五个浓度，每个浓度设三个重复；③处理2小时，于分光光度计下每15分钟观察一次；④弃去孔中液体，各孔加入用无血清细胞培养基配成的0.5毫克/毫升MTT混合液100微升；⑤培养4小时后观察孔底有无沉淀产生，若有沉淀弃去处理液，各孔加入100微升十二烷基硫酸钠(SDS)-酸化异丙醇，溶解MTT与活细胞产生的紫色结晶物(约20分钟)；⑥在ELISA仪下读每孔在570纳米波长处吸光度(OD)值(λ＝570纳米)，通过与对照组的比较，按上述公式计算实验组的细胞存活率和细胞相死亡率。
从以上操作步骤可以看出，转基因抗虫植物抗虫性的生物测定技术操作程序简单，只需一人即可完成，且从试验的准备到最后的完成仅需两天，试验中所需药品易于购买、用量少，具体溶液的配置方法简单，相比于其它的测定方法，如点杂交和Southern杂交、免疫测定、生物测试，无论是在完成所需时间、药品价格还是在操作程序方面，都有较大的优势，是一种既省时、省物又省力的鉴定技术。
表1是本试验用MTT分析法测定的中嘉8号杨(Populus deltoids，I-63×I-69)转BtCry1A基因植株蛋白毒力的结果试验结果表明，与正常细胞相比(图1)，粉纹夜蛾细胞经转基因抗虫植株蛋白质(987.5微克/毫升)处理后，30分钟开始膨大，1小时明显膨大，2小时后大部分细胞破裂(图2A，2B，2C)；相同浓度下，经非转基因株蛋白质处理2小时的粉纹夜蛾细胞，也存在细胞膨大、破裂的现象，但程度明显比转基因抗虫植株要轻(图3)。处理2h后测定，经转基因抗虫植株蛋白质处理的粉纹夜蛾细胞，其相对死亡率随着蛋白质浓度的降低而下降，浓度为1975微克/毫升时最高，相对死亡率为37.6％；浓度987.5微克/毫升其次，相对死亡率为35.1％。
表1用MTT分析法测定的中嘉8号杨转BtCry1A基因植株蛋白毒力的结果
权利要求
1.一种鉴定转基因抗虫植物抗虫性的生物测定方法，其特征是以离体培养的昆虫细胞为试材，采用MTT分析法，测定转基因抗虫植株的抗虫性。
2.根据权利要求1所述的转基因抗虫植物抗虫性的生物测定方法，其特征是通过测定转基因抗虫植株蛋白质对昆虫离体细胞的毒杀作用，测定转基因抗虫植株的抗虫性。
3.根据权利要求1所述的转基因抗虫植物抗虫性的生物测定方法，其特征是测定步骤为步骤1、取未转化植株和经聚合酶链式反应检测为阳性的转化植株的新鲜叶片，配植物蛋白提取液，提取植物总蛋白；步骤2、用转化植株的蛋白液和未转化植株的蛋白液处理昆虫离体细胞液两小时，再用由无血清细胞培养基配成的3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑混合液分别沉淀结晶经转化植株的蛋白液和未转化植株的蛋白液处理过的昆虫离体细胞液，用十二烷基硫酸钠-酸化异丙醇溶解结晶产物，在570纳米波长处测定吸光度OD值；步骤3、用细胞存活率和细胞相对死亡率表示转基因抗虫植物的抗虫性，计算公式如下 细胞相对死亡率(％)＝1-细胞相对存活率。
全文摘要
一种鉴定转基因抗虫植物抗虫性的生物测定方法。以离体培养的粉纹夜蛾细胞为试材，通过转基因抗虫植物蛋白质对昆虫细胞的毒性，测定转基因抗虫植物的抗虫性。由于活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶与MTT反应生成蓝紫色结晶产物甲臜，甲瓒颜色深浅与活细胞数成正比，通过在570nm的波长下测定其OD值，测算出活细胞的数目，而死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原。利用昆虫细胞测定转基因抗虫植物的抗虫性，便于从分子水平观察分析转基因抗虫植物的杀虫机理。离体培养的昆虫细胞相对于饲养或田间的活体昆虫而言，其均一性好，不易受外界环境和活体昆虫体壁、肠道内蛋白酶活性、体液pH值等因素的影响。此法操作简单、便捷，节省人力、物力。
文档编号C12Q1/18GK1967242SQ200610124968
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月8日 优先权日2006年11月8日
发明者郑进, 洪华珠, 康薇 申请人:华中师范大学