专利名称：对虾抗病毒促生长双功能工程菌株及构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因生物工程技术领域，更具体涉及一种高效表达对虾白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28和鲤鱼生长激素(GH)融合蛋白的基因工程菌株，同时还涉及一种基因工程菌株的构建方法。本发明还涉及该菌株在对虾抗病毒促生长研究开发中的用途。
背景技术：
对虾是世界沿海国家和地区主要水产养殖品种，对虾养殖业一直是我国沿海地区重要的经济支柱产业，我国也是全球最大的对虾生产国之一。1987和1988年，我国台湾地区养殖的斑节对虾发生了大规模暴发性死亡，这是世界范围内首次出现的所谓“虾瘟”(对虾白斑综合症)。1993年对虾白斑综合征病毒性疾病的大面积暴发，给全世界的对虾养殖业造成了巨大的经济损失，我国的对虾年产量也因此减少了70％以上。造成这次全球对虾业毁灭性重创的主要病原体是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)，该病毒迄今为止仍然是对虾养殖业危害性最为严重的病毒病原之一。
对虾白斑综合征病毒是一种无包涵体、具囊膜、一端有尾巴状结构、杆状的双链环状DNA病毒，基因组序列已被测定。其感染宿主范围很广，它不仅侵染各种野生及养殖对虾，而且侵染其他水生甲壳类如螃蟹、螯虾和龙虾等，已经成为对水生甲壳类动物最大威胁的病毒。目前已经证明南美白对虾(Penaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、日本对虾(Penaeus japonicus)、墨吉对虾(Penaeus merguiensis)、长毛对虾(Penaeus penicillatus)、中国对虾(Penaeus orientalis)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、近缘新对虾(Metapenaeus affinis)、脊尾白虾(Palaemon carincauda)等养殖对虾皆可被WSSV侵染。用WSSV对泥蟹(Scylla serrata)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、澳洲龙虾(Cherax quadricarinatus)等淡水甲壳类动物进行了人工感染实验，结果证明这些动物无一例外均能被WSSV感染致死，显示WSSV对其他淡水虾类、蟹类养殖可能造成的危害。
该病毒的感染力极强，急性期感染的对虾表现为游动迟缓，拒食，表皮松散，体色发红，皮下、甲壳及附肢出现直径为0.5～2mm大小不等的白色斑点等症状，在3-7日内致死率高达90～100％。通过对感染病毒后的组织进行组织病理学分析发现该病毒能够严重的破坏对虾的胃、鳃、淋巴器官等。病毒感染早期特征表现为宿主细胞核肿大，染色质边移。超薄切片观察可以发现大量的病毒粒子集中在被感染的细胞核内。
WSSV目前尚未有有效的防治方法。传统的直接在海湾建池的养殖模式是WSSV极易暴的主要原因之一。此外，对虾作为甲壳类低等动物，多数品种对WSSV高度敏感，同时又不能用免疫接种方法产生特异性的免疫保护，各种可能的应激状态如温度的骤然变化、水质恶化、密度过高、捕捞等，都可以成为对虾白斑综合症暴发和流行的诱发因素。提高对虾机体的抗病能力，优化虾池生态环境，加强科学饲养管理，杜绝WSSV的传播途径，是目前防治病毒病的最有效手段。然而，以上措施一方面成本较高、技术复杂，却并不能完全排除失败的可能性。
在无脊椎动物中，由于缺乏免疫球蛋白，在免疫中起识别外源物质作用的重要因子是凝集素和血细胞内的酚氧化酶原系统，该系统中的成分被激活后可促进血细胞的吞噬与包裹，产生杀菌物质等，起到抵御病原菌的作用。有报道多糖、生物碱、酮类、有机酸等能够激活对虾以及甲壳类动物的免疫系统，增强对虾的抗病能力。但依靠激活对虾的非特异性免疫系统来达到抗WSSV的目的，防治效果并不能令人满意，而且成本也比较高。
目前，在分子水平WSSV的感染和致病机理还未阐明。病毒的入侵需要病毒与细胞表面受体的特异性结合，病毒囊膜蛋白在此过程中起着重要的作用，是病毒致病性的必需蛋白。而囊膜蛋白的特异性抗体与病毒粒子的结合可以阻遏病毒与受体的结合，进而影响病毒的吸附和侵入。
已有文献报道，利用对虾WSSV的主要囊膜蛋白VP28的多克隆或单克隆抗体能够有效的抑制病毒的吸附和侵入，从而阻断病毒的复制达到中和病毒的效果。(Van Hulten M C W，Witteveldt J，VlakJ M，et al.White Spot Syndrome Virus Envelope Protein VP28 IsInvolved in the Systemic Infection of Shrimp.Virology，2001，285228-233.和You Z，Nadala EC Jr，Yang J，Production of polyclonalantiserum specific to the 27.5 kDa envelope protein of white spotsyndrome virus.Dis Aquat Organ，2002，51(1)77-80)病毒囊膜蛋白是病毒抗原决定簇所在，为了增强抗原性，提高多克隆抗体的中和效果，Li，H-X和Meng，X-L选用大肠杆菌表达的囊膜融合蛋白VP(19+28)抗原制备兔抗血清，以螯虾为动物模型，研究抗血清对WSSV的中和作用，结果表明，融合蛋白的抗血清对实验螯虾产生了很好的保护作用(Li，H-X，Meng，X-L et al，2005，Protection of crayfish，Cambarus clarkii，from white spot syndromevirus by polyclonal antibodies against a viral envelope fusion protein.，Journal of Fish Diseases 28(5)，285-291.)。但是，运用病毒抗血清应用于WSSV防治生产成本太高，难以实现产业化。
对于病毒病最有效的控制措施是疫苗的制备，然而长期以来甲壳类动物被认为缺乏类似哺乳动物的免疫系统，只能依靠先天的抗病原物质来抵抗外来病原的入侵。但已有不少研究报道证实了甲壳纲动物具有相对哺乳动物来讲的“准免疫系统”。最近，AtsushiNamikoshi等用不同的方法来诱导对虾对WSSV的抵抗力，研究发现，用灭活的WSSV和Vibrio penaeicida混合物或用大肠杆菌表达的WSSV的囊膜蛋白VP28、VP26来免疫对虾，在免疫后一定的时间再用WSSV攻击对虾时，死亡率都有所下降。另外，JeroenWitteveldt用大肠杆菌表达的WSSV的囊膜蛋白VP28、VP19-MBP(the maltose binding protein，MBP)作为亚单位疫苗来注射或投喂对虾，发现对虾在一定的时间范围内对WSSV具备了一定的抵抗力(Witteveldt J，Cifuentes CC，Vlak JM，et al.，Protection of Penaeusmonodon against white spot syndrome virus by oral vaccination.JVirol，2004，78(4)2057-2061.和Witteveldt J，Vlak J M.，van HultenM C，Protection of Penaeus monodon against white spot syndromevirus using a WSSV subunit vaccine.Fish & Shell.sh Immunology，2004，16571-579)。此外，张春莉等用蓝藻作宿主来表达VP28，粗提后给对虾口服(张春莉，施定基，黄健，张海霞，彭国宏，白斑综合症病毒(wssv)囊膜蛋白VP28基因的克隆及在蓝藻中表达载体的构建，海洋科学，2003，27(2)72-76)，这种转基因蓝藻也是一种WSSV亚单位疫苗的一种尝试。
在世界知识产权组织的专利文献库中也有关于应用WSSV囊膜蛋白作为疫苗防止WSSV的申请。如荷兰AKZO NOBEL公司先后申请了3个专利，均为利用WSSV的VP28、VP26、VP24、VP19和ORF167几个主要蛋白质来制备WSSV免疫疫苗(WO0109340---Proteins Derived From White Spot Syndrome Virusand Use thereof)，(WO03000900---White Sport Syndrome VirusVaccine)，(WO0222664---Antigenic Proteins of Shrimp White SpotSyndrome Virus and Use thereof)。
鱼生长激素(Growth Hormone，GH)是由鱼脑下垂体前叶分泌的一种单链蛋白质，鱼类GH最基本的生理功能是促进鱼体生长和参与多种促合成代谢作用。在水产养殖业鱼、虾人工饲料中常常加入虾头粉以促进其生长，实际上是虾头粉中含有的脑垂体产生的生长激素在起促进生长作用。鱼生长激素在水产养殖中领域具有极大的应用价值，因而越来越受到重视。已经成为水产养殖研究的热点，并逐步地进行了商业化的尝试，取得了很大的进展。
首次分离鱼类GH的工作始于70年代中期，在莫桑比克罗非鱼中首次提纯出鱼生长激素。80年代中后期形成研究热点，目前国际上已有近20种鱼类的GH被分离纯化，已分离得到的鱼类GH一般含有187～188个氨基酸，分子量多为21～22kD，鱼类GH等电点在5.6～7.1之间。GH发挥功能主要经由两个途径一是诱导肝细胞、肌细胞产生生长激素介质，再经由介质间接起作用；二是直接作用于靶细胞产生生理效应。无论那一种方式GH都需要首先同细胞表面特异性受体结合，再由受体介导，激发一系列胞内的生化反应并最终导致相应的生物效应的发生。
鱼生长激素能够促进鱼的生长发育，加速蛋白质合成和脂类降解的生理功能，更为重要的是，鱼GH对哺乳动物的生长激素受体无任何结合活性，因而具有很高的生物安全性。鱼生长激素在水产养殖中应用的研究已经广泛的开展。由于鱼生长激素在鱼体内本身的含量很少，要通过从鱼体内直接提取，成本较大，工艺也比较的繁琐。所有现阶段的应用研究主要集中在两个方面转生长激素基因鱼的育种以及鱼生长激素基因工程的研究。
鱼生长激素为单一的多肽，没有亚基，不需要糖基化等修饰，而且含有较少的二硫键，容易复性，所以特别适应进行基因工程表达。现阶段进行的鱼生长激素的基因工程表达主要是通过大肠杆菌和酵母进行表达。简清等对鲑鱼生长激素cDNA进行改造，将改造后的基因克隆到大肠杆菌中表达，表达产物经初步纯化和复性后作为饲料添加剂投喂罗非鱼，具有明显的促生长作用。
鱼生长激素在酵母体内的表达也取得了很大的进展，酵母作为异源蛋白的表达宿主特别是作为生长激素这种结构较为简单的外源蛋白质的表达，比大肠杆菌具有更多优越性。首先，酵母的胞内环境更适于真核生物蛋白质的正确折叠；其次，酵母具有糖基化能力，而这对于蛋白的结构整合、可溶性及生物活性是至关重要的。毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种新型有效的外源基因表达系统，含有受甲醇调控的AOX1强启动子，能够稳定高效表达外源基因.该酵母还可对表达产物进行翻译后加工修饰，是真核基因表达的理想宿主。此外，Pichia菌株是极度好的单细胞饲料酵母，可在简单的培养基上高密度发酵。鲈鱼生长激素已经在毕赤酵母中成功地表达，在喂饲罗非鱼的实验中取得了很好的促增长效果后进行海水的网箱养殖的中试验取得了成功。
近年的研究用证明，生长激素浸渍或加入饲料中喂食对虾，也能起到促进生长的效果。巫爱珍等在大肠杆菌中表达鲤鱼生长激素重组DNA，经过高密度发酵，包涵体的提取及复性，以浸渍方法处理鱼苗和虾苗能够大大提高存活率(巫爱珍，孙玉昆.基因工程鱼生长激素的生产研究，生物工程学报，1997，13(2)200～205.)。徐斌等将在酵母中表达的大鳞麻哈鱼的重组生长激素添加入人工配合饵料中投喂对虾幼体，研究其对中国对虾幼体的生长及成活率的影响，经过50d实验结束时，两个实验组幼虾的平均体重均显著高于对照组幼虾的平均体重。实验组幼虾的体重增长率也显著高于对照组幼虾。此外，实验组幼虾的成活率也显著高于对照组幼虾的成活率(徐斌.鱼类生长激素的分离、鉴定及其生理功能研究的进展.海洋与湖沼，1997，28(2)209～214.)。该研究结果充分表明，重组鱼类生长激素加入饵料中投喂对虾，具有显著的促进中国对虾虾体生长的作用，同时大大提高了幼虾生长发育的成活率。
本发明的另一个目的在于提供一种制备毕赤酵母基因工程菌株的方法。毕赤酵母表达系统是一种较为理想的真核蛋白表达系统，具有以下优点(1)外源基因能整合到巴斯德毕赤酵母基因组上，基因工程菌株比较稳定。(2)可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，从而使表达的蛋白具有生物活性；(3)具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；(4)毕赤酵母易于进行操作和培养。营养要求低，生长快，培养基廉价，既能高密度发酵生长，亦能工业化大生产；(5)表达量高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毕赤酵母基因工程菌株，该菌株可以表达产生WSSV的vp28和鲤鱼生长激素GH基因工程融合蛋白(vp28+GH)。其优点是表达量高，易于工业化生产，成本低，安全性好。
本发明还有一个目的是在于提供基因工程毕赤酵母菌株在对虾养殖业中的应用。
本发明再一个目的是基因工程毕赤酵母菌株作为制备治疗或预防对虾感染的药物中的应用。
本发明的目的在于提供一种抗病毒促生长双功能药物(饲料)的制备方法，该种药物(饲料)具有预防和治疗WSSV的作用，并能够促进对虾的生长和发育，提高对虾产量。而且不污染环境，不会对水体中的其它物种造成危害，对人畜无害。
前已诉及，WSSV的主要囊膜蛋白VP28具有提高对虾抗WSSV感染的能力。从基因工程获得的重组鱼生长激素能够发挥类似天然生长激素的功能，可通过注射、口服等方式应用于虾的养殖试验，试验证明能促进虾的生长。本发明的创新之处在于，本发明选用毕赤酵母表达鲤鱼生长激素(GH)与WSSV囊膜蛋白vp28的融合蛋白，意在综合利用其促对虾生长和提高免疫力的作用，通过基因工程生产的重组生长激素及VP28融合蛋白可以用为饲料添加剂应用于对虾水产养殖业，能够促进对虾生长，同时提高免疫力和抗病力，提高对虾养业殖产量。毕赤酵母表达系统是一种新型有效的外源基因表达系统，含有受甲醇调控的AOX1强启动子，能够稳定高效表达外源基因，在甲醇做为唯一的碳源的诱导下，表达量可占整个酵母总蛋白的30％。该酵母还可对表达产物进行翻译后加工修饰，是真核基因表达的理想宿主。在应用上酵母还有一个重要的优点就是安全性好，可以直接做为饲料的添加剂进行喂养，可以免除纯化生长激素的程序，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案如下本发明的技术要点之一是表达基因工程融合蛋白(vp28+GH)的毕赤酵母基因工程菌株的构建及诱导表达。
本发明所涉及的分子生物学方法为常规的方法，为本领域人员所熟悉。在本发明的一个实施例中提供了一种构建基因工程菌株的方法，菌株为毕赤酵母Pichia pastoris X-33 pPIC 6αc-GH+vp28，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2006年9月19日，保藏编号CCTCC M206101，分类命名Pichia pastoris X-33/pPIC 6αc-GH+vp28。
利用基因工程毕赤酵母菌菌株，制备融合蛋白的方法步骤如下1.鲤鱼生长激素基因的制备本发明从鲤鱼脑垂体中提取总RNA，然后反转录得到生长激素基因，技术线路如下取鲤鱼脑垂体，按照RNA提取试剂盒介绍的方法提取总RNA，电泳分析RNA质量。根据鲤鱼GH成熟肽的序列设计引物，在引物两端分别引入限制性内切酶，以利于克隆，并将原有的终止密码子TAG突变，便于基因的融合。按照反转录试剂盒介绍的方法进行cDNA合成和PCR扩增，PCR产物通过凝胶电泳检测其大小是否与预期相符，将获得的基因测序后克隆于pMD-18T载体中，挑取菌落快速提取质粒进行酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是包含本发明涉及GH基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏。
2.WSSV的vp28基因的制备本发明从罹病对虾虫体中提取WSSV并通过PCR的方法制备vp28基因，技术路线包括(1)WSSV病毒基因组的制备于冰上取病虾的肺、胃和心脏，冰浴匀浆，然后加入蛋白酶K(100μg/ml)，处理后于沸水中煮15min左右，立即冰浴5min，12,000r/min离心10min取其上清液做模板DNA，其余4℃保存。
(2)PCR扩增vp28基因扩增引物合成根据GeneBank中已经发表的WSSV序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。采用常规的PCR方法扩增目的基因vp28，PCR产物通过凝胶电泳检测其大小是否与预期相符。回收PCR产物并将其克隆入载体中，挑取菌落快速提取质粒进行酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是包含本发明涉及vp28基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏。
3.融合基因的制备及穿梭质粒的构建(1)穿梭质粒pPI6αc-GH的构建同时酶切含有GH基因的重组质粒和穿梭质粒pPIC6αc，胶回收目含有GH基因的条带，16℃连接后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子是包含本发明涉及GH基因的大肠杆菌，命名为pPIC6αc-GH，用于融合基因的制备及穿梭质粒的构建。
(2)穿梭质粒pPI6αc-GH-vp28的构建同时酶切含有vp28基因的重组质粒和含有GH基因的穿梭质粒pPI6αc-GH，胶回收目vp28基因的条带，16℃连接后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子(pPI6αc-GH-vp28)是包含本发明涉及GH+vp28融合基因的大肠杆菌，该质粒还可作为穿梭质粒用于酵母基因工程菌的构建。
4.酵母基因工程菌的构建酶切重组穿梭质粒pPI6αc-GH-vp28使其线性化，转化酵母X33感受态细胞。挑取转化子，提取酵母基因组DNA，用特异引物和通用引物分别进行PCR检测，筛选出阳性转化子pPI6αc-GH-vp28/X33。所得到的阳性克隆即为本发明所涉及的能够同时表达GH基因和vp28基因的基因工程菌株，可以用于制备对虾抗病毒促生长双功能相关药物、饲料、添加剂等相关产品。
5.基因工程融合蛋白的制备在毕赤酵母中有两个编码乙醇氧化酶的基因AOX1和AOX2，可以利用甲醇作为唯一碳源快速生长，而当培养基中存在其他碳源时，AOX基因不表达。在毕赤酵母工程菌株中，外源基因被克隆至AOX1启动子控制下，因此必须以甲醇作为诱导剂，同时也是唯一碳源来实现外源蛋白的高效表达，在诱导表达时，应补充甲醇以维持其0.5％的含量。
在本发明的实施例中提供了一种毕赤酵母工程菌株诱导表达的方法，可用于毕赤酵母工程菌株诱导表达的培养基包括但不仅限于下列培养基MGY、MM、BMM、BMMY，各种培养基的配置方法及毕赤酵母工程菌株诱导表达方法如下为本技术领域人员非常熟悉的方法，可以通过参考相关文献获得详情。
本发明的技术要点之二是基因工程融合蛋白的活性测定。
在本发明的一个实施例中提供一种基因工程融合蛋白的活性测定的方法，证明本发明所涉及的基因工程融合蛋白既能促对虾生长和，提高对虾养业产量，同时也能提高对虾对WSSV的免疫力和抗病力。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果(1)重组蛋白GH+VP28促虾体生长作用实验各组实验虾在5周的注射期间成活率均为100％，实验的测量数据用平均数±标准差(x±s)表示。经5周实验，实验组1的体重增长率比对照组快20％，组2比对照组快8％。经t检验，与对照组相比，组1体重有显著差异，组2差异不显著。结果表明融合蛋白GH+VP28对虾体生长有促进作用。
(2)重组蛋白GH+VP28抗WSSV感染作用实验在22℃-25℃的条件下养殖的结果显示，注射纯化融合蛋白GH+VP28蛋白组的鳌虾8d后累积死亡率为35％，阳性对照组的鳌虾在感染WSSV 9d后累积死亡率达到了100％，并在3-5d达到死亡高峰，而注射了TN buffer的阴性对照组鳌虾无任何病理现象。说明注射重组融合蛋白GH+VP28可以明显提高对虾抗WSSV感染力。
图1重组穿梭质粒-pPIC6αC-gh+vp28的构建过程图2重组穿梭质粒pPIC6αC-(gh+vp28)的酶切和PCR鉴定Fig 2.The identification of recombinant shuttle plasmids pPIC6αC-(gh+vp28)1PCR production of vp28 by Primer3，4；2PCR production of ghby Primer 1，2；3pPIC6αC-(gh+vp28)/EcoR I+Xba I；4pPIC6αC-(gh+vp28)/Xba I；5recombinant vector pPIC6αC-(gh+vp28)；6PCR production of gh+vp28 by primer1，4；7PCRproduction of gh+vp28 By Primer AOX1.
图3阳性菌基因组PCR鉴定Fig3.The identification of positive strain genosome by PCRMMarker DL2000；1PCR production of gh+vp28 by prime AOX1；2PCR production of vp28 by Primer3，4 3PCR production of ghprimer1，2；4PCR production of gh+vp28 by prime1，4、5、6positivecontrol fragments of gh and vp28 PCR.
图4.SDS-PAGE与Western Blot分析鉴定目的蛋白Fig4.The analysis of fusional protein GH+VP28 expression1Western Blot；2甲醇诱导96h，甲醇诱导72h，甲醇诱导48h；5阴性对照甲醇诱导96h.M为蛋白分子标记.
图5.3组实验虾注射5周后的生长曲线图6感染WSSV后各组虾体生长累计死亡率曲线Fig.6 Time-morality relationship of each group of crayfish afterinfected WSSV1group injected with WSSVinjected with TN buffer twice at 5 daysinterval and then infected WSSV 2 days later；2group injected withGH+VP28 injected with purified GH+VP28 twice at 5 days interval andthen infected WSSV 2 days later；3group injected with TN bufferinjected with TN buffer twice at 5 days interval and infected with TNbuffer 2 days later.
具体实施例方式
下面结合附图及实施例子对本发明作进一步说明，所有实施例中的培养基及分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟悉，可以参考Sambrook等“分子克隆“(实验室手册，冷泉港，1989)等获得详情。
实施例1鲤鱼生长激素基因的制备根据GenBank中已经发表的GH的序列设计引物。gh的上游引物prime1GAATTCATCAGACAACCAGCGGCTCTTCAATAATGC.(划线处为EcoRI位点)，gh的下游引物prime2TCTAGAAACTCCAGGGTGCAGTTGGAATCCA(划线处为XbαI位点)。以PMD-18-gh为模板进行PCR。PCR反应体系10×reactionbuffer 5uL，MgCl2 3uL(1.5mM)，dNTP 1uL(0.2mM)，上下游引物各1uL(30pmol)，Taq DNA聚合酶1uL(5U)，模板4uL，加无菌水至终体积为50uL。PCR的反应条件为95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环后，72℃10min。
实施例2WSSV的vp28基因的制备根据GenBank中已经发表的vp28的序列设计引物。vp28上游引物prime3TCTAGAATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC(划线处为XbαI位点)，vp28下游引物prime4TCTAGAAATTGCTCGGTCTCAGTGCCAG(划线处为XbaI位点)。
以pUCm-vp28为模板进行PCR。PCR反应体系10×reaction buffer5uL，MgCl2 3uL(1.5mM)，dNTP 1uL(0.2mM)，上下游引物各1uL(30pmol)，Taq DNA聚合酶1uL(5U)，模板4uL，加无菌水至终体积为50uL。PCR的反应条件为95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环后，72℃10min。
实施例3PCR产物的回收、纯化及亚克隆将以上PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳(1×TAE)，用紫外灯观察电泳情况，当要回收的DNA带与其他带完全分离时，停止电泳，在紫外灯下用刀片切下欲回收带，用PCR产物纯化试剂盒纯化.在Eppendorf管中将胶捣碎，加入4倍体积的溶胶液Binding Buffer，65℃水浴7min，其间每2min轻摇Eppendorf管一次使胶完全熔化，取750μl加到柱子上，12000rpm离心1min，弃去液体，加入300μlBinding Buffer，离心弃去液体，加入750μl Washing Buffer，离心弃去液体，重复一次，空柱子12000rpm离心1min以甩干液体，将柱子放于1.5ml Eppendorf管，加入30μl无菌ddH2O，37℃保温2min，12000rpm离心1min，将得到的PCR产物取2μl电泳检测定量，其余贮于-20℃备用。
PCR产物的亚克隆将纯化的PCR产物与pMD-18T载体(购自Takara公司)连接。
连接体系如下10×Ligation Buffer1μlpMD-18T载体1μl纯化后的PCR产物5μlddH2O 2μlT4 DNA Ligase 1μl总反应体积 10μl连接反应液16℃水浴放置过夜后，存于-20℃备用。
实施例4阳性重组子pMD-gh和pMD-vp28的酶切鉴定1.氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞1)以无菌牙签挑取固体LB平板上的新复苏的大肠杆菌JM109(购自promega公司)单菌落，接种到5ml LB培养基中，37℃，250rpm摇床活化过夜。
2)取10-20μl上述活化大肠杆菌，接种到5ml新鲜LB培养基中，37℃，250rpm培养2-3h，至OD600值为0.4-0.6。
3)取1.5ml步骤2的菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4000rpm，4℃离心10min，用移液枪吸干上清。
4)加入800μl冰预冷的0.1M氯化钙，轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min，4000rpm，4℃离心10min，用移液枪吸干上清。
5)加入100μl冰预冷的0.1M氯化钙溶液重悬沉淀，得到制备好的感受态细胞。置于4℃保存，2天内使用。
2.重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞1)取连接反应液(不超过10μl体积)，加入到100μl上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。
2)42℃水浴中热激90s，迅速移至冰中冰浴2min。
3)加入390μl新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，使细胞复苏50min。
4)4000rpm离心5min，吸弃400μl上清，将剩余的菌液用移液枪轻轻混匀。
5)取100μl细菌悬液，均匀涂在含IPTG、X-gal、Amp的LB平板上，正向放置1-2h，直至液体被充分吸收，倒置平板，于37℃培养箱中培养过夜，利用α-互补作用筛选阳性克隆。
3.阳性重组子pMD-gh和pMD-vp29的酶切鉴定用EcoR I和Xba I对所提取的质粒DNA进行双酶切，酶切体系如下质粒DNA pMD-gh8μlEcoR I0.5μlXba I0.5μl10×H buffer1μl总反应体积10μl质粒DNA pMD-vp288μl
Xba I1μl10×H buffer1μl总反应体积::10μl以上酶切反应条件均为37℃，反应时间4h。酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。
实施例5融合基因的制备及穿梭质粒的构建1.重组穿梭质粒-pPIC6αC-gh的构建用EcoR I和Xba I双酶切PMD-gh和pPIC6αC，目的片段胶回收后连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，小量提取质粒，用用EcoR I和Xba I双酶切鉴定阳性重组子，重组质粒命名为pPIC6αC-gh。
2.重组穿梭质粒-pPIC6αC-gh+vp28的构建用Xba I单酶切PMD18-vp28，将回收的目的片段与XbaI单酶切的pPIC6αC-gh连接，鉴定vp28正反向连接。选取正向连接的单克隆，提取质粒，命名为pPIC6αC-(gh+vp28)，并送上海生工有限公司测序。重组穿梭质粒-pPIC6αC-gh+vp28的构建过程见图1。
3.PCR扩增gh、vp28基因和穿梭质粒pPIC6αC-(gh+vp28)的酶切鉴定以pPIC6αC-(gh+vp28)穿梭质粒为模板，分别进行gh和WSSVvp28基因PCR，PCR产物大小位置符合gh、vp28大小。pPIC6αC-(gh+vp28)穿梭质粒用EcoRI+XbaI双酶切和XbaI单酶切，获得GH和VP28目标片段。pPIC6αC-(gh+vp28)穿梭质粒为47500bp，位置大小符合。以pPIC6αC-(gh+vp28)穿梭质粒为模板，以prime1、prime4为引物进行PCR，PCR产物为(gh+vp28)全长融合基因，大小为1197bp；以pPIC6αC-(gh+vp28)穿梭质粒为模板，以AOX1进行PCR，获得约1750bp目标带，位置大小符合。重组穿梭质粒pPIC6αC-(gh+vp28)的酶切和PCR鉴定见图2。以上结果表明经PCR和酶切鉴定，gh和vp28基因以前后顺序准确地插入到pPIC6αC穿梭质粒的克隆位点EcoRI和XbaI之间，经上海生工测序，基因序列完全一致，符合翻译阅读框。重组穿梭质粒pPIC6αC-(gh+vp28)的构建过程见图1。
实施例6酵母基因工程菌的构建、筛选和鉴定1.重组穿梭质粒-pPIC6αC-(gh+vp28)酵母X-33(1)转化酵母重组质粒的线性化小量制备重组表达质粒DNA15-20μg，用RNase A在37℃消化30min，然后在100μl体系中用限制性内切酶Bstx1进行酶切线性化，37℃水浴锅中保温4h后，用苯酚∶氯仿(25∶24)抽提一次，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，加0.1体积的3M的乙酸钠(pH5.2)、2.5倍体积的无水乙醇，混匀置于-20℃沉淀过夜，4℃、12000rpm离心20min，弃上清，用超纯水配置的75％的乙醇洗盐2次，自然晾干后，用5-10μl TE溶液溶解沉淀，-20℃保存备用。用限制性内切酶Bstx I酶切线性化空载体质粒pPIC6αC，作为阴性对照。
(2)酵母感受态细胞的制备用无菌牙签挑取一酵母单菌落，接种于5ml YPD中，30℃、260rpm振摇培养过夜，第二天取200μl酵母菌液接种于20ml YPD，30℃、280rpm振摇培养到OD600为0.6～0.8时，转至无菌离心管，室温(20～25℃)、4000rpm离心10min，去上清，收集菌体，用25ml无菌ddH2O重悬，室温、4000rpm离心10min，去上清，收集菌体，再用1ml无菌ddH2O重悬，转到1.5ml的Eppendorf管中，室温、4000rpm离心10min，去上清，收集菌体，加1ml 0.1M LiCl重悬菌体，用微型离心机最大转速离心15sec，弃尽上清，用400μl 0.1M LiCl重悬菌体，用1.5ml的Eppendorf管，每管100μl分装使用。
(3)重组表达质粒转化酵母菌X-33将以上制备的100μl酵母感受态细胞，最大转速离心15sec，弃尽上清，向该Eppendorf管中严格按以下顺序加入试剂基因240μl50％PEG
36μl1M LiCl25μl 2mg/ml single-stranded DNAlinearized pPIC6αC-gh+vp28 DNA in 50μl sterilewater在漩涡振荡器上剧烈振动大约1min，使各试剂成分充分混合均匀，细胞充分悬浮后；将混合液在30℃条件下静置孵育30min，接着42℃热激20～25min，然后室温下6000-8000rpm离心5min，弃上清，用1mlYPD重悬细胞，30℃、200rpm振摇培养，1h后取细胞培养液100μl涂布于含300μg/ml Blasticidin的YPD平板上。将平板正放于30℃培养箱，至平板表面液体吸干，倒置培养2～3天，观察单菌落的形成.同时按同样方法转化线性化空载体质粒pPIC6αC，作为阴性对照。
2.酵母基因组的提取从YPDS平板上挑取10～20酵母单菌落，分别接种于3mlYPD培养液中，将1.5ml过夜培养液转到1.5ml的Eppendorf管中，室温20～25、12000rpm离心1min，弃上清，将细胞重悬于50μl STES缓冲液中；向酵母悬液中加入50μl酸洗过的玻璃珠。每管加入20μl TE(pH7.6)，然后加入60μl苯酚∶氯仿(25∶24)，盖紧盖子。先振荡1min，使有机相和水相充分混合，然后每振荡30sec就将Eppendorf管插在冰上，重复振荡6次。室温、12000rpm离心8min，将上层的水相转移到一个新的1.5ml的Eppendorf管中，分别加1/10体积的3mol/l的NaAc(pH5.3)、2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀20min，4℃、12000rpm下离心10min，去上清，沉淀用75％的乙醇洗涤1次，12000rpm离心2min，去上清，空气干燥沉淀后，将沉淀溶解于40μl TEBuffer(pH7.6)，得基因组样品。取6μl样品作琼脂糖电泳检测。使用前将基因组样品在沸水中煮5min，然后立即插在冰上或-20℃冻存备用.可以取1～10μl基因组溶液作为PCR鉴定的模板。用空菌X-33为空对照，用转化了空载体pPIC6αC的菌株X-33(pPIC6αC)为阴性对照。
3.重组酵母菌X-33(pPIC6αC-(gh+vp28))的PCR鉴定以酵母基因组为模板，引物分别为通用引物AOX1、prime1、2，prime3、4，prime1、4为引物。同时分别以PMD-18-gh和pUCm-vp28为模板进行PCR，其产物作为阳性对照。PCR反应条件为95℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min30s，30个循环后，72℃ 10min。
提取酵母基因组作为模板，分别以AOX1，prime1、2，prime3、4，prime1、4为引物进行PCR，大小分别为1750bp、615bp、582bp、1197bp。阳性菌基因组PCR鉴定见图3。结果表明线性化pPIC6αC-(gh+vp28)穿梭质粒准确地整合到酵母基因组的特定位点，得到基因工程重组菌株。
实施例7基因工程融合蛋白GH+VP28蛋白在毕赤酵母中的诱导表达1.基因工程融合蛋白GH+VP28蛋白在毕赤酵母中的诱导表达用无菌牙签从纯化平板上挑取重组酵母X-33(pPIC6αC-(gh+vp28))单菌落，接种于20mlYPD培养液中，30℃、260rpm振摇培养过夜，取此菌液按2％体积比转接于100ml BMGY培养基中，30℃、200rpm振摇培养20h。4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，用100mlBMMY重悬菌体，每隔24h按培养液的0.5％体积补充无水甲醇，28℃、200rpm振摇培养120h，诱导外源蛋白表达。每24小时取样一次，4℃、4800rpm离心10min，收集表达上清，加入适量的蛋白酶抑制剂PMSF、EDTA和抑菌剂叠氮钠，贮存于-20℃。
取诱导48、72、96小时的样品和阴性对照96小时的样品跑SDS-PAGE做Western Blot。
2、目标蛋白GH+VP28的Western Blot鉴定(1)当SDS-PAGE将要结束时，用双蒸水淋洗石墨板后用纸巾揩干电极板上黏附的液滴。
(2)戴一次性手套裁切六张滤纸和一张纤维素滤膜，其大小应与凝胶大小完全吻合，用软铅笔在滤膜的一角做好标记。
a.滤膜漂浮于装有去离子水的平皿中，借毛细作用使之从下往上湿润，在水中至少浸泡5min，以驱除留于滤膜上的气泡。
b.将剪好的滤纸浸泡于转移缓冲液中，时间为15-30min(3)戴一次性手套按如下步骤安装转移装置a.平放半干电转仪的底部电极，石墨一边朝上。
b.其上放置三张浸泡好的滤纸，精确对齐，用玻璃棒赶走气泡。
c.把润湿后的滤膜放于滤纸之上，标记面朝上，精确对齐，用玻璃棒赶走气泡。
d.将用于转膜的凝胶在盛有去离子水的平皿中略微漂洗一下，放于NC膜上，把凝胶的左下角置于NC膜的标记角上，精确对齐，轻轻赶走气泡。
e.再在凝胶上放三张浸泡好的三张滤纸，对齐并赶走气泡。
(4)放上另一半电极，用胶布将两部分电极固定。连接电源，将电转仪置4℃冰柜，电转1.5-2h。
(5)从上到下拆卸转移装置，逐一掀去各层，将膜放入装有10ml封闭液的小平皿中，在摇摆床上室温摇动60min，凝胶银染以检测转膜效率。
(6)将膜用镊子取出，用TBST冲洗后，转入20ml TBST稀释的抗VP28(1∶3000)溶液室温摇动30min。
(7)室温用50ml TBST中冲洗膜，连续洗四次，每次15min。
(8)将膜转入20ml TBST稀释辣根过氧化物酶交联的羊抗兔IgGs(1∶10000)溶液中室温摇动30min。
(9)重复步骤(7)(10)室温以PBS洗膜15min以去除过量的磷酸盐和吐温20。
(11)将膜浸泡于10ml DAB显色液中10-30min，直至蛋白条带出现。
(13)以PBS清洗以终止显色反应。
挑选五个阳性重组菌表达用甲醇小量诱导表达，发现了1个高表达菌，酵母菌的表达产物为66KD，表达量达到10mg/l，因为α因子信号序列及HIS尾巴有11.5KD，可以肯定此产物的α因子信号序列没有被切除.
取离心后的5mL发酵液，超滤浓缩10倍后，取40μL样品跑10％SDS-PAGE，银染显色。并做Western Blot印迹反应鉴定目的蛋白，SDS-PAGE与Western Blot分析鉴定见图4。结果表明在约66kDa处出现目标带。
实施例8基因工程融合蛋白GH+VP28蛋白的纯化重组酵母菌经甲醇诱导后离心收集上清，盛入透析袋(截留分子量10KD)经聚乙二醇浓缩到近干的程度(可反复添加)，然后加入binding buffer，摇匀。(以上操作均在4℃，并有防腐剂的情况下进行)准备上N2+-HIS BAND柱。
1)Ni2+柱用柱内介质体积10倍的1×Binding Buffer(0.5mM咪唑，0.5mM NaCl，2mMTris-HCl)10倍体积的无菌水洗柱床，用10倍体积的1×Charge Buffer(50mMNiSO4)补充Ni2+，再用10倍体积的1×Binding Buffer清洗柱床，准备开始亲和层析。
2)蛋白溶液用蠕动泵以循环方式加入到平衡好的亲和层析柱中，使带有His6的样品充分Ni2+结合，过夜后从Ni2+柱出口收集与Ni2+反应后的样品(即穿漏液)。
3)使20倍体积的1×Binding Buffer洗柱，以冲洗下留在柱内的少量未与Ni2+结合的样品。
4)用10mM～100mM的咪唑溶液洗脱Ni2+柱上非目的蛋白(洗脱液体积与浓度视总蛋白含量及非目的蛋白与Ni2+结合能力灵活变化)。
5)用1×Elute Buffer(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl)洗脱Ni2+柱，目的蛋白洗脱下来，以2mL为单位收集洗脱液。
6)取收集的每一管蛋白进行10％SDS-PAGE电泳检测目的蛋白在洗脱液中的分布。
7)Ni2+柱用1×Elute Buffer继续洗脱，洗掉柱床中的全部剩余蛋白，再用1×StripBuffer(100mM EDTA，0.5M NaCl，20mMTris-HCl)洗去柱子上的Ni2+离子。
8)组氨酸亲和层析柱的洗涤，再生和保存。
一般来说，Ni2+亲和层析柱可以反复使用3-4次，在再次使用前须洗涤而不需再生，若反复多次使用则需再生。
(1)用2倍体积的6M盐酸胍、0.2M的乙酸溶液洗组氨酸亲和层析柱；(2)用2倍体积的去离子水洗柱；(3)用1倍体积2％SDS洗柱；(4)用1倍体积25％乙醇洗柱；(5)用1倍体积50％乙醇洗柱；(6)用1倍体积75％乙醇洗柱；(7)用5倍体积100％乙醇洗柱；(8)依次重复步骤6、5、4各一次；(9)用1倍体积的去离子水漂洗柱一次；(10)用5倍体积100mM EDTA(pH8.0)洗柱，彻底去除层析柱上的Ni2+离子；(11)将再生的层析柱置于含0.1％叠氮钠的20％乙醇溶液中，4℃保存.
实施例9基因工程融合蛋白对对虾的促生长作用将体重约4g的健康鳌虾随机分成2组，每组40尾(每组平均体重4±0.2g)注射给样实验组1、2按照虾体重每克于腹节浅层肌肉处分别注射10μL 0.4mg/mL和10μL 0.2mg/mL重组蛋白GH+VP28，阴性对照注射生理盐水。每隔1周注射1次，共注射5次。在22～25℃条件下养殖，每天换水并投喂人工虾饲料，每周每组称重并做记录。体重增长率(％)＝〔(Wt-W0)/W0〕x100。Wt、W0分别为注射后、注射前平均体重。
各组实验虾在5周的注射期间成活率均为100％，实验的测量数据用平均数±标准差(x±s)表示。经5周实验，实验组1的体重增长率比对照组快20％，组2比对照组快8％。经t检验，与对照组相比，组1体重有显著差异，组2差异不显著。以上实验数据均为三组重复实验所得，结果见表1和图5。结果表明融合蛋白GH+VP28对虾体生长有促进作用表1各组实验虾经5w后平均体重统计Tablel.The avarage weights of three group shrimp injectedGH+VP28 for 5w
实施例10重组蛋白GH+VP28抗WSSV感染作用将体重约10g的健康鳌虾随机分成3组，每组20尾。注射给样按照虾体重每克每组注射10μL样品，于倒数第3腹节浅层肌肉处注射，分两次注射，间隔5d。实验组注射0.4mg/mL重组蛋白GH+VP28。第2次注射2d后，将WSSV粗提液用TN buffer稀释1倍[11]，注射感染鳌虾；阳性对照组按照虾体重每克注射TNbuffer，第2次注射2d后，按同样的方法注射WSSV感染鳌虾；阴性对照组按照虾体重每克注射TN buffer，第2次注射2d后，再注射一次，继续饲养。在22℃～25℃条件下养殖，每天换水并投喂人工虾饲料，记录虾死亡的情况。
在22-25℃的条件下养殖的结果显示，注射纯化融合蛋白GH+VP28蛋白组的鳌虾8d后累积死亡率为35％，阳性对照组的鳌虾在感染WSSV 9d后累积死亡率达到了100％，并在3-5d达到死亡高峰，而注射了TN buffer的阴性对照组鳌虾无任何病理现象。以上实验数据均为三组重复实验所得，结果见图6。表明注射重组融合蛋白GH+VP28可以明显提高对虾抗WSSV感染力。
SEQUENCE LISTING1<110>武汉大学<120>对虾抗病毒促生长双功能工程菌株及构建方法和应用<130>对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28和鲤鱼生长激素融合蛋白核苷酸序列<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1194<212>DNA<213>重组DNA<220>
<221>CDS<222>(1)..(1194)<223>
<400>1tca tca gac aac cag cgg ctc ttc aat aat gca gtc att cgt gta caa 48Ser Ser Asp Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile Arg Val Gln1 5 10 15cac ctg cac cag ctg gct gca aaa atg att aac gac ttt gag gac agc 96His Leu His Gln Leu Ala Ala Lys Met Ile Asn Asp Phe Glu Asp Ser20 25 30ctg ttg cct gag gaa cgc aga cag ctg agt aaa atc ttc cct ctg tct144Leu Leu Pro Glu Glu Arg Arg Gln Leu Ser Lys Ile Phe Pro Leu Set35 40 45ttc tgc aat tct gac tac att gag gcg cct gct gga aaa gat gaa aca192Phe Cys Asn Ser Asp Tyr Ile Glu Ala Pro Ala Gly Lys Asp Glu Thr50 55 60cag aag agc tct atg ctg aag ctt ctt cgc atc tct ttt cac ctc att240Gln Lys Ser Ser Met Leu Lys Leu Leu Arg Ile Ser Phe His Leu Ile65 70 75 80gag tcc tgg gag ttc cca agc cag tcc ctg agc gga acc gtc tca aac288Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Gln Ser Leu Ser Gly Thr Val Ser Asn85 90 95agc ctg acc gta ggg aac ccc aac cag ctc act gag aag ctg gcc gac336Ser Leu Thr Val Gly Asn Pro Asn Gln Leu Thr Glu Lys Leu Ala Asp100 105 110ttg aaa atg ggc atc agt gtg ctc atc cag gca tgt ctc gat ggt caa 384Leu Lys Met Gly Ile Ser Val Leu Ile Gln Ala Cys Leu Asp Gly Gln
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SEQUENCE LISTING2<110>武汉大学<120>对虾抗病毒促生长双功能工程菌株及构建方法和应用<130>对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28和鲤鱼生长激素融合蛋白氨基酸序列<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>397<212>PRT<213>重组蛋白质<400>1Ser Ser Asp Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile Arg Val Gln1 5 10 15His Leu His Gln Leu Ala Ala Lys Met Ile Asn Asp Phe Glu Asp Ser20 25 30Leu Leu Pro Glu Glu Arg Arg Gln Leu Ser Lys Ile Phe Pro Leu Ser35 40 45Phe Cys Asn Ser Asp Tyr Ile Glu Ala Pro Ala Gly Lys Asp Glu Thr50 55 60Gln Lys Ser Ser Met Leu Lys Leu Leu Arg Ile Ser Phe His Leu Ile65 70 75 80Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Gln Ser Leu Ser Gly Thr Val Ser Ash85 90 95Ser Leu Thr Val Gly Asn Pro Asn Gln Leu Thr Glu Lys Leu Ala Asp100 105 110Leu Lys Met Gly Ile Ser Val Leu Ile Gln Ala Cys Leu Asp Gly Gln115 120 125Pro Asn Met Asp Asp Asn Asp Ser Leu Pro Leu Pro Phe Glu Asp Phe130 135 140Tyr Leu Thr Met Gly Glu ASn Asn Leu Arg Glu Ser Phe Arg Leu Leu145 150 155160Ala Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Arg Val165 170 175Ala Asn Cys Arg Arg Ser Leu Asp Ser Asn Cys Thr Leu Glu Phe Leu180 185 190Glu Met Asp Leu Ser Phe Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Ile Leu Ala195 200 205Ile Thr Ala Val Ile Ala Val Phe Ile Val Ile Phe Arg Tyr His ASh210 215 220Thr Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu Thr Asn
225 230 235 240Met Asp Glu Asn Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser Gly245 250 255Tyr Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly Lys260 265 270Ile Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu Asp275 280 285Ala Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val Thr290 295 300Val Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn Asn305 310 315 320Thr Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Pro Lys Ile325 330 335Asn Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe Thr340 345 350Pro Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly Thr355 360 365Thr Phe Gly Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe Asp370 375 380Met Tyr Val His Val Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu385 390 39权利要求
1.一种毕赤酵母基因工程菌株，其特征在于该菌株为毕赤酵母Pichia pastoris X-33 pPIC6αc-GH+vp28，CCTCC M206101。
2.一种用于权利要求1所述的毕赤酵母菌株的制备方法，它包括下列步骤A、鲤鱼生长激素基因的制备取鲤鱼脑垂体，按照RNA提取试剂盒的方法提取总RNA，电泳分析RNA质量，根据鲤鱼GH肽的序列设计引物，在引物两端分别引入限制性内切酶，将原有的终止密码子TAG突变，便于基因的融合，按照反转录试剂盒的方法进行cDNA合成和PCR扩增，PCR产物通过凝胶电泳检测，将获得的基因测序后克隆于载体中，挑取菌落提取质粒进行酶切鉴定，得到的阳性克隆子是包含涉及GH基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏；B、WSSV的vp28基因的制备首先是WSSV病毒基因组的制备，于冰上取病虾的肺、胃和心脏，冰浴匀浆，然后加入蛋白酶K/100μg/ml，于沸水中煮15min，冰浴5min，12,000r/min离心10min取其上清液做模板DNA，4℃保存；其次是PCR扩增vp28基因，扩增引物合成，根据GeneBank中的WSSV序列设计PCR寡核苷酸扩增引物，采用PCR方法扩增目的基因vp28，PCR产物通过凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆入载体中，挑取菌落提取质粒进行酶切鉴定，得到的阳性克隆子是包含vp28基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏；C、融合基因的制备及穿梭质粒的构建首先是穿梭质粒pPI6αc-GH的构建，酶切含有GH基因的重组质粒和穿梭质粒pPI6αc，胶回收目含有GH基因的条带，16℃连接后转化到感受态E.coli中，得到的阳性克隆子是包含涉及GH基因的大肠杆菌，为pPI6αc-GH；其次是穿梭质粒pPI6αc-GH-vp28的构建，酶切含有vp28基因的重组质粒和含有GH基因的穿梭质粒pPI6αc-GH，胶回收目vp28基因的条带，16℃连接后转化到感受态E.coli中，得到的阳性克隆子/pPI6αc-GH-vp28是包含涉及GH+vp28融合基因的大肠杆菌；D、酵母基因工程菌的构建酶切重组穿梭质粒pPI6αc-GH-vp28使其线性化，转化酵母X33感受态细胞，挑取转化子，提取酵母基因组DNA，用特异引物和通用引物分别进行PCR检测，筛选出阳性转化子pPI6αc-GH-vp28/X33，得到的阳性克隆即为同时表达GH基因和vp28基因的基因工程菌株；E、基因工程融合蛋白的制备在毕赤酵母中有两个编码乙醇氧化酶的基因AOX1和AOX2，利用甲醇为唯一碳源生长，培养基中存在碳源时，AOX基因不表达，在毕赤酵母工程菌株中，外源基因被克隆至AOX1启动子控制下，以甲醇为诱导剂，是唯一碳源，在诱导表达时，补充甲醇0.5％的含量。
3.毕赤酵母基因工程菌株在对虾养殖业中的应用。
4.毕赤酵母基因工程菌株在制备治疗或预防对虾感染药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白vp28和鲤鱼生长激素GH融合蛋白的基因工程菌株及构建方法和应用。从鲤鱼脑垂体中提取总RNA，反转录得到GH基因；从罹病对虾虫体中提取WSSV并通过PCR的方法制备vp28基因；构建含有生长激素GH基因和WSSVvp28基因的穿梭质粒pPIC6αc－GH－vp28。酶切pPIC6αc－GH－vp28使其线性化，转化酵母X33感受态细胞。经甲醇诱导，基因工程融合蛋白GH+VP28蛋白在毕赤酵母中表达；基因工程融合蛋白既能促对虾生长，提高对虾养业产量，同时也能提高对虾对WSSV的免疫力和抗病力。
文档编号C12N15/33GK101016519SQ20061012465
公开日2007年8月15日 申请日期2006年9月29日 优先权日2006年9月29日
发明者孟小林, 徐进平, 龙燕, 王健, 鲁伟, 韩建山 申请人:武汉大学