专利名称：一种应用多重pcr快速检测致病性溶藻弧菌的方法
技术领域：
本发明属于一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法。
背景技术：
随着网箱养殖规模的扩大，病害发生也日益频繁，严重制约了水产养 殖业的健康发展。面对不断增多的病原种类，单靠传统的微生物培养方法 已经不能满足病害防治的需要。因此，建立灵敏、快速、准确的病原检测 技术是及时有效地控制与预防致病菌传播的前提。目前对致病菌的检测，
主要依赖于常规微生物学方法， 一般需5 7d时间，比较费时费力；另外
应用免疫酶试验、免疫荧光试验、基因探针等方法，其灵敏度相对较低、
特异性较差，难以推广。自从PCR技术建立，以其敏感度高、特异性强、 操作简便、快速而被广泛应用于致病菌的检测，但常规PCR易受环境因素 的影响，检测结果易出现假阳性，从而导致错误的诊断。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的不足，提供一种应用多 重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法。
为实现上述目的本发明采取的技术方案是按以下步骤-(l)DNA模板提取-
(D取具有弧菌病症状的水产养殖动物病灶组织心、肝、脾、肾和溃疡 部位等，匀浆，取匀浆液1.5mL， 10000 g离心10 min，沉淀用双蒸水悬 浮，再10000 g离心10 mhi，将沉淀悬浮于l mL双蒸水中，在沸水中煮 8 10min， 10000 g离心10 min，其上清液即为DNA模板。
②取未具有弧菌病症状的水产养殖动物组织心、肝、脾、肾和肌肉等，
匀浆，加入TSB培养基在28。C 140 r/min摇床上培养18 h，取匀浆液1.5 mL， 10000 g离心10 min，沉淀用双蒸水悬浮，再10000 g离心10 min，将沉淀 悬浮于lmL双蒸水中，在沸水中煮8 10min， 10000 g离心10 mm，其上 清液即为DNA模板。
(2)多重PCR三对引物分别为 A: 5'-TGGTGAACAGCCAGTAAA-3'， 5,-CAAACCCATCATAAGTAGTC-3' B: 5'-GGCGGTCGCTCTGGTATT-3'， 5'-TTGCCATCGTAAGTGCTGTA-3' C: 5'-CAGAAGAATCGGAAGAACA-3', 5'-TAGAATGACGCACAAAGG-3';
设计A、 B和C上下游引物各20D,引物A上、下游引物分别用1040^L 和980pL双蒸水稀释，引物B上、下游引物分别用1240pL和l060pL双蒸水 稀释，引物C上、下游引物分别用920pL和10(X)nL双蒸水稀释。
(3)多重PCR反应体系为
10xPCR缓冲液 2.5 mL(已加Mg2+，终浓度为1.5 mmol/L)
dNTP混合液 2 nL (终浓度0.25 mmol/L)
引物A、 B、 C 上下游各2ML(终浓度0.5fimol/L)
DNA模板 lML(约0.1吗)
ExTaq 1 nL(终浓度2U)
ddH20 14.5 nL
总体积 25 fiL
(4) 多重PCR反应条件为94。C5min: 94。C 1 mm' 65。C lmin， 72。C 1.5min，共30个循环72°C 10 min 。
(5) 取10pL多重PCR反应液，按常规DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测 反应液中扩增的条件，在凝胶成像系统中照像，如出现图l的反应条带则致 病菌为溶藻弧菌。
为了尽量克服PCR检测溶藻弧菌带来的假阳性，三对引物同时放入到 PCR体系中同时扩增，构成多重PCR检测法。引物A、 B、 C分别是根据溶 藻弧菌的三种外毒素基因序列即咬原蛋白酶、外膜蛋白K和ToxR的保守区 设计的，对溶藻弧菌有较强的特异性。与普通PCR检测方法相比，本实验 采用的多重PCR有更高的灵敏度和准确性；与采用免疫学ELISA检测方法 相比，多重PCR花费小、检测时间短、实验条件要求相对也不太严格。
图1是多重检测溶藻弧菌电泳结果图。
具体实施例方式
本发明用下列实施例来进 一 步说明。 实施例1
取具有弧菌病症状的红笛鲷(￡"^/2船eo^o/^nw)溃烂的肌肉组织5 g， 用匀浆器匀浆。取部分匀浆液装入1.5 ml离心管中10000 g离心10 min，取 沉淀用1.5 ml双蒸水重悬，再10000 g离心10 mm;取沉淀用1 ml双蒸水重 悬，盖上离心管盖，放入沸水中煮8mm, 10000 g离心10 mm，将上清液倒 入另一离心管中，作为多重PCR的DNA模板。
取200 mL离心管，在分别加入10xPCR缓冲液2.5 jxL, dNTP混合液终 浓度0.25 mmol/L、引物A、 B、 C上下游各2 pL、 DNA模板1〖iL、 ExTaq2 U,加入双蒸水至总体积为25 ^L。将离心管放入MJ PTC200 PCR仪中，以 94。C 5 mm; 94。C 1 min， 65。C lmin， 72。C 1.5mm，共30个循环;72。C 10 min 扩增，取反应液10pL进行DNA琼脂糖凝胶电泳(胶浓度为1%)，在凝胶成 像系统中能看到如图l的三条清晰带，证明引起这次红笛鲷弧菌病病原为溶 藻弧菌。
实施例2
取已发有部分奸死亡养殖池中并未有弧菌病症状斑节虾(尸ewae^ j'"/w&aw)肌肉组织5 g,用匀浆器匀浆。加入TSB培养基在28。C i40r/min 摇床上培养18 h，取部分已培养的匀浆液装入1.5mi离心管中10000 g离心 10 min,取沉淀用1.5 ml双蒸水重悬，再10000 g离心10 mm;取沉淀用1 ml 双蒸水重悬，盖上离心管盖，放入沸水中煮8mm， 10000 g离心10 mm，将 上清液倒入另一离心管中，作为多重PCR的DNA模板。 取200 离心管，在分别加入10xPCR缓冲液2.5 pL、 dNTP混合液终浓度 0.25mmol/L、引物A、 B、 C上下游各2^iL、 DNA模板1 pL、 ExTaq2U, 加入双蒸水至总体积为25 pL。将离心管放入ABI 9700 PCR仪中，以94°C 5 mm; 94。C 1 min, 65。C lmin， 72。C 1,5min，共30个循环:72。C 10 mm扩 增，取反应液lOpL进行DNA琼脂糖凝胶电泳(胶浓度为1%)，在凝胶成像 系统中能看到如图1的三条清晰带，证明虾池中的斑节虾已感染致病性溶藻 弧菌，过一段时间会发病，需及早进行治疗。
权利要求
1. 一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法，其特征是按以下步骤；(1)DNA模板提取①取具有弧菌病症状的水产养殖动物病灶组织心、肝、脾、肾和溃疡部位等，匀浆，取匀浆液1.5mL，10000g离心10min，沉淀用双蒸水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1mL双蒸水中，在沸水中煮8～10min，10000g离心10min，其上清液即为DNA模板；②取未具有弧菌病症状水产养殖动物组织心、肝、脾、肾和肌肉等，匀浆，加入TSB培养基在28℃140r/min摇床上培养18h，取匀浆液1.5mL，10000g离心10min，沉淀用双蒸水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1mL双蒸水中，在沸水中煮8～10min，10000g离心10min，其上清液即为DNA模板；(2)多重PCR三对引物分别为A5′-TGGTGAACAGCCAGTAAA-3′，5′-CAAACCCATCATAAGTAGTC-3′B5′-GGCGGTCGCTCTGGTATT-3′，5′-TTGCCATCGTAAGTGCTGTA-3′C5′-CAGAAGAATCGGAAGAACA-3′，5′-TAGAATGACGCACAAAGG-3′；(3)多重PCR反应体系为10×PCR buffer 2.5μl(已加Mg2+，终浓度为1.5mmol/L)dNTP mixture2μL(终浓度0.25mmol/L)引物上下游各2μL(终浓度0.5μmol/L)DNA模板 1μL(约0.1μg)ExTaq 1μL(终浓度2U)ddH2O 14.5μL总体积 25μL(4)多重PCR反应条件为94℃ 5min；65℃ 1min；72℃ 1.5min，共30个循环，72℃ 10min；(5)取10μL多重PCR反应液进行DNA琼脂糖凝胶电泳，其中凝胶胶浓度为0.8-1.2％。
全文摘要
一种应用多重PCR快速检测致病性溶藻弧菌的方法，利用致病性溶藻弧菌外毒素基因保守区设计三对引物，建立多重PCR的快速准确的检测方法，取被感染致病性溶藻弧菌的水产养殖动物病灶组织匀浆，将匀浆的病灶组织加入TSB培养基在28℃140r/min摇床上培养18h，水煮法提取DNA作模板，应用三对引物组成的多重PCR方法进行检测，电泳结果出现三个片段，大小分别为424、319、173bp，而应用该法检测非溶藻弧菌感染的水产养殖动物结果则呈阴性。该方法特异性高，操作方便，检测成本低，检测时间短，可以标准化为产品，能够进行大批量样品检测，可以满足有关质检部门、养殖企业、研究单位等批量检测水产养殖动物体内致病性溶藻弧菌的需要。
文档编号C12Q1/68GK101205557SQ20061012433
公开日2008年6月25日 申请日期2006年12月22日 优先权日2006年12月22日
发明者吴灶和, 简纪常, 蔡双虎, 鲁义善 申请人:广东海洋大学