专利名称：一种质粒dna的提取方法及其提取装置的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物技术领域，特别涉及一种质粒DNA的提取方法及其提取装置。
背景技术：
质粒DNA的提取和纯化是分子生物学的最基本的步骤之一，分子克隆中的经典的质粒提取方法涉及很多的离心，限制了提取质粒的规模，从500mL培养物中只能收获2～5mg质粒，而且纯化过程复杂，且使用了有毒有害的物质。随着DNA疫苗和基因重组药物研究和应用的快速发展，对重组质粒的需求量在不断增加，常规的实验室制备及其方法已很难满足。目前还有一些大规模提取的方法是用各种类型的亲和层析柱，提取效果较好，但费用很高，也不易扩大规模。
发明内容
针对目前现有质粒提取技术存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供了一种质粒DNA的提取方法，该方法简化了质粒提取的过程，解决了规模化提取质粒的问题，并且产量高、纯度好。
本发明的另一目的在于提供上述质粒DNA的提取装置。
本发明的目的通过下述技术方案实现一种质粒DNA的提取方法，包括如下步骤(1)工程菌的培养将工程菌接种于改良TB(Terrific Broth)液体培养基中，37℃、300转/分钟振荡培养约12～14小时，得到对数晚期的培养物即OD值约为0.6的培养物；接种体积百分比为0.5～1％，所述改良TB液体培养基为将组分蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL溶解在900mL水中，各组分溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100mL经灭菌的170mmol/LKH2PO4和720mmol/L Na2HPO4的溶液。
(2)工程菌的裂解取步骤(1)中的培养物采用碱裂解法裂解工程菌。
(3)质粒的提取纯化裂解产物通过4～6层干酪包布进行过滤，收集滤液，加入RNA酶，使终浓度为20ug/mL，37℃作用20分钟，然后向滤液中加入0.6滤液体积的异丙醇，室温(20～25℃)放置2分钟，沉淀质粒，然后用孔径为0.22μm混合纤维素酯微孔滤膜过滤，弃去滤液，质粒留在膜上，用70％的乙醇冲洗混合纤维素酯微孔滤膜2～3次，风干滤膜，最后用50～60℃的双蒸水或pH8.0的TE(Tris/EDTA)溶解质粒DNA，即可得到质粒DNA。
所述工程菌包括DH5或TOP10等。
为了更好地实现本发明，所述灭菌的170mmol/L KH2PO4和720mmol/LNa2HPO4的溶液按下述方法制备而成将2.31g KH2PO4和12.54g Na2HPO4溶在100ml的水中，高压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌。
本发明还提供了上述质粒DNA的提取装置，该装置包括碱裂解用容器(1)、质粒沉淀用容器(4)、盛质粒用容器(8)和滤器，所述碱裂解用容器(1)与质粒沉淀用容器(4)通过装有干酪包布的滤器(2)相连，质粒沉淀用容器(4)与盛质粒用容器(8)通过装有混合纤维素酯微孔滤膜的滤器(5)相连，质粒沉淀用容器(4)、盛质粒用容器(8)上部均设有阀门(6)；质粒沉淀用容器(4)通过连接管(3)外接真空泵，且连接管(3)装有密封阀门；盛质粒用容器(8)通过连接管(7)外接真空泵，且连接管(7)装有密封阀门。
为了更好地实现本发明，所述碱裂解用容器(1)、质粒沉淀用容器(4)和盛质粒用容器(8)均采用不锈钢制成。
该装置可根据需要设计成不同大小规格，质粒沉淀用容器(4)为碱裂解用容器(1)体积的2～6倍。所述装有干酪包布的滤器(2)和装有混合纤维素酯微孔滤膜的滤器(5)均可为可换膜滤器。所述装有干酪包布的滤器(2)的滤膜为4～6层的干酪包布，所述装有混合纤维素酯微孔滤膜的滤器(5)的混合纤维素酯微孔滤膜孔径为0.22μm。
本发明对碱裂解质粒提取法进行了改进，省去了离心的步骤，简化了质粒提取的过程，并且解决了规模化提取质粒的问题，并且产量高，能从达每升培养液提取大约50mg质粒，纯度好，OD260/280的平均值为1.89。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本发明采用了改良的TB(Terrific Broth)培养基培养工程菌，提高了细菌和质粒的产量，明显高于用LB培养基发酵的工程菌；本发明利用了价格便宜、常用的干酪包布和0.22μm的混合纤维素酯微孔滤膜代替了经典方法中的过滤的步骤，节约了成本和时间，而且产量和纯度比较高，能达到一般分子生物学实验的要求；本发明利用了50～60℃的TE或双蒸水溶解质粒，提高了产量及效率；本发明可用于各种规模的质粒提取，从几毫升到几升，甚至更大规模的质粒提取；本发明可满足不同规模的质粒提取要求，提取过程简单易行，而且质粒产量和质量都很好，可用于酶切、连接和转化，还可以满足核酸疫苗的生产。
图1为改良Terrific Broth对工程菌产量的影响图。
图2为本发明提取的质粒琼脂糖电泳图谱。
图3为本发明提取的重组质粒的酶切鉴定图。
图4为本发明的提取装置的结构示意图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1质粒的小量制备，从3mL工程菌DH5培养物中提取质粒pMD-18T，可提取质粒296μg，OD260/280的值在1.8～2.0之间。
(1)工程菌的培养挑取LB固体培养基上生长的单菌落(工程菌DH5)，接种于2.0ml改良TB(含60μg/mL氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、300转/分钟剧烈振荡培养过夜(约12～14h)，得到对数晚期的培养物(OD值约为0.6)，接种体积百分比为0.5～1％。改良TB液体培养基将组分蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL溶解在900mL水中，各组分溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100mL经灭菌的170mmol/L KH2PO4和720mmol/L Na2HPO4的溶液(即将2.31g KH2PO4和12.54g Na2HPO4溶在100ml的水中，高压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌)。所加培养液(改良TB液体培养基)不超过所用培养容器的四分之一。
(2)工程菌的裂解采用《分子克隆》的碱裂解法裂解工程菌。
取步骤(1)中3ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。将细菌(培养出的工程菌)沉淀重悬于100μl预冷的溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。加200μl新鲜配制的溶液II，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2～3min，使细胞膜裂解(溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。加入150μl预冷的溶液III，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3～5min。溶液III为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
上述试剂按下述方法配制溶液I50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)，1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml，0.5M EDTA(pH 8.0)10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml，在10lbf/in2(6.895×104)高压灭菌15min，贮存于4℃。
溶液II0.2N NaOH，1％SDS，2N NaOH 1ml，10％SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配制。
溶液III醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8，5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
(3)质粒的提取纯化裂解产物通过4～6层干酪包布过滤，利用针筒式滤器和注射器来完成，收集滤液，加入RNA酶，终浓度为20ug/mL，37℃作用20分钟，然后向滤液中加入0.6滤液体积的异丙醇，室温放置2分钟，吸入注射器中，然后用孔径0.22μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，弃去滤液，质粒留在混纤膜上，用70％的乙醇冲洗混合纤维素酯微孔滤膜2～3次，充分风干滤膜，最后根据需要用50～60℃的双蒸水(或50～60℃的pH8.0的TE)溶解质粒DNA。所得质粒进行酶切连接转化等实验(见图3)。
如图1所示，为改良Terrific Broth对工程菌产量的影响。A1为1.5mL改良Terrific Broth(改良TB液体培养基)培养出的工程菌，A2为相同条件下LB培养出的工程菌，经测定其OD值，A1的细菌含量是A2的5倍。
如图2所示，为本发明提取的质粒琼脂糖电泳图谱。提取的质粒为pAdTrack，中间的是2000bp的marker，无RNA污染。
如图3所示，为本发明提取的重组质粒的酶切鉴定图。通过酶切证实本方法提取的质粒能满足一般分子生物学实验的要求。这是提取的含猪圆环病毒基因ORF2、ORF1+2和ORF1的质粒pAdTrack进行的酶切，得到了相应的片段，证明该法提取的质粒能满足分子生物领域试验的基本要求。
实施例2质粒的大规模制备同实施例1中的方法培养工程菌，要求所加培养液不超过所用培养容器的四分之一，300转/分钟剧烈震荡培养12小时。利用本发明的提取质粒的装置进行制备。从500mL工程菌可提取50mg质粒，OD260/280的值在1.8～1.9之间。其中加溶液I 60mL，溶液II 120mL，溶液III 90mL。
实施例3根据需要来选择，该装置可设计成不同大小规格。如图4所示，本发明的质粒DNA的提取装置，该装置包括碱裂解用容器1、质粒沉淀用容器4、盛质粒用容器8和滤器，所述碱裂解用容器1与质粒沉淀用容器4通过装有干酪包布的滤器2相连，质粒沉淀用容器4与盛质粒用容器8通过装有混合纤维素酯微孔滤膜的滤器5相连，质粒沉淀用容器4、盛质粒用容器8上部均设有阀门6；质粒沉淀用容器4通过连接管3外接真空泵，且装有密封阀门6；盛质粒用容器8通过连接管7外接真空泵，且装有密封阀门6；所述碱裂解用容器1、质粒沉淀用容器4和盛质粒用容器8采用不锈钢制成。该装置可根据需要设计成不同大小规格，质粒沉淀用容器4是碱裂解用容器1体积的2～6倍，装有干酪包布的滤器2和装有混合纤维素酯微孔滤膜的滤器5均可为可换膜滤器。所述装有干酪包布的滤器2的滤膜为4～6层的干酪包布，所述装有混合纤维素酯微孔滤膜的滤器5的混合纤维素酯微孔滤膜孔径为0.22μm。
碱裂解用容器1与装有干酪包布的滤器2相连，连接处密封，裂解液在与质粒沉淀用容器4相连的真空泵的作用下，经装有干酪包布的滤器2进入质粒沉淀用容器4，进入质粒沉淀用容器4后关闭其上部的阀门6，通过连接管3向质粒沉淀用容器4中的滤液中加入RNA酶和异丙醇，在与盛质粒用容器8连接的真空泵的作用下，经过装有孔径0.22μm混合纤维素酯微孔滤膜的滤器5进入盛质粒用容器8，质粒沉淀用容器4和盛质粒用容器8分别通过连接管3、连接管7外接真空泵，且装有密封阀门。
本发明质粒DNA的提取装置中的工艺流程如下把收集的工程菌放入碱裂解用容器1中，按照前述碱裂解法先后加入溶液I、溶液II、溶液III，碱裂解用容器1中的裂解液在真空泵的作用下通过装有干酪包布的滤器2(滤膜为4～6层的干酪包布)进入质粒沉淀用容器4，通过连接管3添加异丙醇，质粒沉淀后，在与盛质粒用容器8相连的真空泵作用下，通过装有0.22μm混合纤维素酯微孔滤膜的滤器5，质粒留在膜上，再向质粒沉淀用容器4中添加70％的乙醇，冲洗质粒两次，换一个清洁无菌的盛质粒用容器8，在质粒沉淀用容器4中加入双蒸水溶解质粒，通过真空泵作用，把质粒收集到清洁无菌的盛质粒用容器8。
如上所述，可较好地实现本发明。
权利要求
1.一种质粒DNA的提取方法，其特征在于包括如下步骤(1)工程菌的培养将工程菌接种于改良TB液体培养基中，37℃、300转/分钟振荡培养12～14小时，得到对数晚期的培养物即OD值为0.6的培养物；所述接种体积百分比为0.5～1％；所述改良TB液体培养基为将组分蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL溶解在900mL水中，上述各组分溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100mL经灭菌的170mmol/L KH2PO4和720mmol/LNa2HPO4的溶液；(2)工程菌的裂解取步骤(1)中的培养物采用碱裂解法裂解工程菌；(3)质粒的提取纯化裂解产物通过4～6层干酪包布进行过滤，收集滤液，加入RNA酶，使终浓度为20ug/mL，37℃作用20分钟，然后向滤液中加入0.6滤液体积的异丙醇，室温放置2分钟，沉淀质粒，然后用混合纤维素酯微孔滤膜过滤，弃去滤液，质粒留在膜上，用70％的乙醇冲洗混合纤维素酯微孔滤膜2～3次，风干滤膜，最后用50～60℃的双蒸水或pH8.0的TE溶解质粒DNA，即可得到质粒DNA。
2.根据权利要求1所述的质粒DNA的提取方法，其特征在于，所述工程菌包括DH5或TOP10。
3.根据权利要求1所述的质粒DNA的提取方法，其特征在于，所述灭菌的170mmol/L KH2PO4和720mmol/L Na2HPO4的溶液按下述方法制备而成将2.31g KH2PO4和12.54g Na2HPO4溶在100ml的水中，高压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌。
4.一种质粒DNA的提取装置，该装置包括碱裂解用容器(1)、质粒沉淀用容器(4)、盛质粒用容器(8)和滤器，其特征在于，所述碱裂解用容器(1)与质粒沉淀用容器(4)通过装有干酪包布的滤器(2)相连，质粒沉淀用容器(4)与盛质粒用容器(8)通过装有混合纤维素酯微孔滤膜的滤器(5)相连，质粒沉淀用容器(4)、盛质粒用容器(8)上部均设有阀门(6)；质粒沉淀用容器(4)通过连接管(3)外接真空泵，且连接管(3)装有密封阀门；盛质粒用容器(8)通过连接管(7)外接真空泵，且连接管(7)装有密封阀门。
5.根据权利要求4所述的一种质粒DNA的提取装置，其特征在于，所述碱裂解用容器(1)、质粒沉淀用容器(4)和盛质粒用容器(8)均采用不锈钢制成。
6.根据权利要求4所述的一种质粒DNA的提取装置，其特征在于，质粒沉淀用容器(4)为碱裂解用容器(1)体积的2～6倍。
7.根据权利要求4所述的一种质粒DNA的提取装置，其特征在于，所述装有干酪包布的滤器(2)和装有混合纤维素酯微孔滤膜的滤器(5)均为可换膜滤器。
8.根据权利要求4所述的一种质粒DNA的提取装置，其特征在于，所述装有干酪包布的滤器(2)的滤膜为4～6层的干酪包布，
9.根据权利要求4所述的一种质粒DNA的提取装置，其特征在于，所述装有混合纤维素酯微孔滤膜的滤器(5)的混合纤维素酯微孔滤膜孔径为0.22μm。
全文摘要
本发明公开了一种质粒DNA的提取方法及其提取装置，该方法包括如下步骤工程菌的培养；工程菌的裂解；质粒的提取纯化。本发明采用了改良的TB培养基培养工程菌，提高了细菌和质粒的产量；本发明利用了价格便宜、常用的干酪包布和混合纤维素酯微孔滤膜代替了经典方法中的过滤的步骤，节约了成本和时间，而且产量和纯度比较高；本发明利用了50～60℃的双蒸水或TE溶解质粒，提高了产量及效率；本发明可满足不同规模的质粒提取要求，提取过程简单易行，而且质粒产量和质量都很好，可用于酶切、连接和转化，还可以满足核酸疫苗的生产。
文档编号C12N15/63GK1958800SQ20061012371
公开日2007年5月9日 申请日期2006年11月23日 优先权日2006年11月23日
发明者宋长绪, 王建龙 申请人:广东省农业科学院兽医研究所