专利名称：大型真菌菌种的长期保藏方法
技术领域：
本发明涉及菌种保藏方法技术领域，特别是涉及大型真菌菌种的长期保藏方法。
背景技术：
目前大型真菌菌种的长期保藏方法主要有(A)液体石蜡保藏法，即在培养好的斜面上加上一层无菌无水液体石蜡，石蜡高出斜面1cm处，置于4-15℃保存，保存时间为3-5年。本方法的缺点是(1)耗时耗空间；(2)保存的菌种转接时生活力很低。(B)液氮超低温保藏法，即轻轻刮取平板上的菌丝体使成菌悬液，或用保护剂制成孢子悬液，加入10％的甘油或10％二甲基亚砜，吸取0.5-0.8mL悬液注入安瓿管中，熔封管口，置液氮冷冻器里保存。此法虽然能长期保存菌种，但是操作繁琐，设备昂贵，液氮来源困难且价格高，大部分研究机构没有条件使用。(杨新美著，《食用菌研究方法》，中国农业出版社，1999；黄年来主编，《中国食用菌百科》，中国农业出报社，1993年5月)。
目前，我国国家级的大型真菌菌种保藏机构主要有“中国微生物菌种保藏管理委员会微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)”、“中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)以及“农业微生物菌种保藏管理中心食用菌菌种分中心”3个，省级有十多个，还有一些地方菌种保存机构，这些中心或机构每年用于保藏大型真菌的菌种耗资巨大，如能提供一种简单经济的大型真菌菌种保藏方法，那意义非常重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有大型真菌菌种的长期保藏方法上存在的不足，提供一种简单、经济的大型真菌菌种的长期保藏方法。
一种大型真菌菌种的长期保藏方法，包括如下步骤(1)将需要保藏的菌种先接种到固体培养基上培养，等菌丝体将要长满平板时将固体培养基切割成若干菌种块；(2)先在容器中加入液体培养基与抗冻剂，再放进菌种块，盖紧瓶盖，于-70℃下保存。
上述容器优选冻存管，上述抗冻剂优选甘油，甘油浓度优选15％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明的大型真菌菌种的保藏方法可长期保藏，简便且经济，菌种不易产生变异。
图1为金针菇Fve1菌种在-70℃下保存2年后接种到斜面上的菌丝生长情况；图2为金针菇Fve4菌种在-70℃下保存2年后接种到斜面上的菌丝生长情况；
图3为金针菇Fve1菌种在-70℃下保存2年后接种到液体培养基中的出菇情况图4为金针菇Fve5菌种在-70℃下保存2年后接种到液体培养基中的出菇情况；图5为金针菇Fve5菌种在-70℃下保存2年后接种到固体培养基中的出菇情况；图6为金针菇Fve4菌种在-70℃下保存2年后接种到固体培养基中的出菇情况；图7为金针菇Fve1菌种在-70℃下保存2年后接种到固体培养基中的出菇情况。
具体实施例方式
实施例1金针菇菌种的保存1.所用的培养基为常用的金针菇培养基，它们的配方分别为(1)PDSA固体平板培养基去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，维生素B15-10mg，琼脂20g，H2O 1L；(2)PDSB液体培养基去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，维生素B15-10mg，H2O 1L。
2.供试金针菇菌株购自贵州市习水县习酒镇食用菌研究中心，菌株编号为Fve1、Fve2、Fve3、Fve4、Fve5。
具体步骤如下(1)按常规方法配制固体平板培养基，在超净工作台中分别接种0.5cm2大小的5个金针菇斜面母种于平板中间，接种后置于21℃温度下培养；(2)一周后菌丝刚刚长满培养皿时，在超净工作台中利用解剖刀轻轻分割平板，使成为0.5cm2的方形菌种块；或利用自行设计的空心不锈钢柱切割成为直径0.5cm的圆盘菌种块。
(3)取5支1.8mL的无菌冻存管，在超净工作台中加入0.5-1.0mL的液体培养基(PDSB)，之后加入甘油使其终浓度为15％，分别放进3-8块Fve1、Fve2、Fve3、Fve4和Fve5的0.5cm2的方形菌种块或直径为0.5cm的圆盘菌种块，让液体培养基全部掩盖菌种块。盖紧瓶盖，写上标签，于-70℃超低温冰箱中保存。每个菌种保存10管。
实施例2金针菇保存菌种的检测平板斜面菌丝观察(1)按常规配制PDSA培养基，分别制作成平板和斜面。
(2)每隔半年从-70℃超低温冰箱中取出金针菇菌种分别接种于斜面上，之后置于21℃的恒温培养箱中培养。
(3)一周后观察，发现菌种的菌丝形态正常和生长状态良好(见图1，图2)。
(4)在超净工作台中，把在-70℃下保存2年的同一菌种同时接到平板两侧，菌落的菌丝接触时没有产生拮抗线，说明菌种没有变异。
液体培养基出菇试验
(1)按常规配制PDSB液体培养基，分装于250mL的三角瓶中，每个三角瓶装50mL。
(2)在超净工作台中，将实施例1所保存的金针菇接种于三角瓶中，之后置于21℃的恒温培养箱中培养。
(3)3周后，-70℃保存的菌种均能长出正常的子实体(见图3，图4)。
固体培养基出菇试验固体培养基配方棉籽壳85％，麦麸10％，糖1％，玉米粉3％，碳酸钙1％。
(1)按固体培养基配方准确称取各成分，以1∶1.5的料水比，混匀培养基。
(2)取17×30cm的聚丙烯塑料袋，小心装进培养基至1/2袋，培养基松紧合适，套上套环，塞好棉塞。
(3)把装好的培养基袋置于121℃，1.5kg/cm2的压力下灭菌1.5小时。
(4)待培养基冷却后，在超净工作台中取以上活化的金针菇斜面菌种接一块0.5cm2的菌种块于培养袋中，之后置于21℃的恒温培养箱中培养。
(5)3周后菌丝长满菌袋，进入出菇管理阶段，金针菇的出菇管理按《中国金针菇生产》(郭美英主编，中国农业出版社，2000年)的方法和步骤进行。出菇情况见图5、图6和图7。
实施例3将本发明的保藏方法与现有斜面保藏法进行比较，具体见表1。
表1本发明方法与常规长期保存方法比较
权利要求
1.大型真菌菌种的长期保藏方法，其特征在于包括如下步骤(1)将需要保藏的菌种先接种到固体培养基上培养，等菌丝体将要长满平板时将固体培养基切割成若干菌种块；(2)先在容器中加入液体培养基与抗冻剂，再放进菌种块，盖紧瓶盖，于-70℃下保存。
2.如权利要求1所述的保藏方法，其特征在于所述容器为冻存管。
3.如权利要求1所述的保藏方法，其特征在于所述抗冻剂为甘油。
4.如权利要求1所述的保藏方法，其特征在于所述菌种为金针菇、p香菇或灵芝。
全文摘要
本发明公开了大型真菌菌种的长期保藏方法，包括如下步骤(1)将需要保藏的菌种先接种到固体培养基上培养，等菌丝体快要长满平板时将固体培养基切割成若干菌种块；(2)先在容器中加入液体培养基与抗冻剂，再放进菌种块，盖紧瓶盖，于－70℃下保存。本发明的大型真菌菌种的保藏方法可长期保藏，简便且经济，菌种不易产生变异。
文档编号C12N1/14GK1952108SQ20061012338
公开日2007年4月25日 申请日期2006年11月7日 优先权日2006年11月7日
发明者林俊芳, 郭丽琼, 王秀旭, 阮秋菊, 韩君莉 申请人:华南农业大学