专利名称：重组毕赤酵母及其表达ngal蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及NGAL蛋白，特别是涉及重组毕赤酵母及其表达NGAL蛋白的方法。
背景技术：
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL)由Kjeldsen等人于1993年在中性粒细胞内发现的，是一种25kD的糖蛋白。它具有lipocalin家族的典型β-折叠桶结构，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程密切相关。NGAL可参与细胞分化且作为一种存活因子抑制细胞凋亡；在人类肿瘤中如肺腺癌、食管癌、胰腺癌、结肠癌和乳腺癌中可见NGAL高表达，并且NGAL蛋白可通过保护MMP-9的活性而促进肿瘤细胞的侵袭。近年来又研究证明，NGAL作为小分子铁配合物结合蛋白直接参与了机体铁代谢和天然免疫反应等功能(Goetz DH，2002；Yang J，2002)，与肾缺血，肾毒性损伤以及动脉粥样硬化(Forsblad J，2002；Hemdahl AL，2006)等疾病的发生发展密切相关，且作为一种早期标志物帮助判定缺血性肾损伤程度(Mishra J，2003；Mishra J，2005)。因此，制备重组NGAL蛋白对深入研究NGAL的功能及其临床诊断的应用具有重要的意义。
NGAL基因是单拷贝基因，定位于染色体9q34。NGAL基因的全长5869bp，其中包括1695bp的5′端非转录区，178bp的3′端非转录区及由七个外显子和六个内含子构成的3696bp的原初转录区。其cDNA全序列由63bp的5′端非翻译区和591bp的编码区组成，编码含197个氨基酸残基的肽链，此肽链包括178个氨基酸残基的成熟肽段和19个氨基酸的信号肽序列。目前，重组NGAL蛋白主要是通过大肠杆菌融合表达并进行亲和层析纯化而获得(Bundgaard，1994)。该表达系统存在的主要问题是没有翻译后的修饰功能，而人NGAL是糖基化25kD蛋白。因此，用原核表达系统获得的重组NGAL蛋白来研究人NGAL功能，尚存在明显缺陷。
发明内容
本发明的目的在于克服现有原核表达NGAL蛋白方法上存在的问题，提供一种能高效表达NGAL蛋白的重组毕赤酵母。
本发明的另一个目的在于提供上述重组毕赤酵母表达NGAL蛋白的方法。
1、重组毕赤酵母的构建与高效转化菌株的筛选(1)根据基因结构设计引物，扩增NGAL cDNA片段。然后，将扩增片段与pPIC9空载体连接，构建表达载体pPIC9-NGAL，转化大肠杆菌后提取质粒进行双酶切鉴定。采用双脱氧末端终止法对pPIC9-NGAL阳性重组子进行测序(上海基康公司)，并将测序结果用BLAST程序与NCBI核酸数据库进行序列比对，确认是NGAL编码区且无突变。酶切pPIC9-NGAL质粒，使之线性化后，转化毕赤酵母。
(2)铺MM与MD平板进行筛选，采用菌落PCR鉴定重组克隆。最后，将NGAL重组酵母菌株在液体培养基中培养，甲醇诱导表达，用已知浓度的原核表达NGAL蛋白为参照物，通过对发酵液进行SDS-PAGE电泳及western blotting筛选出高效表达NGAL蛋白的酵母菌株。
2、重组毕赤酵母诱导表达NGAL与纯化(1)将高效NGAL重组菌株在BMGY培养基中扩大培养，甲醇诱导，使其分泌NGAL蛋白；离心收集发酵液。
(2)往发酵液中加入硫酸铵沉淀重组NGAL蛋白；PBS透析除盐后，阳离子交换层析纯化，阳离子交换层析的固定相为SP-SepharoseFast Flow；线性梯度洗脱A液为25mM PB，pH5.8，B液为1M NaCl；流速为1.5ml/min。洗脱组分经超滤柱脱盐后，分装，储存于-80℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明通过PCR扩增、连接、转化与筛选，最终获得高效表达NGAL蛋白的重组毕赤酵母菌株。该菌株能将目标蛋白分泌到培养基中，可达＞100mg/L，而且无杂蛋白。这使得接续下来的纯化工艺变得十分简单且成本低发酵液经硫酸铵沉淀、脱盐、阳离子交换层析即可。所得蛋白优于原核表达蛋白，糖基化完整，可用于人NGAL功能研究以及临床NGAL检测的标准蛋白。
图1为pPIC9载体结构图；
图2为琼脂糖凝胶电泳鉴定NGAL基因PCR产物电泳图；图3为琼脂糖凝胶电泳鉴定重组表达载体pPIC9-NGAL的电泳图；图4为PCR鉴定重组酵母克隆的电泳图；图5为western blotting检测发酵上清中NGAL蛋白的表达电泳图；图6为western blotting评估发酵上清中NGAL蛋白表达产量的电泳图；图7为阳离子交换层析梯度洗脱记录图；图8为SDS-PAGE电泳检测阳离子交换层析后的目标蛋白电泳图。
其中，图2中，1，100bp DNA ladder；2，PCR产物。图3中，1，100bp DNA ladder；2，pPIC9-NGAL/XhoI+EcoRI；3，λDNA/EcoRI+HindIII DNAmarker。图4中，1，100bp DNA ladder；2-9，1-8号克隆。
图5中，1，2ng/μl原核表达NGAL蛋白；2-9，1-8号克隆发酵上清。
图6中，1-7，1/258、1/128、1/64、1/32、1/16和1/4稀释的样品；8-9，1ng/μl和2ng/μl原核表达的NGAL蛋白。图8中，Y，层析样品原液；26-34，洗脱峰各管。
具体实施例方式
实施例1重组毕赤酵母的构建1.扩增NGAL cDNA片段以pGEX-NGAL为模板，除去了信号肽序列的NGAL编码区用下列引物扩增P15’-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA-3’；P25’-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC-3’。PCR引物两端分别引入XhoI和EcoRI酶切位点(下划线标记)，而且产物的5′端引入了毕赤酵母内切肽酶KEX2的酶切序列Glu-Ala-Arg*。25μl的PCR反应体系成分为2×PCR mix 12.5μl，pGEX-NGAL 1μl，P1(12.5 μM)1μl，P2(12.5μM)1μl，PCR water 9.5μl。PCR反应条件是95℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃5min。反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，见图22.构建重组pPIC9-NGAL表达载体取经过XhoI和EcoRI双酶切的NGAL cDNA PCR产物和线型pPIC9空载体(见图1)的连接反应PCR产物3μl，pPIC9空载体1μl，2×ligation buffer 5μl，T4 ligase 1μl。混匀后室温下连接1h，转化大肠杆菌JM109感受态细胞和铺LB(Amp+)板。次日挑取单克隆接种于2ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养(250rpm/min)14h。碱裂解法提取质粒并进行XhoI和EcoRI双酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳鉴定重组表达载体pPIC9-NGAL，见图3。所获得的pPIC9-NGAL重组子进行测序，并进行BLAST分析，确认序列的正确性。
3.pPIC9-NGAL质粒转化毕赤酵母pPIC9-NGAL质粒分别用SacI、SalI和BglII酶进行酶切使之线性化，并用琼脂糖凝胶电泳回收，备用。然后，从YPD平板上挑毕赤酵母单克隆于10ml的YPD培养基中30℃摇床振荡培养约16h，当其OD600值＞0.6时，室温2,000g离心5min收集菌体；用4ml无菌水重悬菌体，室温1,500 g离心10min，去除无菌水，重复洗涤一次；加160μl 0.1M LiCl重悬菌体，室温下14,000rpm离心15s；去除上清，加64μl 0.1M LiCl重悬菌体，取21μl分装到1.5ml的离心管中，此为制备好的酵母感受态细胞。最后，取6μl鲑鱼精DNA(10μg/μl)沸水煮5min后，马上置于冰上，以制备担体DNA；室温下8,000rpm将上述酵母感受态细胞离心1min收集菌体；每个离心管按顺序加入以下物品50％PEG3350 96μl，1M LiCl 14.4μl，鲑鱼精DNA2μl，线性化pPIC9-NGAL0.74-0.9μg于50μl的无菌水中；剧烈涡旋和移液器打散至液体充分混匀；30℃水浴孵育30min；42℃热休克25min；8,000rpm离心1min收集菌体；400μl无菌水重悬菌体，分别取100μl或200μl铺于RDB平板；平板倒置培养于30℃恒温培养箱中，培养2-4天。PCR鉴定重组毕赤酵母，见图4。
4.筛选高效表达的重组毕赤酵母用灭菌牙签挑取RDB平板上的单克隆依次分别接种于MM(1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)和MD(1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％葡萄糖)平板上，再将牙签置于装有5ml BMGY培养液的50ml离心管中于30℃250rpm振荡培养。上述两种平板倒置培养于30℃恒温培养箱中，培养2-4天。对于BMGY培养菌液，则在24h后先取1ml菌液测其OD600，并且8,000rpm离心1min收集菌体，加500μl PBS重悬菌体，2,500g离心3min，弃上清，加100μlTE重悬菌体，沸水煮10min，马上置于-70℃冷冻30min，取出放于沸水再煮10min，1,500g离心5min，取上清为模板进行PCR反应。25μl的PCR反应体系成分为2×PCR mix12.5μl；酵母裂解上清1μl；P1(12.5μM)1μl；P2(12.5μM)1μl；无菌水9.5μl。PCR反应条件同上。反应结束后，取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。然后，剩下的菌液继续振荡培养，并每隔24h加入终浓度为1％的甲醇进行诱导，120h后，菌液2,500g离心5min，收集上清，取5μl进行western blotting检测NGAL的表达水平，鉴定出高表达菌株，见图5和图6。
实施例2重组毕赤酵母表达生产NGAL及NGAL的纯化1.从上述MD平板挑取经western blotting鉴定为高表达的重组克隆接种于BMGY培养基中30℃，250-300rpm/min培养，当OD600＞2.0时，25℃下2000g，5min离心，弃上清，加入BMMY培养基稀释至OD600为1，30℃，250-300rpm/min继续培养，每隔24h加入终浓度为1％的甲醇进行诱导，120h后，25℃，5000g，10min离心，收上清。
2.NGAL蛋白纯化将发酵上清液按5g/10ml加入硫酸铵固体，摇动使充分溶解，4℃静置过夜。然后4℃下10,000g离心10min，小心弃上清。将沉淀用25mM PB(pH＝5.8)溶解后，在25mM PB(pH＝5.8)中透析48h，其间换液三次。所得样品按如下步骤进行SP-Sepharose fast flow阳离子交换A.预处理Sepharose。取25ml SP-Sepharose fast flow倾去上层20％乙醇液，加50ml 25mMPB(pH＝5.8)，搅匀，倾去上层液。再用10ml25mMPB(pH＝5.8)洗两次。加7ml 25mMPB(pH＝5.8)，混匀。
B.装柱。关闭下端，柱内留5ml 25mMPB(pH＝5.8)，沿柱壁加入胶浆液，完毕后，用25mMPB(pH＝5.8)加满柱子，打开下端出口，以400cm/h的流速装柱。待柱高固定后，跑柱60ml.检查流出液pH值是否与加入时一样(若不同，继续跑柱至pH值一样)C.上样。打开柱盖，让柱中缓冲溶液流至接近柱床平面时(二者相差约1mm)，加入样品溶液。加压使样品液进入柱床中，此时加满缓冲溶液，盖紧柱盖，即可跑柱。
D.洗柱。25mMPB(pH＝5.8)洗柱，流速1.5ml/min，每管2min收集，至基线水平。
E.1MNaCl梯度洗脱。A液25mMPB(pH＝5.8)，B液1MNaCl。流速1.5ml/min，每管2min收集。
F.取洗脱峰样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色鉴定目标蛋白，并合并目标蛋白。阳离子交换层析洗脱记录，见图7。
G除盐。将层析得到的纯化蛋白移入Ultra-15 5K中，4℃下4000g离心20min。然后用PBS(pH 7.4)洗三次，每次10min。取出截留液，稀释至一定体积，Bradford法测蛋白含量，分装后，置于-80℃保存。SDS-PAGE电泳检测离子交换层析后的目标蛋白见图8。
权利要求
1.一种重组毕赤酵母，其特征在于由如下方法制备而成(1)PCR扩增NGAL的cDNA；(2)PCR产物与载体pPIC9连接，构建重组质粒pPIC9-NGAL；(3)重组质粒pPIC9-NGAL转化毕赤酵母，得到重组毕赤酵母。
2.如权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于所述NGAL为人源NGAL。
3.如权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于所述PCR扩增的引物为P15’-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA-3’，P25’-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC-3’；模板为pGEX-NGAL。
4.一种利用权利要求1所述的重组毕赤酵母表达生产NGAL蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤(1)筛选高效表达NGAL蛋白的重组毕赤酵母；(2)将高效表达的重组毕赤酵母用BMGY培养基培养，用甲醇诱导培养获得含有NGAL蛋白的发酵液；(3)往发酵液中加入硫酸铵，沉淀，收集沉淀物；(4)透析除盐；(5)阳离子交换层析。
5.如权利要求4所述的表达方法，其特征在于所述阳离子交换层析的固定相为SP-Sepharose Fast Flow；线性梯度洗脱A液为25mMPB，pH5.8，B液为1M NaCl；流速为1.5ml/min。
全文摘要
本发明涉及NGAL蛋白，公开了重组毕赤酵母及其表达NGAL蛋白的方法。本发明通过PCR扩增、连接、转化与筛选，最终获得高效表达NGAL蛋白的重组毕赤酵母菌株。该菌株能将目标蛋白分泌到培养基中，可达＞100mg/L，而且无杂蛋白。这使得接续下来的纯化工艺变得十分简单发酵液经硫酸铵沉淀、脱盐、阳离子交换层析即可。所得蛋白优于原核表达蛋白，糖基化完整，可用于人NGAL功能研究以及临床NGAL检测的标准蛋白。
文档编号C12N15/12GK1978632SQ20061012367
公开日2007年6月13日 申请日期2006年11月21日 优先权日2006年11月21日
发明者李恩民, 张丕显, 吴炳礼, 杜则澎, 许丽艳 申请人:汕头大学医学院