专利名称：氧化微杆菌以及利用该氧化微杆菌制备光学纯手性芳基仲醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种微杆菌及其用途，更具体地说是涉及一种氧化微杆菌以及利用该氧化微杆菌制备光学纯手性芳基仲醇的方法。
背景技术：
光学活性手性芳基仲醇是手性药物、农用化学品、外激素、调料、香料、液晶及手性辅料合成的重要中间体，目前通常采用制备方法包括两大类方法即潜手性酮的不对称还原以及消旋体醇的动力学拆分。例如，利用酯酶或脂肪酶催化的外消旋仲醇的对映选择性酯化或转酯化拆分以及外消旋酯的对映选择性水解拆分是制备光学活性手性芳基仲醇方法之一，这种方法的主要优点在于商品脂肪酶的种类较多，针对特定的底物能比较容易地选出具有高活力和高对映选择性的酶。但该方法目标对映体产物的最高收率不超过50％，另外对于脂肪酶催化的外消旋酯的水解拆分，必须事先合成外消旋的底物酯，对于工业化生产而言，不仅增加了操作步骤，而且增加了额外的成本。潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的另一种重要方法，该方法理论上能将底物酮100％地转化为单一对映体的手性醇，具有较高的工业应用价值。化学法对潜手性酮的不对称还原通常使用手性氨基醇或过渡金属配合物等作为催化剂实现酮的还原。化学法催化的酮不对称还原虽然具有较高的产率，但反应的立体选择性往往不够理想，产品的光学纯度常常不能达到制药行业的要求，而且手性催化剂的制备和回收比较困难，价格比较昂贵。生物法催化的潜手性酮不对称还原具有立体专一性高的优势，还原产物仲醇的光学纯度通常很高，是当前的一个研究热点。生物法催化酮不对称还原所使用的生物催化剂一般包括脱氢酶制剂和微生物活性整细胞，目前最主要的缺点是反应体系中需要再生还原型辅酶NADH或NADPH，这些辅酶非常昂贵，因此难以用于大规模产品生产。高效低成本的解决辅酶再生问题是这类方法产业化成功的关键。利用生物催化方法选择性地将外消旋芳基仲醇的一个对映体氧化为芳基酮，同样可以得到光学活性的另一种对映体芳基仲醇。这其中涉及到的辅酶主要为NAD+或NADP+，其价格要远低于辅酶NADH或NADPH。因此利用此方法有望以较低的辅酶再生成本得到高光学纯度的芳基仲醇。生物脱氢反应生成的芳基酮可作为对映选择性互补的生物还原反应的底物，通过生物氧化与生物还原反应的串联，即可以100％的理论产率得到光学纯的芳基醇。例如，TetrahedronAsymmetry 2006，171769-1774，杨巍等曾报道红酵母Rhodotorula sp.AS2.2241，可将苯乙酮不对称还原为(S)-1-苯乙醇。将氧化微杆菌与红酵母催化的反应组合即可实现消旋1-苯乙醇的去消旋化为(S)-1-苯乙醇。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新筛选的氧化微杆菌，该菌株是从土壤中分离并经过多轮筛选后获得的，于2006年11月29日在中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC1875，并利用该氧化微杆菌的催化作用选择性氧化反应制备光学纯手性芳基仲醇，以较低的成本制备出高光学纯度(＞99％)的手性芳基仲醇。
本发明采用的技术方案氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCC NO.1875。
采用上述氧化微杆菌作为催化剂制备光学纯手性芳基仲醇的方法，包括下列步骤a.培养氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCCNO.1875，然后取上述氧化微杆菌细胞置于缓冲溶液中；b.向上述缓冲溶液中加入消旋体芳基仲醇，经催化对映选择性氧化产生相应的酮和(S)-仲醇，其中所述消旋体芳基仲醇的结构通式为R1CH(OH)R2，取代基R1选自-C6H5或-C6H4X，取代基R2为-CH3，取代基X选自-CH3、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NH2或-NO2其中之一；c.反应液经分离、纯化得到目标产物光学纯(S)-芳基仲醇。
制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于反应体系中所述氧化微杆菌细胞浓度为5～100g(湿重)/L。
制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于反应体系中所述所述消旋体芳基仲醇的浓度为10～200mM。
制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于步骤b的反应温度控制为20～50℃，反应时间为3～96小时。
制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于所述缓冲溶液为pH值为6～8的磷酸钾缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液。
制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于反应体系中可加入质量为反应体系质量0.2％～10％的有机助溶剂，所述有机助溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的一种或一种以上的混合物。
制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于步骤b中所述消旋体芳基仲醇为1-苯基乙醇。
制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于在步骤b反应结束后可向反应体系中加入红酵母(Rhodotorula sp.)ECU316-1 CGMCC NO.1735。
本发明的有益效果，本发明采用新的氧化微杆菌作为催化剂对消旋体芳基仲醇进行对映选择性氧化反应制备出高光学纯度(＞99％)的手性芳基仲醇，催化剂易于制备、反应条件温和，具有一定的工业应用开发前景。在实施例中(S)-1-苯乙醇的产率可达90％，对映体过量值大于99％。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述本发明的氧化微杆菌细胞(Microbacterium oxydans)ECU2010是一种属于细菌类杆菌属的菌株，该菌株是从土壤中分离，并经过多轮筛选后获得的，于2006年11月29日在中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC1875。本发明的菌种具有如下的微生物学特征1.形态特征该菌株为黄色菌落，表面光滑半透明，边缘整齐，对光看有光泽。
2.生理生化特征(1)革兰氏阳性杆状菌；好氧菌；(2)接触酶实验阳性；(3)氧化酶实验阴性；(4)淀粉水解试验阴性；(5)明胶液化试验阴性；(6)硝酸盐还原试验阴性(7)糖醇类发酵试验阳性甘露糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、淀粉和肌醇阴性D-葡萄糖、D-甘露醇、乳糖、阿拉伯糖、山梨醇、鼠李糖(8)赖氨酸脱羧酶试验阴性；(9)脲酶试验阴性；(10)生长最适宜温度25～35℃；根据以上生理生化试验和《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册》，该菌为氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)，根据16SrDNA分子生物学鉴定，该细菌与氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)的同源性为99％。
采用上述氧化微杆菌作为催化剂制备光学纯手性芳基仲醇的方法，包括下列步骤a.培养氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCC NO.1875，然后取上述氧化微杆菌细胞置于缓冲溶液中；b.向上述缓冲溶液中加入消旋体芳基仲醇，经催化对映选择性氧化产生相应的酮和(S)-仲醇，其中所述消旋体芳基仲醇的结构通式为R1CH(OH)R2，取代基R1选自-C6H5或-C6H4X，取代基R2为-CH3，取代基X选自-CH3、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NH2或-NO2其中之一；c.反应液经分离、纯化得到目标产物光学纯(S)-芳基仲醇。反应体系中所述氧化微杆菌细胞浓度为5～100g(湿重)/L。反应体系中所述所述消旋体芳基仲醇的浓度为10～200mM。步骤b的反应温度控制为20～50℃，反应时间为3～96小时。所述缓冲溶液为pH值为6～8的磷酸钾缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液。反应体系中可加入质量为反应体系质量0.2％～10％的有机助溶剂，所述有机助溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的一种或一种以上的混合物，优选二甲基亚砜。步骤b中所述消旋体芳基仲醇优选1-苯基乙醇。
在步骤b反应结束后可向反应体系中加入红酵母(Rhodotorula sp.)ECU316-1 CGMCC NO.1735，红酵母细胞与氧化微杆菌细胞的质量比(湿重/湿重)最好为2∶1～100∶1。红酵母细胞可以催化第一步反应产生酮将其选择性还原为(S)-仲醇，经过上述两步选择性互补的氧化还原反应，可提高将消旋体仲醇去消旋化转化为(S)-仲醇的产率。
实施例1培养基配方为葡萄糖15.0g/L，酵母膏5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KH2PO41.0g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO40.5g/L，pH7.0。取4℃保存的氧化微杆菌斜面菌种，挑取一环接种至装有50ml培养基的250ml摇瓶中，在30℃下，160rpm振摇培养48h，离心收获细胞。发酵液酶活力约为20～40U/L，细胞浓度约10～20g(湿重)/L，单位细胞的酶活力为2U/g湿细胞。细胞活力单位的定义为在30℃，pH7.0的条件下，每分钟催化1-苯乙醇氧化生成1.0μmol苯乙酮所需的细胞量。
实施例2取湿重1.0g的上述氧化微杆菌细胞，悬浮于9.5ml磷酸钠盐缓冲溶液中(0.1M，pH7.5)，加入24mg 1-苯乙醇和0.5ml二甲基亚砜，反应混合物在30℃、160r/min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样以乙酸乙酯萃取，用手性气相色谱(色谱柱为β-DEX120毛细管手性气相色谱柱)分析剩余底物的对映体过量值和产率，反应24小时后，剩余(S)-1-苯乙醇的产率为47％，对映体过量值(e.e.)为98％。
实施例3取湿重1.0g的上述氧化微杆菌细胞，悬浮于9.5ml磷酸钠盐缓冲溶液中(0.1M，pH7.5)，加入31mg 1-(4-甲基苯基)乙醇和0.5ml二甲基亚砜，反应混合物在30℃、160r/min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样以乙酸乙酯萃取，用手性气相色谱(色谱柱为β-DEX120毛细管手性气相色谱柱)分析剩余底物的对映体过量值和产率，反应72小时后，剩余(S)-1-(4-甲基苯基)乙醇的产率为46％，对映体过量值(e.e.)为97％。
实施例4取湿重1.0g的上述氧化微杆菌细胞，悬浮于9.5ml磷酸钠盐缓冲溶液中(0.1M，pH7.5)，加入31mg 1-(2-氯苯基)乙醇和0.5ml二甲基亚砜，反应混合物在30℃、160r/min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样以乙酸乙酯萃取，用手性气相色谱(色谱柱为β-DEX120毛细管手性气相色谱柱)分析剩余底物的对映体过量值和产率，反应60小时后，剩余(S)-1-(2-氯苯基)乙醇的产率为48％，对映体过量值(e.e.)为96％。
实施例5取湿重1.0g的上述氧化微杆菌细胞，悬浮于9.5ml磷酸钠盐缓冲溶液中(0.1M，pH7.5)，加入28mg 1-(2-氟苯基)乙醇和0.5ml二甲基亚砜，反应混合物在30℃、160r/min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样以乙酸乙酯萃取，用手性气相色谱(色谱柱为β-DEX120毛细管手性气相色谱柱)分析剩余底物的对映体过量值和产率，反应48小时后，剩余(S)-1-(2-氟苯基)乙醇的产率为45％，对映体过量值(e.e.)为98％。
实施例6按实施例1所述的培养基配方，取4℃保存的保藏号为CGMCC1875氧化微杆菌斜面菌种和保藏号为CGMCC1735的红酵母(Rhodotorula sp.ECU316-1)斜面菌种，挑取一环分别接种至装有100ml培养基的500ml摇瓶中，在30℃、160r/min振摇培养48h，离心收获细胞置于4℃冰箱保存。取湿重1.0g的氧化微杆菌细胞，悬浮于9.5ml磷酸钠盐缓冲溶液中(0.1M，pH7.5)，加入24mg 1-苯乙醇和0.5ml二甲基亚砜，反应混合物在30℃、160r/min的恒温摇床上振摇反应12小时后，加入4.0g湿重的红酵母细胞继续反应18小时，得到(S)-1-苯乙醇的产率为90％，对映体过量值大于99％。
以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCC NO.1875。
2.以权利要求1所述氧化微杆菌作为催化剂制备光学纯手性芳基仲醇的方法，包括下列步骤a.培养氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCCNO.1875，然后取上述氧化微杆菌细胞置于缓冲溶液中；b.向上述缓冲溶液中加入消旋体芳基仲醇，经催化对映选择性氧化产生相应的酮和(S)-仲醇，其中所述消旋体芳基仲醇的结构通式为R1CH(OH)R2，取代基R1选自-C6H5或-C6H4X，取代基R2为-CH3，取代基X选自-CH3、-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-NH2或-NO2其中之一；c.反应液经分离、纯化得到目标产物光学纯(S)-芳基仲醇。
3.根据权利要求2所述制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于反应体系中所述氧化微杆菌细胞浓度为5～100g(湿重)/L。
4.根据权利要求2所述制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于反应体系中所述所述消旋体芳基仲醇的浓度为10～200mM。
5.根据权利要求2所述制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于步骤b的反应温度控制为20～50℃，反应时间为3～96小时。
6.根据权利要求2所述制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于所述缓冲溶液为pH值为6～8的磷酸钾缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液。
7.根据权利要求2所述制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于反应体系中可加入质量为反应体系质量0.2％～10％的有机助溶剂，所述有机助溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的一种或一种以上的混合物。
8.根据权利要求2所述制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于步骤b中所述消旋体芳基仲醇为1-苯基乙醇。
9.根据权利要求2～8任何一项所述制备光学纯手性芳基仲醇的方法，其特征在于在步骤b反应结束后可向反应体系中加入红酵母(Rhodotorulasp.)ECU316-1CGMCC NO.1735。
全文摘要
本发明公开了一种氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)ECU2010，CGMCC NO.1875，以及利用该氧化微杆菌作为催化剂制备光学纯手性芳基仲醇的方法。所述方法将氧化微杆菌细胞置于缓冲溶液中向其中加入消旋体芳基仲醇，经催化对映选择性氧化产生相应的酮和(S)－仲醇，反应液经分离、纯化得到目标产物光学纯(S)－芳基仲醇。本发明的催化剂易于制备、反应条件温和，在实施例中(S)－1－苯乙醇的产率高达90％，对映体过量值大于99％，具有相当的工业应用开发前景。
文档编号C12P1/02GK101016526SQ20061014796
公开日2007年8月15日 申请日期2006年12月26日 优先权日2006年12月26日
发明者徐毅, 张伶娜, 许建和, 陈晓夏, 欧玲 申请人:华东理工大学