专利名称：受化学物质烯丙异噻唑诱导的W－box元件及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种受化学物质烯丙异噻唑或其活性代谢物诱导的顺式元件及其应用。该顺式元件来源于大麦中抗病相关基因上游的启动子序列。将编码所希望的目的产物基因的核苷酸序列和单元件或其顺式串连重复后得到的启动子融合得到重组DNA，用这种重组DNA转化植物，将得到新的转基因植物。在新的植物中该重组DNA中的目的基因的表达受烯丙异噻唑probenazole(3-allyloxy-1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide，PBZ)或其活性代谢物1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide(BIT)的化学诱导物调控。
背景技术：
在过去十多年中，人们已经获得了上百个在作物遗传改良中有重要应用价值的功能基因。随着功能基因组研究的进展，人们还会批量地克隆出有广泛应用价值的功能基因。这些多样性的基因资源将会被用来大规模地改良作物和其它重要植物，以便满足人口增长导致对粮食日益增长的需求，缓解环境治理和保护的巨大压力，以及为城镇居民提供丰富的生活必需品和高质量的生活环境。这些多样性的功能基因资源需要在不同类型启动子的调控下才能恰到好处地发挥作用。
一般来说，启动子是位于基因编码区上游的一段DNA，包含转录起始区。启动子区域同时包含多种调控基因表达的元件，如大约位于转录起始位点上游30bp(-30)位置的TATA box，以及位于上游75bp位置的CAAT box。植物启动子中还包含可以感应其他外界因素的调控元件，诸如光、化学物质、营养条件、热、缺氧、重金属等环境因子，进而对相关基因进行表达调控。启动子内的另外一些DNA序列与发育的时序或基因表达的组织特异性有关。真核体系中还存在增强子序列，可以大大提高附近基因的表达水平；这些增强效应与其所处的位置和方向没有多大关系。
近年来，植物基因工程技术在作物品种的遗传改良方面，特别是在抗病虫特性和抗除草剂特性，以及谷物籽粒品质改良上取得了令人瞩目的成就和进展，而且在许多其它方面也愈来愈显示出了其巨大的应用潜力，如植物生物反应器的构建等。然而，在取得这些突破性进展的同时，关于转基因植物的生态安全和食品安全问题也引起了公众越来越多的关注、争论甚至抗议。这中间除了非理性和非科学因素外，现行的选择性基因和目标功能基因的表达体系也的确存在其内在的局限性。自然状态下，生物体内基因的表达都受到严格的调控。调控因子可能是发育进程相关的，表现为基因的程序化表达，包括时空表达；也可能是环境因子诱导的，表现为基因的应急式表达。然而，目前植物基因工程中所用的启动子多为组成型的，这些组成型的启动子驱使选择性标记基因和目标功能基因持续高效表达，为转基因技术和转基因植物的安全性问题埋下了隐患。事实上，选择性标记基因只需要在筛选转化体时表达；抗病虫、抗除草剂及生物反应器中的目标功能基因也只是在生长发育特定的阶段需要表达，许多时候甚至仅仅是短暂的表达。对植物而言，外源基因的无效持续表达不仅是物质和能量不必要的消耗，而且还干扰植物细胞的正常生理活动，影响收获器官的产量和品质，甚至还会引起性状丧失等后果。最近在Bt(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白转基因棉花上已发现，体内毒性蛋白基因长时间的表达，易导致棉铃虫对毒性蛋白产生抗性(Mcaughey et al.，Nature biotechnol16144-146.1998)。以植物作为生物反应器也存在类似的问题。对于生态环境而言，持续表达的外源基因可能会通过花粉或其它途径在近缘物种间转移，导致有潜在危害的部分选择性基因或功能基因及其控制的性状逃逸，进而对整个食物链和生物多样性造成难以预料的后果。
为了克服组成型启动子在植物基因工程中的这些缺点，人们已经考虑开发利用诱导型启动子，组织特异性/发育阶段特异性启动子。诱导型启动子应用于植物基因工程有许多突出的优势，主要体现在1、目标功能基因可以根据需要诱导表达；2、基因的表达水平可以通过调节诱导剂/因子的强度而得到调节；3、通过使用不同的诱导剂/因子组合可以调节相关功能基因的协同表达。
在植物上，创伤诱导表达系统是较早被研究的、试图用于抗病虫基因工程的一种诱导型表达系统(Lorberth et al.，Plant J.2477-86.1992)。但是由于这类启动子是借助于病虫侵害引起的创伤来诱导目标功能基因表达，所诱导的抗病虫基因表达的速度和强度不足以产生及时有效的抗性，因而不能产生理想的抗性效果。此外，其它机械损伤，如暴风雨等，也能引起抗病虫基因不必要的表达。
其次，缺氧诱导的玉米乙醇脱氢酶Adh I基因的启动子可能是研究得最为详尽的诱导型启动子之一。
通过电穿孔的方法，将缺氧诱导的玉米乙醇脱氢酶Adh I基因转化源于悬浮培养的玉米原生质体。转化后的原生质体置于低氧含量处，并于20小时后分析Adh I的表达。为便于测量缺氧诱导的Adh I表达，将天然Adh I基因5’调控片段(1096 bp)与CAT相连。他们的结果显示，在源于同源的培养细胞的原生质体中，标准的缺氧条件可以调控单子叶植物玉米的Adh I启动子/CAT基因。同时，他们又发现，在玉米原生质体中，Adh I的启动子片段本身就足以响应缺氧条件的诱导，进而调控外源基因的表达，无需编码区和3’区的存在(Howard，et al.，Planta，170535-450.1987)。
其他研究者进一步确定了玉米Adh I基因与缺氧诱导相关的DNA片段。这些研究者在玉米原生质体中转入包含CAT编码序列和Adh I启动子的重组基因，24小时后检测CAT活性。通过改变启动子片段的长度，Lee等人确定从转录起始位点上游146 bp的启动子顺序足以在缺氧状态下启动CAT的表达。然而启动子序列向5’端继续延伸到266或955 bp后，CAT表达量上升了5或8倍(Lee et al.，Plant Physiology 85327-330，1987)。
Walker等人继续用瞬间表达方法研究玉米Adh I基因上游受缺氧诱导启动基因表达的序列。他们确定了启动子中与缺氧诱导的基因表达相关的2段序列-133--124和-113--99(转录起始位点上游)。这2段序列对于诱导是必须的。在无亲缘关系的病毒启动子前添加这段40bp的元件后可以获得缺氧诱导性能(Walker et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 846624-6628，1987)。
另外有人发现在稳定转化的烟草细胞内，如果用玉米Adh I基因-1094-+106这一段调控CAT基因，在合适的缺氧条件下，有非常低的CAT基因表达。事实上，只检测到CAT的mRNA。然而，将octopine合成酶基因或花椰菜镶嵌病毒(CaMV)的启动子元件接在Adh I启动子的5’端，可刺激CAT的表达，并在缺氧诱导后检测到CAT。包含与Adh l基因转录起始位点5’相邻序列247 bp的片段，足以将CAT基因的表达置于缺氧调控之下。因此，即使在有组成型的octopine合成酶或CaMV 35S启动子片段存在的条件下，这段247bp的顺序的存在仍使基因的表达受缺氧调控(Eliset al.，EMBO Journal 611-16，1987)。Howard、Lee以及Walker等人通过瞬间表达分析获得的受缺氧诱导调控的Adh I启动子区域与Ellis等人通过稳定转化植物所获得的一致或类似。
由于Adh I基因的启动子诱导响应因子为缺氧状态，因而在转基因作物上的应用没有现实的可操作性。
在众多诱导型启动子中，化学诱导型启动子在调控外源基因的表达上有许多突出的优点，其中最主要的优点是可控性强。高效、专一的化学诱导启动子理论上可以用于各种类型功能基因的安全表达，最理想的可能是用于抗病虫的植物基因工程和生物反应器植物的构建。
在细菌和动物系统中已有不少能调控外源基因表达的诱导物/启动子组合。许多细菌内的诱导体系是基于能够响应代谢物或其类似物的启动子。用包含相关启动子的目标基因转化细菌后，在其培养基中加入合适的诱导物，便可以引起目标产物的表达。成熟的诱导物/启动子组合包括3-β-吲哚乙酸/色氨酸启动子，IPTG/lac启动子，磷酸盐/磷酸盐饥饿诱导启动子，以及L-阿拉伯糖/ara B启动子等。类似地，重金属/metallothionine启动子，热/热休克等启动子已应用于动物细胞的培养系统中，调控外源基因的表达。
在植物上，除草剂安全剂诱导启动子是一类研究得比较深入的实用型化学诱导启动子，但由于其诱导特异性等方面尚存在一些问题，目前尚未得到广泛的应用(Hershey et al.，Plant Mol Biol.17679-690，1991)。美国曾批准一个除草剂安全剂诱导的启动子的专利(美国专利号5364780)，研究者以第一个“适用于大田生产的化学物质诱导而在转基因植物中调控目标基因表达的启动子”得到了专利(1991年)。在进一步的应用中，他们将In2-2启动子与报告基因GUS相连，转化拟南芥植物，通过组织化学的方法分析发现，对于不同类型的除草剂安全剂，GUS分别表达于根、苗等不同组织中(De Veylder L et al.，Plant CellPhysiology，38(5)568-577，1997)。
其它报道的化学诱导型启动子有水杨酸、葡聚糖受体、Cu2+、醇类、四环素、雌性激素、生长素，细胞激动素，赤霉酸，乙烯和脱落酸等诱导启动子(Davies，P.(Ed.)PlantHormones and Their roles in Plant Growth and Development，Martinus Ni jhoff Publ.1987；Ebel et al.，1984)。这些启动子主要用于理论研究，不具备实际应用价值。
本发明所使用的化学诱导物质--PBZ，是生产上使用多年的植物系统获得性抗性的诱导剂，具有许多优越性。首先，该药剂对植物的正常生长发育无明显不利影响，对病原菌也没有直接毒性，不易引起抗药性，其诱导抗病机理主要是通过在转录水平上调控体内一系列相关基因的表达而实现的(Sakamoto et al.，Plant Mol Biol.40847-855，1999；Yoshioka et al.，Plant J.25(2)149-157，2001；丁德荣，复旦大学博士后出站报告，2001)。其次，它是一种防治稻瘟病的高效抗病性诱导剂，可以减轻由稻瘟病造成产量损失的80-90％，且效果稳定，已经成为东南亚稻区防治稻瘟病使用面积最大的抗病诱导剂(Zeigler，Leogler and Teng(Ed.)Strategies for the discovery of rice blast fungicides.inRice Blast Disease，CAB International Press.1994)。最后，烯丙异噻唑在植物体内具有内吸输导性，克服了水杨酸等诱导剂在植物体内不能输导、易引起植物毒害的缺点(Kessmann，et al.，Annu Rev Phytopathol.32439-459，1994)。
综上所述，烯丙异噻唑在农业生产上的应用具有很大的可操作性，因而最有可能被应用于调控大田转基因植物中目的基因的表达。据报道，烯丙异噻唑可以诱导水稻中一些抗病相关基因的增强表达，如RPR1基因。该基因的编码产物含有亮氨酸富集重复区(LRR)和核甘酸结合位点(NBS)，这些是许多已知抗病基因所共有的特征。RPR1基因的表达还可以被常用的植物系统获得性抗病性(SAR)诱导剂BTH和SA，以及病原菌的诱导(Sakamoto et al.，Plant Mol Biol.40847-855，1999)。在拟南芥上的研究发现，PBZ或其活性代谢产物BIT也能诱导系统获得性抗性(SAR)。与常用的化学诱导剂BTH和INA不同，PBZ是通过激活SA上游成分来激活SA/NPR1介导的防御信号途径，进而诱导SAR，而前者似乎是作为SA的类似物而发挥作用的(Yoshioka et al.，Plant J.25(2)149-157，2001)。
WRKY是近年来发现的植物特有的一类转录因子家族，因含有由WRKYGQK 7个氨基酸组成的保守序列而得名，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中共发现了74个成员。WRKY蛋白能与TTGAC序列(又称W-box)专一结合调节基因转录，其表达主要受病原菌、损伤和信号分子SA的诱导。除主要与植物的抗逆反应和衰老有关外，WRKY也参与植物其他发育和代谢的调控。在植物的抗逆反应过程中，WRKY的表达通常发生在诱导的早期，且不需要蛋白质的重新合成。研究发现与WRKY专一结合的序列更多的存在于与抗病、损伤、衰老相关基因和水杨酸诱导基因的上游调控区域。此外，在果实成熟，种子表皮毛发育、蔗糖信号转导及赤霉素信号转导等过程中均发现了WRKY基因的表达。
本发明集中在来源于植物中受PBZ诱导的DNA启动子片段。这些启动子片段被用于建立一套PBZ/PBZ诱导基因的系统，并在转基因植物中调控外源基因的表达。这一体系可用于在大田中生长的转基因植物中外源性调控目的基因的表达。它的优势包括这些启动子片段在用PBZ处理后表现出的高活性，在所有实验的植物组织中都有明显的表达，以及没有用化学物质处理后产生的多效性等。
适用于大田生产的化学物质诱导而在转基因植物中调控目的基因表达的启动子，其表达的特异性必须便于对植物的外源性调节，所用的化学物质应当能有多种使用的方法，且能诱导特异目的基因的表达。而PBZ在大田中的应用已很普遍。有关PBZ诱导的启动子应用于转基因植物方面的工作还未见报道。PBZ诱导启动子的应用，将使人们能有效调控具有农业价值的基因在转基因植物中适时表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种受化学物质烯丙异噻唑或其活性代谢物诱导的顺式元件及其应用，从而实现应用化学物质控制转基因植物或植物组织中基因的选择性表达。
本发明提出的顺式元件，是一个源于大麦且对PBZ的诱导作出应答的一个顺式作用元件，记为W-box，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1。这一顺式元件已构建到含有非植物来源基因的重组载体中，转化植物后发现结构基因的表达水平受化学物质的调控。
特别地，本发明提出一核酸启动子，该核酸启动子片段受化合物烯丙异噻唑probenazole(3-allyloxy-1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide，PBZ)或其活性代谢物1，2-benzisothiazole-1，1-dioxide(BIT)等诱导。因此在用化合物诱导后，带有所述元件的转基因植物会引起连接在所述启动子3’末端的一个编码特定基因产物的DNA顺序表达升高。
本发明的另一方面是提供一重组DNA载体。该载体含有上述顺式元件W-box或其顺式串连(即多个W-box顺式串联)构成的启动子。该载体转化后的植物中，包含本发明中的上述启动子、与该启动子相连的编码特定基因的DNA顺序及合适的3’下游序列，使转化该重组载体后的植物在化合物烯丙异噻唑(PBZ)或其活性代谢物BIT的作用下，特定基因产物水平上升。实施例中选择的特定基因为编码GUS的基因。
本发明还包括用本发明的重组DNA结构转化植物，这种转基因植物用化合物烯丙异噻唑(PBZ)或其活性代谢物BIT处理引起编码选择的基因产物的DNA顺序表达增高，该DNA顺序经操作连接在所述启动子片段的3’端。这样的转基因植物的种子同样认定为该发明的体现。
本发明最后还包括在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，它有几个步骤组成a)用上述描述的重组DNA结构转化植物；b)用化合物PBZ处理转基因植物；c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。
具体实施例方式
实施例1W-box顺式元件片段的获得根据现有研究中对PBZ诱导基因的搜索、总结和生物信息学分析，PBZ诱导植物的SAR可能涉及到植物体内多种信号转导途径，其中在植物抗逆抗病中均有重要作用的WRKY基因可能在PBZ诱导信号通路中具有重要作用；另外核苷酸序列分析也表明多个W-box(28bp，SEQ ID No.1)，存在于可受PBZ诱导的水稻抗病相关基因上游的启动子中。因此根据研究较多的大麦抗病相关基因5’上游启动子的序列(SEQ ID No.6)设计了人工合成核苷酸片断5’CTAGACACACTTAATTTGACCGAGTAACATTCGCCACTAGTAAGCTTCTGCA3’(SEQ ID No.2)5’GAAGCTTACTAGTGGCGAATGTTACTCGGTCAAATTAAGTGTGT 3’(SEQID No.3)将人工合成的正义和反义核苷酸序列分别溶解，混匀后在PCR仪上退火，反应条件为94℃变性5min，再按94℃60s，55℃30s，最后4℃保温10min，形成双链产物。电泳检测并回收双链产物。
将上述双链产物作为插入片段与T-载体连接得到质粒，并转化大肠杆菌DH5α，在涂有IPTG和X-gal的含有氨苄抗生素的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选，获得含有W-box的重组子。以该质粒为模板，以相应的做PCR，验证是否有正确片段插入。将确实含有正确插入片段的克隆进行测序，进一步确认W-box序列的正确性。
实施例2带启动子片段的植物转基因载体的构建将经测序验证的质粒用XbaI和SpeI双酶切，电泳，回收得到W-box顺式元件序列。将该序列以1X、2X和4X的三种组合方式，克隆到pCAMBIA 1301双元转化载体上的基本启动子(mini promoter)的上游，驱动GUS基因的表达，相应获得三种载体pCW-box1、pCW-box2(SEQ ID No.4)、pCW-box3(SEQ ID No.5)。经PCR验证后用电击法分别转化农杆菌菌株LBA4404。在含利福平、链霉素和卡那三种抗生素的LB固体培养基上筛选，挑单菌落，小管摇菌。以菌液为模板，以各片段相应的引物对为引物做菌落PCR，验证各质粒是否已转入农杆菌，阴性对照各反应不加模板。
实施例3转基因植物受PBZ诱导驱动报告基因表达的研究将带有pCW-box1、pCW-box2、pCW-box3的农杆菌转化拟南芥。28℃，120rpm培养农杆菌菌株到OD600＝1.2；5000rpm(所用离心机为Hitachi CR22E，转头为R22A2，24号)，4℃，10min离心，多次离心收集菌体；5％蔗糖溶液悬浮菌体至OD600＝0.8，菌体均匀悬浮成混浊液后加入Silwet L-77(0.03％)；将植株倒浸在菌液中3s；隐蔽保湿24小时，转到正常条件下培养。
经转化的T0代拟南芥所结种子(T1代)在4℃冰箱黑暗条件下春化一个星期后，开始筛选。种子分装于1.5ml的Ep管，每管约100ul体积，加升汞(0.1％HgCl2)1ml灭菌6分钟，用无菌水清洗5次，最后用无菌水重悬后，转移到潮霉素30mg/L的MS培养基上，使种子在培养基上均匀分布，吸去多余水分，封口膜封口。在拟南芥培养室中，筛选7天。挑选明显为深绿色、根系长、植株高的拟南芥植株移栽到土中。移栽之前先浇水，移栽后保鲜膜覆盖四天。植株生长到一定时期，取叶片提取DNA。以之为模板，以转化入片段的相应引物对为引物做PCR，验证是否为转基因植株。
T1代植株单株收种(T2代)，在4℃冰箱黑暗条件下春化一个星期后，开始筛选。种子分装于1.5ml的Ep管，每管约100ul体积，加升汞(0.1％HgCl2)1ml灭菌6分钟，用无菌水清洗5次，最后用无菌水重悬后，转移到潮霉素30mg/L的MS培养基上，使种子在培养基上均匀分布，吸去多余水分，封口膜封口。在拟南芥培养室中，筛选7天。挑选潮霉素抗性分离比为3∶1的株系，用Southern分子杂交挑选单拷贝插入的株系，将单拷贝插入株系的抗性植株移栽到土中。将收到的种子(T3代)通过潮霉素筛选来确定其是否是纯合株系，将经过鉴定为纯合的株系的种子即T3代在土中播种。以其4-6周正常生长植株为材料，检测启动子片段驱动GUS基因表达的情况。
作为拟南芥转化和GUS表达的阳性对照，以含35S启动子驱动GUS基因表达的pCAMBIA1301载体转化拟南芥，得到10株转基因植株，其中四株用于T3代分析。这四株正常生长转基因材料在四周后将整株拟南芥从土中拔出，尽量不损坏根部。用水将植株清洗干净并用滤纸吸去多余水分，然后将整株植物放于小培养皿中，以X-Gluc染液染色，检测GUS表达。四个植株均检测到GUS表达，且蓝色出现在植株的各个部位，包括叶片、叶柄、叶原基、根等。
GUS染色的阴性对照一，即经PBZ处理的处于相同生长时期的野生型拟南芥四株，未检测到GUS基因的表达。
这些结果表明，我们拟南芥转化以及GUS基因表达的检测系统是可靠的。
pCW-box1、pCW-box2、pCW-box3转化拟南芥分别得到9、7、11株转基因植株，分别命名为pCW-box1(1)-pCW-box1(10)、pCW-box2(1)-pCW-box2(9)、pCW-box3(1)-pCW-box3(12)。
将pW-box1、pCW-box2、pCW-box3转化得到的部分转基因株系分别用水和PBZ处理3天后，将整株植物进行GUS表达分析，检测GUS基因的表达。pCW-box1转化的四个植株中，有3株显示GUS表达，表达只出现在整个叶片和部分根部。pCW-box2、pCW-box3转基因植株表现出的组织定位类似，但表达强度明显不同。
将pCW-box1、pCW-box2、pCW-box3转化得到的转基因株系分别用水和PBZ处理3天后，取充分展开叶片进行GUS酶活定量分析，结果显示不同的串连元件重复表现出酶活的梯度，但酶活的大小与元件的多少并不呈现正线性相关，且其本底表达量随元件串连的增加也同时表现出增加的趋势，其中pCW-box2表现出最佳的PBZ诱导活性。
在阴性对照二中，即在转含有基本启动子驱动GUS基因表达的载体的植株中，能检测到GUS基因的微量表达，主要集中于叶柄基部，且其表达不受PBZ处理的影响。
以上结果表明，人工合成的W-box序列在转基因拟南芥中可响应PBZ的诱导，具有可诱导的启动活性，并且其整体活性和诱导活性均可通过技术手段进行调节，其中W-box的2X顺式串连后表现出较强的整体活性和较低的本底表达，具有最佳的PBZ诱导活性。本发明涉及的序列SEQ ID No1的信息长度28碱基类型核酸链性单链拓扑结构线性分子类型寡核苷酸序列描述SEQ ID No1CACTTAATTTGACCGAGTAACATTCGCCSEQ ID No2的信息长度47碱基类型核酸链性单链拓扑结构线性分子类型寡核苷酸序列描述SEQ ID No2CTAGACACACTTAATTTGACCGAGTAACATTCGCCACTAGTAAGCTTCTGCASEQ ID No3的信息长度39碱基类型核酸链性单链拓扑结构线性分子类型寡核苷酸序列描述SEQ ID No3GAAGCTTACTAGTGGCGAATGTTACTCGGTCAAATTAAGTGTGTSEQ ID No4的信息长度71碱基类型核酸链性单链拓扑结构线性分子类型寡核苷酸序列描述SEQ ID No4CTCTAGACACATTTAATTTGAAGTAACATTCCCCACTAGACACACTTAATTTGAAGTAACATTCCCCACTASEQ ID No5的信息长度132碱基类型核酸链性单链拓扑结构线性分子类型基因组DNA序列描述SEQ ID No5CTCTAGACACATTTAATTTGAAGTAACATTCCCCACTAGACACACTTAATTTGAAGTAACATTCCCCACTAGACACACTTAATTTGAAGTAACATTCCCCACTAGACACACTTAATTTGAAGTAACATTCGCCACTAGTASEQ ID No6的信息长度1520碱基类型核酸链性单链拓扑结构线性分子类型基因组DNA序列描述SEQ ID No61 CGTATTCGAA TTCGAATACG GATAATATCC GTTTTTTTCC GGATACGAAT GCAGATATTT61 CAGACGGATT TTGGATTTTT TGATGATCCT GTCATATTAT TGATGATTTC AGAACAATTT121 TTTACCGTTA AACTCAAATA ATATTTTACT ATATGTATAA AATATTTGTA CAATTATATA
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权利要求
1.一种受化学物质烯丙异噻唑诱导的顺式元件，其特征在于是一个源于大麦且对PBZ的诱导作出应答的一个顺式作用元件，其核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1，记为W-box。
2.一重组载体，其特征在于该载体含有权利要求1所述的顺式元件w-box或其顺式串连构成的启动子；该载体转化后的植物中，包含所述核酸启动子片段、与该启动子相连的编码特定基因的DNA顺序及合适的3’下游序列，使转化该重组载体后的植物在有化合物烯丙异噻唑或其活性代谢物的作用下，特定基因产物水平上升；其中的选择的基因为编码GUS的基因。
3.一种用权利要求2所述的DNA结构转化的植物，这种转基因植物用化合物烯丙异噻唑或其活性代谢物处理引起编码选择的基因产物的DNA顺序表达增高，该DNA顺序经操作连接在所述启动子片段的3’端。
4.一种由权利要求3所述的转基因植物的种子。
5.一种在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，其特征在于具体如步骤如下a)用上述描述的重组DNA结构转化植物；b)用化合物烯丙异噻唑或其活性代谢物处理转基因植物；c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。
全文摘要
本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种分离和利用核酸的顺式元件，该元件来源于大麦中抗病相关基因上游的启动子序列。将编码所希望的目的产物基因的核苷酸序列和单元件或其顺式串连重复后得到的启动子融合得到重组DNA，用这种重组DNA转化植物，将得到新的转基因植物。在新的植物中该重组DNA中的目的基因的表达受烯丙异噻唑probenazole(3－allyloxy－1，2－benzisothiazole－1，1－dioxide，PBZ)或其活性代谢物1，2－benzisothiazole－1，1－dioxide(BIT)的化学诱导物调控。
文档编号C12N15/82GK1986796SQ20061014725
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月14日 优先权日2006年12月14日
发明者蒯本科, 杨进孝, 高炯, 周茜, 余进 申请人:复旦大学