专利名称：一种重组酵母Pp420D生产漆酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种工业用酶制剂的制备方法，特别涉及以酵母基因工程菌高密度发酵法制备工业用酶制剂的方法，确切地说是一种重组酵母Pp420D生产漆酶的方法。
背景技术：
漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类化合物氧化，同时伴随有分子氧还原成水。漆酶广泛存在于高等真菌(特别是担子菌)中。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制浆和漂白、食品风味改良、饲料营养改善、人工合成染料脱色、纺织纤维软化细化、新型药物开发、生物传感器制造及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值[洪宇植，肖亚中，房伟等(2005)Trametes sp.AH28-2漆酶A的诱导合成及其基因5′-端调控区的克隆与分析.生物工程学报21547-552；Xiao YZ，Hong YZ，Li JF et al(2006)Cloning of novel laccase isozyme genes from Trametes sp.AH28-2 and analyses of their differentialexpression.Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-005-0188-2]，近年来成为国际酶工程学和环境科学交叉领域研究的一个热点。
真菌漆酶的产业化应用需要大量廉价的酶制剂。然而，多数野生真菌的漆酶产量普遍低下，且液态发酵生产过程通常需要芳香类化合物诱导。毒性诱导物的使用使得发酵液净化处理难度大，易造成环境污染，酶的生产成本高。
重组表达是现代酶制剂和稀有蛋白生产普遍采用的生物技术。有一些漆酶同工酶成功获得异源活性表达，宿主菌主要为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryze)等，表1概括了近年来国际上漆酶重组表达的情况。在这些研究中，多数重组漆酶的得率较低(一般低于10×104U/L)，或者发酵周期太长，尚难以满足工业应用的需要。
表1漆酶重组表达情况
*检测底物为愈创木酚，其余的为ABTS(2，2′-连氮基-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸])。
发明内容
本发明使用的基因工程菌株酵母Pp420D(Pichia pastoris Pp420D)由申请人自主构建。系统研究了漆酶发酵生产的工艺，包括发酵培养基配制、灭菌、接种、种液制备和发酵培养以及后处理。所述的发酵培养就是将制备的种液接种在经灭菌的pH4.0～7.0的发酵培养基中，于25～31℃条件下培养20～30小时，维持溶氧25～35％，然后按每升发酵培养基每小时添加12～25mL营养液的速度流加甲醇营养液，于18～28℃条件下继续培养7～10天后进行后处理；所述的培养基为每升水中含30～50g甘油、10～25g K2SO4、10～20gMgSO4·7H2O、3～5g KOH、0.5～1.5g CaSO4、20～35mL 85％的H3PO4；所述的甲醇营养液为每升甲醇中含1.0～1.5vt％(体积百分比，下同)的微量元素母液，微量元素母液为每升水中含40～80g FeSO4·7H2O、15～30g ZnCl2、3～9g CuSO4·5H2O、2～4g MgSO4·7H2O、0.3～0.6gCoCl2、0.1～0.4g生物素、0.1～0.3g Na2MoO4、0.01～0.03g H3BO3、0.06～0.1g NaI、3～7mL浓H2SO4。
在发酵培养过程中流加甲醇营养液时，优选每升发酵培养基每小时添加16～20mL营养液的流加速度。
发酵培养基优选每升水中含40g甘油、18g K2SO4、15g MgSO4·7H2O、4g KOH、1gCaSO4、27mL 85％的H3PO4。
甲醇营养液优选每升甲醇中含1.2vt％的微量元素母液。
微量元素母液优选每升水中含65g FeSO4·7H2O、0.5g CoCl2、0.2g生物素、0.2gNa2MoO4、0.02g H3BO3、0.08g NaI、5mL浓H2SO4。
所述后处理是指发酵培养结束后漆酶的分离与纯化。
过滤分离得到的发酵液即是漆酶粗制剂。漆酶产量高达2.0×105U/L(ABTS法)。粗酶制剂加水稀释后可直接用于纸浆漂白、染料脱色、纤维软化、饲料加工等，也可以浓缩、冻干后贮存。分离得到的菌体可加工蛋白饲料。
当用于食品、饮料或生物传感器时应对漆酶粗制剂进行纯化。纯化过程在4～10℃条件下进行，首先将漆酶粗制剂浓缩，然后溶于缓冲溶液中，离心分离后上清液用离子交换树脂纯化。
利用重组酵母Pp420D生产漆酶成本低廉，发酵工艺成熟，能进行大规模生产。且在漆酶生产过程中无需毒性芳香化合物诱导，发酵液后处理简单，对环境无毒害作用。
漆酶生产周期短、产量高，漆酶酶活在2.0×105U/L(ABTS法)以上。
由申请人自主构建的漆酶生产菌株重组酵母Pp420D(Pichia pastoris Pp420D，分类名毕赤酶母)已于2006年04月04日送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNOM206031。
具体实施例方式
(一)、培养基制备1、种子培养基(1L)13.4g酵母氮素(YNB，无氨基酸)、10g甘油、0.4mg生物素。过滤除菌。
2、发酵培养基(1L)40g甘油、18.2g K2SO4、14.9g MgSO4·7H2O、4.1g KOH、0.93gCaSO4、26.7mL H3PO4(85％)。121℃高温灭菌20min，或者过滤除菌(孔径0.45μm)。
3、微量元素母液(1L)65g FeSO4·7H2O、20g ZnCl2、6.0g CuSO4·5H2O、3.0gMgSO4·7H2O、0.5g CoCl2、0.2g生物素、0.2g Na2MoO4、0.02g H3BO3、0.08g NaI、5mL浓H2SO4。过滤除菌。
4、甲醇营养液在1L甲醇中加入1.2vt％的无菌的微量元素母液。
(二)、种液制备接种酵母Pp420D到已灭菌的种子培养基中，25～31℃、150～300r/min培养16～24小时，至菌悬液在600nm处的光吸收OD600＝2～10。酶活测定方法参考文献[Liu W，Chao Y，Liu S et al(2003)Molecular cloning and characterization of laccase gene from the basidiomycete Fome lingosus andexpression in Pichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol 63174-181]。
(三)、发酵产酶1、将种液按5～15％体积分数接种于已灭菌的发酵培养基中，25～31℃培养，流加氨水维持pH4.0～7.0，自动调节转速使溶氧维持在20～35％。
2、20～30小时后，按每升发酵培养基每小时添加15～25mL营养液的速度流加甲醇营养液，同时调节温度至18～28℃，维持溶氧30％继续发酵7～10天，当菌体光密度OD600达500以上、漆酶酶活超过2.0×105U/L(ABTS法)时，发酵培养结束。
(四)、酶制剂制备1、酶活力达到高峰时下罐并收集发酵液，十层纱布过滤(或4000～10000×g离心10～20min)除去菌体，即得到漆酶粗制剂(可根据需要超滤浓缩或加水稀释，用于纸浆漂白、工业染料脱色、废水处理、纤维软化、饲料加工等领域)。菌体可加工成蛋白类饲料。
2、粗酶制剂依次按下述步骤可获得纯酶，所有操作在4～10℃进行①粗制剂超滤浓缩10～50倍，在10mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH8.0)中透析3～6h，然后10000×g离心10min。②上清液上预先用透析液平衡的DEAE-Sepharose FF离子交换柱，并用0.3mol/L的硫酸铵进行线性洗脱，活性组分用灭菌水(或去离子水)稀释并超滤脱盐，即可获得纯酶制剂(纯酶制剂除了可用于上述粗酶的应用领域外，还能用于食品和饮料工业、生物传感器等)。
权利要求
1.一种重组酵母Pp420D生产漆酶的方法，包括培养基配制、灭菌、接种、种液制备和发酵培养以及后处理，其特征在于所述的发酵培养就是将制备的种液接种在经灭菌的pH4.0～7.0的发酵培养基中，于25～31℃条件下培养20～30小时，维持溶氧25～35％，然后按每升发酵培养基每小时添加12～25mL营养液的速度流加甲醇营养液，于18～28℃条件下继续培养7～10天后进行后处理；所述的发酵培养基为每升水中含30～50g甘油、10～25g K2SO4、10～20g MgSO4·7H2O、3～5g KOH、0.5～1.5g CaSO4、20～35mL 85％的H3PO4；所述的甲醇营养液为每升甲醇中含1.0～1.5vt％的微量元素母液，微量元素母液为每升水中含40～80g FeSO4·7H2O、15～30g ZnCl2、3～9g CuSO4·5H2O、2～4g MgSO4·7H2O、0.3～0.6gCoCl2、0.1～0.4g生物素、0.1～0.3g Na2MoO4、0.01～0.03g H3BO3、0.06～0.1g NaI、3～7mL浓H2SO4。
2.根据权利要求1所述的生产漆酶的方法，其特征在于所述的发酵培养基为每升水中含40g甘油、18g K2SO4、15g MgSO4·7H2O、4g KOH、1g CaSO4、27mL 85％的H3PO4。
3.根据权利要求1或2所述的生产漆酶的方法，其特征在于按每升发酵培养基每小时添加16～20mL营养液的速度流加甲醇营养液。
4.根据权利要求3所述的生产漆酶的方法，其特征在于所述的甲醇营养液为每升甲醇中含1.2vt％的微量元素母液。
5.根据权利要求1或4所述的漆酶的方法，其特征在于所述的微量元素母液为每升水中含65g FeSO4·7H2O、20g ZnCl2、6g CuSO4·5H2O、3g MgSO4·7H2O、0.5g CoCl2、0.2g生物素、0.2g Na2MoO4、0.02g H3BO3、0.08g NaI、5mL浓H2SO4。
全文摘要
一种重组酵母Pp420D生产漆酶的方法，由申请人自主构建的基因工程菌株酵母Pp420D制备种液后接种在培养基上于25～31℃条件培养20～30小时，维持溶氧25～35％，然后按每升发酵培养基每小时添加12～25mL营养液的速度流加甲醇营养液，于18～28℃条件下继续培养7～10天后过滤分离，发酵液即是漆酶粗制剂，添酶酶活超过2.0×10
文档编号C12N9/02GK1952111SQ200610147190
公开日2007年4月25日 申请日期2006年11月9日 优先权日2006年4月19日
发明者肖亚中, 洪宇植, 周宏敏, 李剑凤 申请人:安徽大学