专利名称：南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种分子生物技术领域的核苷酸序列，特别是一种南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列。
背景技术：
随着世界范围内能源短缺和环境保护的需要，生物柴油(即脂肪酸单酯)可作为石油燃料的理想替代物，是一种清洁可再生的生物能源，属于环境友好型绿色燃料，具有深远的经济效益与社会效益，其应用已经成为世界关注和研究的热点。脂肪酶是甘油酯水解酶(EC3.1.1.3)，能够将甘油三酯水解成为脂肪酸和甘油，也能够催化动植物及废弃物油脂进行酰基转移反应，生成脂肪酸单酯，即生物柴油。在用生物酶法制备生物柴油的产业化进程中，高效且稳定的脂肪酶是降低成本、使之实现产业化的关键所在。在众多脂肪酶中，CALB(Candida antarcticalipase B，南极假丝酵母脂肪酶B)对非水溶性的酰基转移反应具有很强的催化活性，尽管现有的很多研究表明将CALB进行固定化或全细胞进行生物催化确实在一定程度上能提高酶的催化效率，但其催化效率并没有达到理想的可以产业化的水平，所以寻求高效、稳定的脂肪酶成了目前研究的热点，也是目前生物柴油研究所面临的一个瓶颈。目前从理论上寻求高效稳定脂肪酶的方法有三种1)通过化学修饰提高脂肪酶的活性，但该方法对需要修饰的目标氨基酸不能做到特异的修饰。2)遵训酶自身进化的规律来寻求更好的酶的方法随机突变和DNA改组，能够构建出多样化的文库，由于该方法需要通过表达和高通量的筛选来获得具有特性的突变酶，存在繁重的工作量和较低的效率的问题。3)通过基于酶的结构与功能的关系的定点突变方法改变酶的活性和提高酶的稳定性，该方法具有简单高效的特点。
始于1994年，学术界开始研究CALB的氨基酸序列和蛋白质三维空间结构(Structure.1994，2293-308)，研究提供了CALB完整编码区的氨基酸序列及其信号肽序列，并且与其它脂肪酶的氨基酸序列同源性的比较表明CALB与其它脂肪酶没有明显的同源性。尽管对CALB进行了定向进化(Protein Engineering，Design and Selection，2004，17133-140)(《蛋白质工程、设计和选择》杂志)，在一定程度上提高了CALB的水解活性和热稳定性，但是尚未发现与本发明主题的酰基转移活性有密切联系文献的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列，本发明利用基因工程的办法，将该基因在毕赤酵母中实现高效表达，以提高表达脂肪酶的含量和酰基转移活力，从而间接降低发酵的成本。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明按照毕赤酵母偏爱密码子结构，通过化学方法人工合成了MuCALB1基因，人工合成的DNA分子，编码具有与野生型CALB蛋白在氨基酸水平具有相同功能并提高了酰基转移活力的核苷酸序列，所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列杂交。
所述的编码具有MuCALB1脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列，具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性。所述的MuCALB1，是指南极假丝酵母脂肪酶氨基酸序列多肽的三个突变氨基酸位点分别是Va1210Ile、Ala281 Glu、Asn292 Tyr，是突变的CALB的氨基酸序列多肽。
根据所述的突变的CALB的氨基酸序列多肽，按照毕赤酵母偏爱密码子的优先结构，设计并通过亚磷酸三酯法人工合成了CALB基因。这种体外使用核酸自动合成仪合成的DNA分子，编码具有与野生型CALB蛋白在氨基酸水平上有三个位点不同、但具有相同功能和不同催化能力的核苷酸序列。
所述的中度严谨条件下，指核苷酸序列之间能在0.3M柠檬酸钠，3M氯化钠，pH7.0的2×SSC和0.1％SDS的条件下。
所述的化学方法，指亚磷酸三酯法，用于核苷酸序列的固相合成。
所述的人工合成，指在体外进行的、使用核酸自动合成仪合成核苷酸序列的方法。
所述的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
本发明的突变南极假丝酵母脂肪酶基因按如下毕赤酵母偏爱密码子的优先结构设计见表1
表1用人工合成的方法获得MuCALB1基因核苷酸编码序列后，就可以用重组法来大批量获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
用如下在毕赤酵母中产生和表达的方法能够获得所述的MuCALB1基因，其方法步骤如下(1)将按毕赤酵母偏爱密码子设计人工合成的编码MuCALB1蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成突变南极假丝酵母脂肪酶基因在表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列杂交。
本发明可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在生产本发明的脂肪酶多肽时，可以将脂肪酶编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成脂肪酶蛋白表达载体。
本发明所说“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
(2)将步骤(1)中的表达载体电击转入毕赤酵母，在28-30℃条件下，在抗生素平板上培养2-4天，获得含有MuCALB1蛋白基因的重组细胞。
(3)再生重组细胞，获得表达MuCALB1蛋白基因的重组酵母菌株。
所述的MuCALB1蛋白基因，指编码具有与南极假丝酵母脂肪酶催化性质相同、催化酰基转移活性提高的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-957位核苷酸序列。该术语还指能在中度严谨条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列的同源性至少85％，较佳地至少90％，更佳地至少95％，最佳地至少98％的核苷酸序列。
本发明的“三个氨基酸位点的变异”指与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，氨基酸序列多肽的三个位点Ile210、Glu281、Tyr292，更佳地有4个，较佳地至多3个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本发明根据南极假丝酵母的三维空间结构，设计了三个氨基酸位点的突变，并按照毕赤酵母偏爱密码子的优先结构，人工合成了具有与野生型南极假丝酵母分泌的具有三个重要氨基酸位点突变的脂肪酶基因，并利用基因工程的办法，使之在毕赤酵母中高度表达，气相色谱测定表达脂肪酶的酰基转移活力，提高了脂肪酶的表达量和酰基转移活力，从而降低了工业发酵的成本，在工业上具有广阔的产业化前景。
本发明根据南极假丝酵母脂肪酶CALB蛋白质的三维结构，设计了多个氨基酸位点的突变及不同突变位点的组合，实验结果证明其中的一个有三个氨基酸位点突变的蛋白质的酰基转移活力提高，然后按毕赤酵母偏爱密码子对照表设计合成了该突变氨基酸的南极假丝酵母脂肪酶(MuCALB1)基因，全长为957bp，即为开放阅读框，详细序列见SEQ ID NO.1。据此推导出，除了一个终止密码子外，共编码318个氨基酸残基，分子量为33.6KD，等电点(pI)为5.26，详细序列见SEQ ID NO.2。
按毕赤酵母偏爱密码子设计人工合成的MuCALB1基因序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与野生型南极假丝酵母CALB具有一定的同源性。在核苷酸水平上，它与野生型南极假丝酵母脂肪酶CALB的核苷酸序列(GenBankAccession No.Z30645)的全编码序列具有一定的同源性，其中同源性较高的部分见同源比较(GAP)图表2(相同的核苷酸在两个序列之间用竖线符标出)在氨基酸水平上，它与野生型南极假丝酵母CALB(GenPept Accession No.P41365)氨基酸残基有一定的相似性，见氨基酸序列同源比较(FASTA)图表3(相同的核苷酸在两个序列之间用竖线符标出)由此可见，设计合成的MuCALB1与野生型南极假丝酵母脂肪酶CALB在蛋白水平上存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也有很高相似性。
表278％identity in 281nt overlapQuery 133 ggtccacaatctttcgactctaactggattccattgtctactcaattgggttacactcca 192|||||||| || |||||||| |||||||| || | || || || ||||||||||| ||Sbjct 205 ggtccacagtcgttcgactcgaactggatccccctctcaacgcagttgggttacacaccc 264Query 193 tgttggatttctccaccacctttcatgttgaacgacactcaagttaacactgaatacatg 252|| ||||| || || || || |||||| | |||||||| || || ||||| || ||||||Sbjct 265 tgctggatctcacccccgccgttcatgctcaacgacacccaggtcaacacggagtacatg324Query 253 gttaacgctattactgctttgtacgctggttctggtaacaacaagttgccagttttgact312|| ||||| || || || | ||||||||||| || ||||||||| | || || | ||Sbjct 325 gtcaacgccatcaccgcgctctacgctggttcgggcaacaacaagcttcccgtgcttacc384Query 313 tggtctcaaggtggtttggttgctcaatggggtttgactttcttcccatctattagatct372||||| || |||||| ||||||| || |||||| |||| |||||||| ||| || ||Sbjct 385 tggtcccagggtggtctggttgcacagtggggtctgaccttcttccccagtatcaggtcc444Query 373 aaggttgatagattgatggcttttgctccagactacaaggg 413||||| ||| || | ||||| ||||| || |||||||||||Sbjct 445 aaggtcgatcgacttatggcctttgcgcccgactacaaggg 485
Query按毕赤酵母偏爱密码子设计人工合成和突变的MuCALB1基因的核酸序列sbjct南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的核酸序列(Z30645)表2按毕赤酵母偏爱密码子设计人工合成的MuCALB1与野生型南极假丝酵母CALB的核苷酸序列同源比较(GAP)。(相同的核苷酸在两个序列之间用竖线符标出)表398％identity in 317aa overlapQuery 2LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLG 61LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGSbjct 26 LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLG 85Query 62 YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPS 121YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSSbjct 86 YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPS 145Query 122 IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTT 181IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTSbjct 146 IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTT 205Query 182 NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNIQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSA 241NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKN+QAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSASbjct 206 NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSA 265Query 242 LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPEAAAIVAGPKQYCEPDLMPY 301LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAP AAAIVAGPKQ CEPDLMPYSbjct 266 LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPY 325Query 302 ARPFAVGRRTCSGIVTP 318ARPFAVG+RTCSGIVTPSbjct 326 ARPFAVGKRTCSGIVTP 342Query按毕赤酵母密码子偏爱设计人工合成和突变的MuCALB1的氨基酸序列Sbjct南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的氨基酸序列(P41365)表3按毕赤酵母偏爱密码子设计的MuCALB1与野生型南极假丝酵母CALB的氨基酸序列同源比较(FASTA)。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
具体实施例方式
为更好地理解本发明的技术方案，以下通过具体的实施例来进一步详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1MuCALB1基因在毕赤酵母中的产生1.在保证阅读框正确的前提下，将含有合成基因(MuCALB1)的pPICZαA质粒载体的大肠杆菌，接种到含Zeocin抗生素的LB培养基中。
2.在37℃的恒温摇床上培养过夜，过夜的细菌按照分子克隆所提供的方法抽提质粒。
3.再采用电击法(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)将其转入毕赤酵母(如GSl15，或KM71)。
4.利用PCR方法分析确认毕赤酵母基因组中整合了目的基因MuCALB1。
实施例2MuCALB1基因在毕赤酵母细胞中的诱导表达1.将实施例1所获得的含有MuCALB1基因的重组酵母细胞用无菌牙签挑取，接种于25mlBMGY培养基中，28℃，250rpm振荡培养至光密度值OD600＝2-6(一般需要16-18小时)，使细胞处于对数生长期。
2.培养细胞在室温下1500-3000g离心5min，弃上清。
3.菌体用BMMY培养基悬浮，使菌液的OD600＝1.0，菌液在28℃，250rpm继续振荡培养，每隔24小时加入纯甲醇至终浓度是0.5％，以补充挥发的甲醇来保证正常诱导目的基因的表达。
4.按照时间点(0，6，12，24，48，72，96小时)分别取出1ml培养液，测定OD600。
5.各时间点取样在室温下12000rpm离心2-3分钟，测定上清水解对硝基苯酚葵酸酯的活力取4μl表达上清加至对硝基苯酚酯测定脂肪酶活反应体系含192μl 1M TrisCl，pH8.0，4μl 25mM对硝基苯酚葵酸酯(用DMSO配制)，混匀室温反应10min，加100μl无水乙醇终止反应，反应生成的对硝基苯酚是黄色物质，从而确定上清中表达脂肪酶。同时终止反应后，测光吸收A405nm，根据对硝基苯酚标准浓度的光吸收A405nm曲线计算反应体系生成的对硝基苯酚，再计算样品每分钟分解硝基苯酚葵酸酯产生对硝基苯酚的μg数，即酶活力单位(U)。根据OD600和水解酶活力(U)绘制重组脂肪酶酵母菌的生长曲线。结果表明重组脂肪酶酵母菌在诱导表达48小时后，酶活力达到最高1.5×103U/ml，光密度值OD600是10.8。
6.菌株的扩大培养根据生长曲线，大量发酵重组酵母以制备脂肪酶。
7.发酵培养液在4℃，1500-3000g离心5min，取上清，在上清中加入4倍体积的预冷丙酮，在低温搅拌20min，然后4℃，9000g离心20min，弃上清，浓缩的蛋白在冷冻干燥器中进行干燥，将干粉置于-20℃保存备用。
实施例3MuCALB1诱导表达产物的鉴定1.将实施例2中获得的浓缩脂肪酶进行SDS-PAGE电泳分析，初步确定了在培养液中有目的蛋白的表达。
2.将实施例2中获得的浓缩脂肪酶进行催化酰基转移活力实验，利用气相色谱测定转化率。
3.所述的催化酯基转移活力实验的方法体系如下在0.339g的大豆油底物中，加入1/10质量的浓缩脂肪酶催化剂，加入3.6ml的有机试剂无水正庚烷，再加入48.5ul的无水甲醇(分三次加，时间间隔5小时)，在55℃，200rpm的恒温摇床下反应24小时，用气相色谱测定酰基转移活力。同时，以野生型南极假丝酵母脂肪酶CALB作为对照实验。
4.气相色谱测定酯基转移活力的方法如下取酰基转移反应产物500ul于12000rpm离心10min，取292.5ul上清，加入7.5ul40mM的标品十七烷酸甲酯，充分混匀后进样。色谱柱是HP-5柱，柱温320℃，氮气流速3.0 mL/min，进样量3μL，灵敏度为AUFS＝1.0。根据色谱峰面积计算转化率来确定酰基转移酶的活力。转化率计算公式转化率＝各脂肪酸甲酯峰面积/(97.5×十七烷酸甲酯峰面积×3)。
5.测定结果表明野生型CALB对大豆油的转化率大小是9.8％，而突变型MuCALB1的转化率则达到30.2％，突变型MuCALB1的转化率是野生型CALB的3.08倍，酰基转移活力的提高对解决酶法制备生物柴油中转化率低的问题具有重要意义。
本发明涉及的序列和记号分列如下SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大学<120>南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列<140>
<141>2006-11-21<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>957<212>DNA<213>人工合成<400>11 atgttgcctt ctggttctga ccctgctttt tctcaaccaa agtctgtttt ggatgctggt61 ttgacttgtc aaggtgcttc tccatcttct gtttctaaac caattttgtt ggttccaggt121actggtacta ctggtccaca atctttcgac tctaactgga ttccattgtc tactcaattg181ggttacactc catgttggat ttctccacca cctttcatgt tgaacgacac tcaagttaac241actgaataca tggttaacgc tattactgct ttgtacgctg gttctggtaa caacaagttg301ccagttttga cttggtctca aggtggtttg gttgctcaat ggggtttgac tttcttccca361tctattagat ctaaggttga tagattgatg gcttttgctc cagactacaa gggtactgtt421ttggctggtc ctttggatgc tttggctgtt tctgctccat ctgtttggca acaaactact481ggttctgctt tgactactgc tttgagaaac gctggtggtt tgactcaaat tgttccaact541actaacttgt actctgctac tgacgaaatt gttcaacctc aagtttctaa ctctccattg601gactcttctt acttgttcaa cggtaagaac attcaagctc aagctgtttg tggtccattg661ttcgttattg accatgctgg ttctttgact tctcaattct cttacgttgt tggtagatct721gctttgagat ctactactgg tcaagctaga tctgctgact atggtattac tgactgtaac781cctttgccag ctaatgattt gactccagaa caaaaggttg ctgctgctgc tttgttggct
841ccagaagctg ctgctattgt tgctggtcca aagcaatact gtgaaccaga cttgatgcca901tacgctagac catttgctgt tggtagaaga acttgttctg gtattgttac tccataaSEQ ID NO.2的信息<210>2<211>318<212>PRT<213>人工序列<400>21 MLPSGSDPAF SQPKSVLDAG LTCQGASPSS VSKPILLVPG TGTTGPQSFDSNWIPLSTQL61 GYTPCWISPP PFMLNDTQVN TEYMVNAITA LYAGSGNNKL PVLTWSQGGLVAQWGLTFFP121 SIRSKYDRLM AFAPDYKGTV LAGPLDALAV SAPSVWQQTT GSALTTALRNAGGLTQIVPT181 TNLYSATDEI VQPQVSNSPL DSSYLFNGKN IQAQAVCGPL FVIDHAGSLTSQFSYVVGRS241 ALRSTTGQAR SADYGITDCN PLPANDLTPE QKVAAAALLA PEAAAIVAGPKQYCEPDLMP301YARPFAVGRR TCSGIVTP
权利要求
1.一种南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征在于，按照毕赤酵母偏爱密码子结构，通过化学方法人工合成了MuCALB1基因，人工合成的DNA分子，编码具有与野生型CALB蛋白在氨基酸水平具有相同功能并提高了酰基转移活力的核苷酸序列，所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的编码具有MuCALB1脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列，具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性。
3.根据权利要求1所述的南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的MuCALB1，是指南极假丝酵母脂肪酶氨基酸序列多肽的三个突变氨基酸位点分别是Val210 Ile、Ala281 Glu、Asn292 Tyr，是突变的CALB的氨基酸序列多肽。
4.根据权利要求3所述的南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，根据所述的突变的CALB的氨基酸序列多肽，按照毕赤酵母偏爱密码子的优先结构，设计并通过亚磷酸三酯法人工合成了CALB基因。
5.根据权利要求1所述的南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的中度严谨条件下，指核苷酸序列之间能在0.3M柠檬酸钠，3M氯化钠，pH7.0的2×SSC和0.1％SDS的条件下。
6.根据权利要求1所述的南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的化学方法，指亚磷酸三酯法，用于核苷酸序列的固相合成。
7.根据权利要求1所述的南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的人工合成，指在体外进行的、使用核酸自动合成仪合成核苷酸序列的方法。
8.根据权利要求1或者3或者5所述的南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，所述的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
9.根据权利要求1或者2或者3所述的南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列，其特征是，用如下在毕赤酵母中产生和表达的方法能够获得所述的MuCALB1基因(1)将按毕赤酵母偏爱密码子设计人工合成的编码MuCALB1蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成南极假丝酵母脂肪酶基因表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列杂交；(2)将步骤(1)中的表达载体电击转入毕赤酵母，在28-30℃条件下，在抗生素平板上培养2-4天，获得含有CALB蛋白基因的重组细胞；(3)再生重组细胞，获得表达CALB蛋白基因的重组酵母菌株。
全文摘要
本发明涉及的是一种分子生物技术领域的南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列。按照毕赤酵母偏爱密码子结构，通过化学方法人工合成了MuCALB1基因，人工合成的DNA分子，编码具有与野生型CALB蛋白在氨基酸水平具有相同功能并提高了酰基转移活力的核苷酸序列，所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQID NO.1中从核苷酸第1－957位的核苷酸序列杂交。所述的编码具有MuCALB1脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列，具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1－957位的核苷酸序列有至少85％的同源性。本发明其基因在毕赤酵母细胞中高效表达的脂肪酶量达到21.6mg/L，酰基转移活力转化率是野生型CALB的3.08倍，为酶法制备生物柴油中酰基转移酶活力低的问题具有重要意义。
文档编号C12N1/19GK1986558SQ200610147229
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月14日 优先权日2006年12月14日
发明者唐克轩, 姚红艳, 王绛 申请人:上海交通大学