专利名称：：具有经调节的免疫原性的非天然氨基酸多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有经调节的免疫原性的经至少一个非天然编码的氨基酸修饰的多肽。
背景技术：
：多种天然和重组蛋白具有医学和药学功用。其在经纯化、分离和调配后，可不经肠投药用于各种治疗适应症。然而，不经肠投与的蛋白质可具有免疫原性，可相对不溶于水且可具有短的药理学半衰期。因此，会难以在患者体内达到蛋白质的治疗有用的血液含量。Schellekens,H.在ClinicalTherapeutics2002;24(11):1720-1740(以引用的方式并入本文中)中论述可能影响治疗蛋白的免疫原性的因素以及抗体形成的潜在临床作用，诸如变态反应或过敏反应、降低治疗蛋白的功效和对内源蛋白产生自体免疫性。因此，免疫原性可能以多种方式限制蛋白质治疗剂的功效和安全性。可通过形成中和抗体直接降低治疗功效。由于结合中和或非中和抗体可能改变血清半衰期，故还可间接降低功效。不合需要的免疫反应可采取注射部位反应的形式，包括(但不限于)延迟型过敏反应。免疫原性反应还可改变药物的药物动力学和/或药效学。Wadhwa,M.等人，JofImmunolMethods2003;278:1-17;Adair,F.etD.Ozanne,BioPharm2002年2月，第30-6页；Chamberlain,P.etA.R.Mire-SluisinDevBiolBasel2003;112:3-11;和Chamberlain,P.TheRegulatoryReview2002;5(5):4-9(以引用的方式并入本文中)描述据报导具有免疫原性的蛋白质。由于甚至重组人类蛋白也可诱导体液的免疫反应，故降低免疫原性是重要的考虑因素(AtkinsMB等人(1986)J.Clin.Oncol.4,1380-1391;GribbenJG等人(1990)Lancet335,434-437，其是以引用的方式并入本文中)。可以通过将蛋白质与聚合物(诸如聚(乙二醇))连结来解决这些问题。Davis等人的美国专利第4,179,337号(其是以引用的方式并入本文中)揭示将聚乙二醇(PEG)与蛋白质(诸如酶和胰岛素)连结，以便产生与非连结型式相比蛋白质具有较低免疫原性且保留其大部分生理活性的连结物。Nakagawa等人的美国专利第4,791,192号(其是以引用的方式并入本文中)揭示将PEG与胰岛活化蛋白质连结以降低其副作用和免疫原性。Veronese等人，AppliedBiochemandBiotech,11:141-152(1985)中揭示用氯甲酸苯酯活化聚乙二醇以修饰核糖核酸酶和超氧化物歧化酶。Katre等人的美国专利第4,766,106号和第4,917,888号(其以引用的方式并入本文中)也揭示通过聚合物连结来使蛋白质增溶。将PEG和其它聚合物与重组蛋白连结以降低免疫原性并且增加半衰期。参看Nitecki等人，美国专利第4,902,502号；Enzon，Inc.,国际申请案第PCT/US90/03133号；Nishimura等人，欧洲专利申请案154,316;和Tomasi，国际申请案第PCT/US85/02572号，所有专利文献都是以引用的方式并入本文中。Knauf等人，J.Biol.Chem.，263:15064-15070(1988)报导一项有关各种经聚氧化甘油和聚乙二醇修饰的白细胞介素-2物质在大鼠体内的药效学行为的研究。也参看AbuchowskiA等人(1977)J.Biol.Chem252,3582-3586和AbuchowskiA等人(1977)J.Biol.Chem252,3578-3581，其是以引用的方式并入本文中。也已开发出药物与PEG形成的连结物(CalicetiP等人(1993)Farmaco48,919-932;ConoverCD等人(1997)Anticancer-Res17,3361-3368;GreenwaldRB等人(1998)Bioorg.Med.Chem.6,551-562;PendriA等人(1998)Anticancer-Dmg-Des13,387-395，其是以引用的方式并入本文中)。此外，已发现PEG与脂质体共价连接可降低非特异性摄取并且增加脂质体的稳定性和半衰期(KirpotinD等人(1997)Biochemistry36，66-75;CabanesA等人(1998)Clin.CancerRes.4,499-505;MeyerO等人(1998)J.Biol.Chem.273,15621-15627，其是以引用的方式并入本文中)。经证实，PEG修饰可降低酶(AbuchowskiA等人(1977)J.Biol.Chem.252,3582-3586;ChaffeeS等人(1992)J.Clin.Invest.89,1643-1651)、抗体(KitamuraK等人(1991)CancerRes51，4310-4315)、毒素(WangQC等人(1993)CancerRes53,4588-4594;HeXH等人(1999)LifeSci65，355-368)、重组人类蛋白(KatreNV(1990).J.Immunol144,209-213)和其它蛋白质(ChinolM等人(1998)Br.J.Cancer78,189-197)的免疫原性，所有参考文献都以引用的方式并入本文中。己通过添加聚乙二醇来修饰干扰素(参看美国专利第4,917,888号、第5,382,657号、WO99/55377、WO02/09766、WO02/3114)。在一些情况下，已观察到，聚乙二醇化可通过在空间上阻断抗体的抗原限制位(agretope)的通路来降低产生中和抗体的患者的比例(例如参看Hershfield等人PNAS199188:7185-7189(1991);Bailon等人Bioconjug.Chem.12:195-202(2001);He等人LifeSci.65:355-368(1999))。Pool,R.Science248:305(其以引用的方式并入本文中)中还描述经由多肽的聚乙二醇化通过稳定共价键来进行表位屏蔽。经证实，将聚合物与多肽连接可增加其血清半衰期。欧洲专利公开案第0442724A2号(其以引用的方式并入本文中)描述具有延长的半衰期的聚乙二醇化白细胞介素-6衍生物。还报导，将药物与聚合物连接可增加其水溶性、储存期间的稳定性并且降低其免疫原性(己公开的专利申请案EP0539167和WO94/13322，其是以引用的方式并入本文中)。还报导，IL-2或其突变蛋白与聚合物的连结物具有降低的免疫原性、增加的溶解性和增加的半衰期(美国专利第5,362,852号、第5,089,261号、第5,281,698号和已公开的专利申请案WO90/07938，所有专利文献都以引用的方式并入本文中)。共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(縮写为PEG)是一种增加许多生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水分子)的水溶性、生物可用性；增加血清半衰期；增加治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间的方法。已将PEG广泛用于医药品中、人工移植物上以及生物可用性、无毒和无免疫原性极为重要的其它应用中。为使PEG的所需特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征，诸如增加的水溶性和循环半衰期，而不会不利地影响母体分子的生物活性。PEG衍生物通常是通过反应性化学官能团(诸如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端和碳水化合物部分)与生物活性分子键联。蛋白质和其它分子通常具有有限数量的反应性可供聚合物连接。通常，最适于经由聚合物连接修饰的位点在受体结合中起到明显作用，并且为保留分子的生物活性所必需。因此，不加选择地将聚合物链与生物活性分子上的所述反应性位点连接通常会使经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.Clark等人,(19%),J.Biol.Chem.,271:21969-21977。为形成具有足够聚合物分子量以赋予靶分子所需优势的连结物，现有技术方法通常涉及将多个聚合物臂与分子随机连接，从而会增加母体分子生物活性降低或甚至完全丧失的风险。形成连接PEG衍生物与蛋白质的基因座的反应性位点可由蛋白质结构指示。蛋白质(包括酶)是由各种a氨基酸序列构成，所述序列的通用结构为H2N—CHR—COOH。一个氨基酸的a氨基部分(H2N-)与相邻氨基酸的羧基部分(-COOH)连接以形成酰胺键，其可表示为—(NH-CHR-CO)n-，其中下标"n"可等于数百或数千。R表示的片段可含有用于蛋白质生物活性和连接PEG衍生物的反应性位点。举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在s位以及a位存在-NH2部分。s-NH2在碱性pH条件下自由反应。使用PEG的蛋白质衍生化领域中的大部分技术已针对开发连接蛋白质中存在的赖氨酸残基s--NH2部分的PEG衍生物。"PolyethyleneGlycolandDerivativesforAdvancedPEGylation",NektarMolecularEngineeringCatalog,2003,第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共有的局限性，也就是说，无法将其选择性地安装于蛋白质表面上存在的常见的多种赖氨酸残基中。在赖氨酸残基对于蛋白质活性极为重要的情况下(例如存在于酶活性位点中)，或者在赖氨酸残基对于介导蛋白质与其它生物分子的相互作用起作用的情况下(如同在受体结合位点的情况下一般)，这会成为显著的局限。现有蛋白质聚乙二醇化方法的另一且同样重要的难题在于，PEG衍生物可与除所需残基外的其它残基进行不合需要的副反应。组氨酸含有在结构上以--N(H)--表示的反应性亚氨基部分，而许多与s-NH2反应的化学反应性物质也可与-N(H)-反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链具有游离巯基，其在结构上以-SH表示。在一些情况下，针对赖氨酸s-NH2基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可产生PEG衍生化生物活性分子的复杂的异种混合物并且存在破坏所靶向的生物活性分子的活性的风险。将需要开发允许在蛋白质内的单一位点处引入化学官能团，随后使一个或一个以上PEG聚合物能够在蛋白质表面上良好界定且可预测的特定位点处与生物活性分子选择性偶合的PEG衍生物。除赖氨酸残基外，所属领域还针对开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活性PEG试剂付出相当多的努力。例如参看美国专利第6,610,281号，其以引用的方式并入本文中；和"PolyethyleneGlycolandDerivativesforAdvancedPEGylation",NektarMolecularEngineeringCatalog,2003,第1-17页。可使用定点诱变和所属领域中已知的其它技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且可使所得游离巯基部分与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方法比较复杂，因为引入游离巯基会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变复杂。因此，需要具有一种将化学官能团引入生物活性分子的方式，其能使一个或一个以上PEG聚合物与蛋白质选择性偶合，同时可与巯基以及蛋白质中常见的其它化学官能团相容(即，不会与其发生不合需要的副反应)。如可从所属领域的取样中了解，这些已开发用于与蛋白质侧链、尤其赖氨酸氨基酸侧链上的—NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分连接的衍生物中有许多经证实在其合成和使用方面存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键，所述键易受水解且因此会分解、降解，或者另外在水性环境(诸如血流)中不稳定。一些衍生物形成较为稳定的键，但在形成键之前易受水解，这意味着PEG衍生物上的反应性基团可能会在连接蛋白质之前失活。一些衍生物略有毒性且因此不太适于活体内使用。一些衍生物因反应过慢而无法实际使用。一些衍生物因与负责蛋白质活性的位点连接而导致蛋白质活性的丧失。一些衍生物对其将连接的位点不具特异性，这也会导致所需活性的丧失以及结果可再现性的缺乏。为克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质相关的问题，已开发出更为稳定(例如，美国专利第6,602,498号，其以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6,610,281，其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。所属领域中明显需要在生理环境中具化学惰性，只有在活化后才选择性反应以形成稳定化学键的PEG衍生物。近来已报导了蛋白质科学中的全新技术，它提供克服与蛋白质位点特异性修饰相关的众多局限的前景。具体来说，已将新颖组件加到原核生物大肠杆菌(&c/z^7'c/n'aco//,co//)(例如参看L.Wang等人，(2001),Science292:498-500)和真核生物酿酒酵母菌(Sflcc/rawyc^cerev/w力，S.cerev/w'ae)(例如J.Chin等人.Science301:964-7(2003))的蛋白质生物合成机器中，所述机器能够在活体内将非基因编码的氨基酸并入蛋白质中。已使用这种方法响应琥珀密码子(TAG)将多种具有新颖化学、物理或生物特性的新颖氨基酸有效且高保真地并入大肠杆菌和酵母的蛋白质中，所述新颖氨基酸包括光亲和标记和可光异构化氨基酸、光交联氨基酸(例如参看Chin,J.W.等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11020-11024;和Chin,J.W.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮基氨基酸、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸。例如参看J.W.Chin等人，(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;J.W.Chin,&P.GSchultz,(2002),ChemBioChem3(11):1135-1137;J.W.Chin等人，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024;和L.Wang,&P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1:1-11。所有参考文献都以全文引用的方式并入本文中。这些研究已证实，有可能选择性且常规地引入未见于蛋白质中、对20种常见的基因编码的氨基酸中所见的所有官能团呈化学惰性并且可用于有效且选择性地反应以形成稳定共价键的化学官能团，诸如酮基、炔基和叠氮基部分。将非基因编码的氨基酸并入蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在的官能团(诸如赖氨酸的s-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代物的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的基因编码的氨基酸中所见的官能团呈惰性，但能完全且有效地反应以形成稳定键。所属领域中已知例如叠氮基和乙炔基在存在催化量的铜的情况下在水性条件下可进行Huisgen[3+2]环加成反应。例如参看Tornoe等人,(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064;和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。例如，通过将叠氮基部分引入蛋白质结构中，将能够并入对蛋白质中所见的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性但也可平稳且有效地与乙炔部分反应以形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮基保持化学惰性，且在存在其它蛋白质侧链的情况下以及生理学条件下不具反应性。本发明尤其针对通过用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代多肽中的任一个或一个以上天然存在的氨基酸或者添加非天然氨基酸来调节多肽的免疫原性，以及针对具有改进的生物或药理学特性(诸如改进的治疗半衰期或经调节的免疫原性)的多肽的制备。
发明内容本发明提供具有经调节的免疫原性的包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽。在一些实施例中，包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽使多肽的免疫原性降低。在一些实施例中，包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽使多肽的免疫原性增强。在一些实施例中，与天然多肽相比，包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽针对多肽的一个或一个以上特异性表位具有经调节的免疫原性。在一些实施例中，与天然多肽相比，包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽针对多肽的一个或一个以上特异性表位具有降低的免疫原性。在一些实施例中，与天然多肽相比，包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽针对多肽的一个或一个以上特异性表位具有增加的免疫原性。本发明还提供通过用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代多肽中的任一个或一个以上天然存在氨基酸或者将非天然氨基酸加到多肽中来调节多肽的免疫原性的方法。在一些实施例中，具有经调节的免疫原性的多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，将具有经调节的免疫原性的多肽与连接基、聚合物或生物活性分子键联。在一些实施例中，将具有经调节的免疫原性的多肽中所存在的非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物键联。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，利用连接基将非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物键联，或者将非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物键结。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为双官能聚合物。在一些实施例中，将双官能聚合物与第二多肽键联。在一些实施例中，多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应多肽的免疫原性相比时所述取代、添加或缺失调节多肽的免疫原性。在一些实施例中，多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应多肽的血清半衰期或循环时间相比时所述取代、添加或缺失调节多肽的血清半衰期或循环时间。在一些实施例中，多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应多肽的水溶性相比时所述取代、添加或缺失增加多肽的水溶性。在一些实施例中，多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应多肽的溶解性相比时所述取代、添加或缺失增加宿主细胞中产生的多肽的溶解性。在一些实施例中，多肽中的氨基酸取代可能是用天然存在的或非天然存在的氨基酸进行，只要至少一个取代是用非天然编码的氨基酸进行的即可。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构-其中n为0-10;R!为垸基、芳基、经取代垸基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代垸基和经取代芳基；且Rg为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含氨基脲基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构其中n为0-10;Ri为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构其中n为0-10;Ri为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，通过使包含含羰基氨基酸的多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物键联的多肽。在一些实施例中，通过酰胺键将氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基与聚(乙二醇)分子键联。在一些实施例中，通过氨基甲酸酯键将氨氧基与聚(乙二醇)分子键联。在一些实施例中，通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含包括氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码的氨基酸的多肽反应来制备与水溶性聚合物键联的多肽。在一些实施例中，通过使包含含炔基氨基酸的多肽与包含叠氮基部分的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物键联的多肽。在一些实施例中，通过酰胺键将叠氮基或炔基与聚(乙二醇)分子键联。在一些实施例中，通过使包含含叠氮基氨基酸的多肽与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物键联的多肽。在一些实施例中，通过酰胺键将叠氮基或炔基与聚(乙二醇)分子键联。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有介于约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为分枝聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)分枝聚合物的各个分枝具有介于1kDa与100kDa之间或介于约1kDa与约50kDa之间的分子量。在一些实施例中，与多肽键联的水溶性聚合物包含聚亚垸二醇部分。在一些实施例中，并入多肽中的非天然编码的氨基酸残基包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入多肽中的非天然编码的氨基酸残基包含羰基部分且水溶性聚合物包含氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中，并入多肽中的非天然编码的氨基酸残基包含炔部分且水溶性聚合物包含叠氮基部分。在一些实施例中，并入多肽中的非天然编码的氨基酸残基包含叠氮基部分且水溶性聚合物包含炔部分。本发明还提供包含具有经调节的免疫原性的多肽和医药学上可接受的载剂的组合物，所述多肽包含非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，将非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物键联。本文还提供包含编码多肽且包含选择密码子的聚核苷酸的细胞。在一些实施例中，所述细胞包含正交RNA合成酶和/或正交tRNA以将非天然编码的氨基酸取代入多肽中。本发明还提供制备具有经调节的免疫原性的包含非天然编码的氨基酸的多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许表达多肽的条件下，培养包含一个或一个以上编码所述多肽的聚核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞；和从细胞和/或培养基中纯化所述多肽。本发明还提供调节多肽的免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码的氨基酸取代天然存在的多肽中的任一个或一个以上氨基酸和/或将多肽与连接基、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子键联。在一些实施例中，多肽的免疫原性得到增加、降低或被靶向天然多肽的一个或一个以上特定免疫原性部分或表位。本发明另外提供一种激素组合物，其含有通过共价键与至少一个水溶性聚合物键联的生长激素(GH),其中所述共价键为肟键。GH可包括一个或一个以上非天然编码的氨基酸，诸如包括羰基(诸如酮)的非天然编码的氨基酸，诸如为对乙酰基苯丙氨酸的非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，肟键是位于非天然编码的氮基酸与水溶性聚合物之间。可在与美国专利公开案第US2005/0170404号(其以全文引用的方式并入本文中)的SEQIDNO:2的第35位对应的位置处用对乙酰基苯丙氨酸取代GH。在一些实施例中，水溶性聚合物包括一个或一个以上聚乙二醇(PEG)分子。PEG可为线性，例如MW为约0.1到约100kDa，或约1到约60kDa，或约20到约40kDa，或为约30kDa的线性PEG。在一些实施例中，PEG为分枝PEG,例如分子量介于约1与约100kDa之间，或介于约30与约50kDa之间，或为约40kDa的分枝PEG。在一些实施例中，GH是通过多个共价键与多个水溶性聚合物键联，其中至少一个共价键为肟键。在一些所述实施例中，GH为人类生长激素(GH，例如hGH),例如具有与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2具有至少约80%—致性的序列的GH(例如hGH);在一些实施例中，所述序列为美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的序列。在GH(例如hGH)与多个水溶性聚合物键联的一些实施例中，GH包含多个非天然编码的氨基酸。在某些实施例中，本发明提供一种GH组合物，其含有包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的序列的GH(例如hGH)，其中所述GH(例如hGH)经由肟键与30kDa线性PEG键联，且其中所述肟键是与在对应于美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的第35位的位置处取代的对乙酰基苯丙氨酸形成。在其它实施例中，本发明提供一种制备经由肟键与水溶性聚合物键联的具有经调节的免疫原性的多肽的方法，其包含在适于形成肟键的条件下，使包含包括羰基的非天然编码的氨基酸的多肽与PEG氧基胺接触。非天然编码的氨基酸可含有酮基，例如羰基。非天然编码的氨基酸可为对乙酰基苯丙氨酸。在含有对乙酰基苯丙氨酸的一些实施例中，对乙酰基苯丙氨酸是在GH(例如hGH)中与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2中的氨基酸35对应的位置处取代。在一些实施例中，所述PEG氧基胺为单甲氧基PEG(MPEG)氧基胺。在一些实施例中，MPEG氧基胺为线性，例如约20-40kDa或约30kDa的线性MPEG。在一些实施例中，MPEG氧基胺为线性30kDa单甲氧基-PEG-2-氨氧基乙胺氨基甲酸酯盐酸盐。美国专利申请案第11/316,534号(其以全文引用的方式并入本文中)详述此PEG的合成方案。在一些实施例中，通过以下步骤制备包含非天然编码的氨基酸的GH(例如，hGH):向有机体中引入(i)编码多肽的核酸，其中所述核酸已经修饰以提供用于并入非天然编码的氨基酸的选择密码子；和(ii)非天然编码的氨基酸，所述有机体的细胞机器能够响应(i)核酸的选择密码子将非天然编码的氨基酸并入蛋白质中。在一些实施例中，用于形成肟键的反应条件包括在约4到6的pH值下，将MPEG与多肽(包括(但不限于)GH，例如hGH)以约5到10的MPEG:多肽比率混合以产生MPEG-多肽混合物；以及在室温下将MPEG-多肽混合物轻柔搅拌约10到50小时。具有经调节的免疫原性的本发明的多肽可用于多种功用，包括(但不限于)降低或消除免疫原性多肽的免疫原性、作为诱发或刺激免疫原的免疫原性的疫苗、阻断抗体与多肽的结合或治疗自体免疫疾病。图l一展示脂肪酸结合蛋白(FABP)-hGH融合物转基因的示意图。图2—展示经(met)-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)-hGH涂覆。图3—展示经(met)-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)Y35pAF-hGH涂覆。图4—展示经(met)-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经PEG-(met)Y35pAF-hGH涂覆。图5—展示经(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)-hGH涂覆。图6—展示经(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)Y35pAF-hGH涂覆。图7—展示经(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经PEG-(met)Y35pAF-hGH涂覆。图8—展示经PEG-(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)-hGH涂覆。图9一展示经PEG-(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)Y35pAF-hGH涂覆。图10—展示经PEG-(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经PEG-(met)Y35pAF-hGH涂覆。图11—展示经弗氏不完全佐剂(incompleteFreund'sadjuvant)中的(met)-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)-hGH涂覆。图12—展示经弗氏不完全佐剂中的(met)-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)Y35pAF-hGH涂覆。图13—展示经弗氏不完全佐剂中的(met)-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经PEG-(met)Y35pAF-hGH涂覆。图14—展示经弗氏不完全佐剂中的(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)-hGH涂覆。图15—展示经弗氏不完全佐剂中的(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)Y35pAF-hGH涂覆。图16—展示经弗氏不完全佐剂中的(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经PEG-(met)Y35pAF-hGH涂覆。图17—展示经弗氏不完全佐剂中的PEG-(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)-hGH涂覆。图18—展示经弗氏不完全佐剂中的PEG-(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经(met)Y35pAF-hGH涂覆。图19—展示经弗氏不完全佐剂中的PEG-(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠(图A)和转基因小鼠(图B)的抗体反应。平板经PEG-(met)Y35pAF-hGH涂覆。图20—展示小鼠免疫原性数据(抗体滴度)的概要。图21—展示连结的兔血清白蛋白的MALDI-TOF质谱分析。图22—展示DNP(图A)、对乙酰基苯丙氨酸(图B)、Phe(图C)和Tyr(图D)之间兔免疫反应的比较。具体实施例方式定义应了解本发明不限于本文所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂，且因此可变化。还应了解，本文所使用的术语只是出于描述特定实施例的目的，并且不打算限制本发明的范围，其将仅受随附权利要求限制。除非文中另作明确指示，否则如本文和随附权利要求中所使用，单数形式"一"和"所述"包括多个参考物。因此，例如提及一"hGH"是提及一个或一个以上所述蛋白质且包括所属领域技术人员已知的其等效物等。本文所述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽或蛋白质的特定类型、类别或家族。事实上，几乎任何多肽都可经设计或经修饰以包括至少一个非天然编码的氨基酸且如本文所述经另一分子(包括(但不限于)PEG)修饰。仅举例来说，多肽可与选自由以下各物组成的群组的治疗性蛋白质同源a-l抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、载脂蛋白(apolipoprotein)、脱辅基蛋白(apoprotein)、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-IO、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎症蛋白-la、单核细胞炎症蛋白-ip、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原蛋白、群落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体l、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-l、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、促红细胞生成素(EPO)、脱落毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、四螺旋束蛋白、FLT、G-CSF、glp-l、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-a、IFN-(3、IFN-y、任何类干扰素分子或干扰素家族成员、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子(neurturin)、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M(oncostatinM)、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、pleiotropin、蛋白质A、蛋白质G、pth、致热性外毒素A、致热性外毒素B、致热性外毒素C、pyy、松驰素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素(somatomedin)、生长抑素(somatostatin)、生长激素(somatotropin)、链激酶、超抗原(superantigen)、葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxin)、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺肽al、组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子a、肿瘤坏死因子p、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕激素受体、睾丸酮受体、醛固酮受体、LDL受体和皮质酮。因此，出于说明性目的并且仅借助实例提供以下有关生长激素的描述，并且不应理解为限制本文所述的方法、组合物、策略和技术的范围。此外，本申请案中提及hGH多肽时打算使用所述通用术语作为任何多肽的实例。出于说明性目的并且仅借助实例提及hGH中的特定氨基酸位置以供非天然编码的氨基酸取代，并且不应理解为限制本文所述的方法、组合物、策略和技术的范围。因此，应了解本文关于hGH多肽或蛋白质所述的修饰和化学同样可应用于GH超基因家族的任何多肽或任何成员，包括(但不限于)本文中特别列出的多肽或成员。除非另作定义，否则本文所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员通常所了解相同的含义。尽管可将与本文所述的方法、装置和材料类似或相当的任何方法、装置和材料用于本发明的实践或测试中，但现仅对优选方法、装置和材料加以描述。本文所提及的所有公开案和专利都是以引用的方式并入本文中，以达到描述和揭示例如公开案中所述的可与当前所述的发明结合使用的构筑体和方法的目的。本文所讨论的公开案仅提供本申请案申请日期之前的揭示内容。本文在任何方面都不应解释为承认本发明的发明者无权由于现有发明或任何其它原因使所述揭示案的日期提前。术语"实质上纯化"是指可实质上或基本上不含如在天然存在的环境(即，天然细胞，或在重组产生多肽的情况下的宿主细胞)中所见的通常伴随蛋白质或与蛋白质相互作用的组分的多肽。可实质上无细胞材料的多肽包括具有小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%或小于约1%(以干重计)污染蛋白质的蛋白质制剂。当通过宿主细胞重组产生多J太或其变体时，蛋白质可以占细胞干重约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%或更低的量存在。当通过宿主细胞重组产生多肽或其变体时，蛋白质可以占细胞干重约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更低量存在于培养基中。因此，如通过诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳等适当方法所测定，通过本发明的方法产生的"实质上纯化"的多肽可具有至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%的纯度水平，尤其至少约75%、80%、85%的纯度水平且更尤其至少约90%的纯度水平、至少约95%的纯度水平、至少约99%或更高的纯度水平。"重组宿主细胞"或"宿主细胞"是指不管用于插入的方法如何(例如，直接摄取、转导、f配对或所属领域已知的用于产生重组宿主细胞的其它方法)，包括外源聚核苷酸的细胞。外源聚核苷酸可以非整合载体(例如质粒)的形式保持，或者可将其整合到宿主基因组中。如本文所使用，术语"培养基"包括任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物，其可支撑或容纳任何宿主细胞，包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核生物宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核生物宿主细胞、大肠杆菌(￡.co//)或假单胞菌(尸w"^momw)宿主细胞和细胞内容物。因此，所述术语可涵盖已生长宿主细胞的培养基，例如已分泌多肽的培养基，包括增殖步骤之前或之后的培养基。所述术语还可涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂，诸如在多肽是于细胞内产生并且宿主细胞经溶解或破裂以释放多肽的情况下。如本文关于蛋白质再折叠所使用，"还原剂"定义为使巯基保持还原态且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或材料。适当还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和经还原谷胱甘肽。所属领域技术人员易于了解，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。如本文关于蛋白质再折叠所使用，"氧化剂"定义为能够从经氧化的化合物中移除电子的任何化合物或材料。适当氧化剂包括(但不限于)经氧化谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、经氧化二硫苏糖醇、经氧化赤藓醇和氧。所属领域技术人员易于了解，多种氧化剂适用于本发明的方法中。如本文所使用，"变性剂"定义为将引起蛋白质可逆展开的任何化合物或材料。变性剂的强度将由特定变性剂的特性和浓度决定。适当变性剂可为离液剂、清洁剂、有机溶剂、可与水混溶的溶剂、磷脂或者两种或两种以上所述试剂的组合。适当离液剂包括(但不限于)脲、胍和硫代氰酸钠。有用的清洁剂可包括(但不限于)强清洁剂(诸如十二垸基硫酸钠或聚氧乙烯醚)(例如，Tween或Triton清洁剂)、月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)、温和的非离子清洁剂(例如，毛地黄皂苷)、温和的阳离子清洁剂(诸如，N》2,3-(二油酰基氧基)-丙基-N,N,N-三甲基铵)、温和的离子清洁剂(例如，胆酸钠或去氧胆酸钠)或两性离子清洁剂(包括(但不限于)硫代甜菜碱(两性离子清洁剂(Zwittergent))、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基-l-丙烷硫酸盐(CHAPS)和3-(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基-2-羟基-l-丙垸磺酸盐(CHAPSO))。可与水混溶的有机溶剂(诸如乙腈、低碳垸醇(尤其C2-C4烷醇，诸如乙醇或异丙醇)或低碳烷二醇(尤其C2-C4烷二醇，诸如乙二醇)可用作变性剂。可用于本发明中的磷脂可为天然存在的磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变体，诸如二己酰磷脂酰胆碱或二庚酰磷脂酰胆碱。如本文所使用，"再折叠"描述关于二硫键将含有二硫键的多肽从未适当折叠或展开状态转化成天然或适当折叠的构象的任何过程、反应或方法。如本文所使用，"共折叠"是指使用至少两个多肽的再折叠过程、反应或方法，所述多肽彼此相互作用并且导致展开或不恰当折叠的多肽转化成天然、经适当折叠的多肽。如本文所使用，"生长激素"或"GH"应包括具有来自任何哺乳动物物种(包括(但不限于)人类(hGH)、牛(bGH)、猪)和其它家畜或农场动物(包括(但不限于)鸡)的生长激素的至少一种生物活性的多肽和蛋白质，以及GH类似物、GH同功异型物、GH模拟物、GH片段、杂交GH蛋白、其融合蛋白、寡聚体和多聚体、同源物、糖基化模式变体、变体、剪接变体和突变蛋白，不管是否具有相同生物活性且也不管其合成或制造方法如何，所述合成或制造方法包括(但不限于)重组方法(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式的核酸制造)、活体外方法、活体内方法、通过显微注射核酸分子的方法、合成法、转基因法和基因活化方法。类似地，术语"多肽"包括所述的这些形式。术语"多肽"涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的多肽。hGH的例示性取代例如包括天然hGH的第41位赖氨酸或第176位苯丙氨酸的取代。在一些情况下，如果取代在第41位，那么取代可为异亮氨酸或精氨酸残基；或者如果在第176位，那么取代可为酪氨酸残基。第F10位可例如经A、H或I取代。第M14位可例如经W、Q或G取代。其它例示性取代包括任何取代或其组合，包括(但不限于)R167N、D171S、E174S、F176Y、I179T;R167E、D171S、E174S、F176Y;F10A、M14W、H18D、H21N;F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171S、E174S、F176Y、I179T;F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171A、E174S、F176Y、I179T;F10H、M14G、H腦、H21N;F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171A、T175T、I179T;或FIOI、M14Q、H18E、R167N、D171S、U79T。例如参看美国专利第6,143,523号，其以引用的方式并入本文中。已描述天然存在的多肽中多个氨基酸位置中的例示性取代，包括增加激动剂活性、增加蛋白酶抗性、将多肽转化成拮抗剂等的取代，且所述取代都涵盖于术语"多肽"中。激动剂GH(例如hGH)序列例如包括包含以下修饰的天然存在的hGH序列H18D、H21N、R167N、D171S、E174S、1179T。例如参看美国专利第5,849,535号，其以引用的方式并入本文中。其它激动剂hGH序列包括H18D、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174S;H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174S;或H18D、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A。例如参看美国专利6,022,711，其以引用的方式并入本文中。包含取代H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A的hGH多肽增强位点I处对hGH受体的亲和力。例如参看美国专利5,854,026，其以引用的方式并入本文中。对蛋白酶具有增加的抗性的hGH序列包括(但不限于)在C-D环内包含一个或一个以上氨基酸取代的hGH多肽。在一些实施例中，取代包括(但不限于)R134D、T135P、K140A和其任何组合。例如参看Alam等人，(1998)/5/o&c/mo/65:183-190。人类生长激素拮抗剂例如包括在G120处具有取代(例如G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)且有时另外包括以下取代H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A的拮抗剂。例如参看美国专利第6,004,931号，其以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，hGH拮抗剂在106-108或127-129区域内包含至少一个导致GH充当拮抗剂的取代。例如参看美国专利第6,608,183号，其以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，hGH拮抗剂包含与水溶性聚合物键联的非天然编码的氨基酸，其存在于hGH分子的位点II结合区内。在一些实施例中，hGH多肽另外包含以下取代H18D、H21N、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S、I179T以及G120处的取代。(例如参看美国专利5,849,535)关于完整的天然存在的全长人类GH氨基酸序列以及成熟的天然存在的GH氨基酸序列和天然存在的突变体，在本文中分别参看美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3。在一些实施例中，本发明的GH多肽(例如hGH多肽)与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或者生长激素多肽的任何其它序列实质上一致。举例来说，在一些实施例中，本发明的GH多肽(例如，hGH多肽)与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或者生长激素多肽的任何其它序列至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约卯％、至少约95%或至少约99%—致。在一些实施例中，本发明的GH多肽(例如，hGH多肽)与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85°/。、至少约卯％、至少约95%或至少约99%—致。已鉴别出多种天然存在的hGH突变体。这些突变体包括hGH-V(Seeburg,i)A^41:239(1982);美国专利第4,446,235号、第4,670,393号和第4,665,180号，其以引用的方式并入本文中)和hGH的第32-46残基缺失的20kDahGH(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:3)(Kostyo等人，5z'oc/ze附.丑!op一.勿a925:314(1987);Lewis,U.等人,J.5zo/.C/ze附"253:2679-2687(1978))。在Igout,A.等人，Wwd"'c^c/Ai仏17(10):3998(1989)中描述胎盘生长激素。此外，已报导由转录后加工、翻译后加工、分泌加工、代谢加工和其它生理过程产生的多种hGH变体，包括经蛋白水解裂解的变体或2链变体(Baumann,G，五w/ocr/"e及ev/ews12:424(1991))。在Lewis,U.J.等人,/C/ze/n,252:3697-3702(1977);Brostedt,R和Roos,P"iVep.所oc&肌19:217-229(1989)中描述经由Cys-Cys二硫键直接键联的hGH二聚体。编码hGH突变体和突变体hGH多肽的核酸分子已众所周知，且包括(但不限于)美国专利第5,534,617号、第5,580,723号、第5,688,666号、第5,750,373号、第5,834,250号、第5,834,598号、第5,849,535号、第5,854,026号、第5,962,411号、第5,955,346号、第6,013,478号、第6,022,711号、第6,136,563号、第6,143,523号、第6,428,954号、第6,451,561号、第6,780,613号和美国专利申请公开案2003/0153003中所述者，所述专利都以引用的方式并入本文中。类似地，术语"多肽"包括上文所提及的已知多肽的等效物。市售hGH制剂是以以下名称销售Humatrope(EliLilly&Co.)、Nutropin(Genentech)、Norditropin(Novo-Nordisk)、Genotropin(Pfizer)和Saizen/Serostim(Serono)。术语"多肽"还包括天然存在的多肽的医药学上可接受的盐和前药和所述盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂合物、生物活性片段、生物活性变体和立体异构体，以及天然存在的多肽的激动剂、模拟物和拮抗剂变体和其多肽融合物。术语"多肽"也涵盖在氨基末端、羧基末端或两端包含其它氨基酸的融合物。例示性融合物包括(但不限于)例如甲硫氨酰基多肽，包括(但不限于)因多肽的重组表达而使甲硫胺酸与多肽的N末端键联的生长激素；用于纯化目的的融合物(包括(但不限于)聚组氨酸或亲和性表位)；具有血清白蛋白结合肽的融合物；和具有血清蛋白(诸如血清白蛋白)的融合物。美国专利第5,750,373号(以引用的方式并入本文中)描述一种用于选择新颖蛋白质(诸如生长激素和对于个别受体分子具有已改变的结合特性的抗体片段变体)的方法。所述方法包含将编码所关注蛋白质的基因与丝状噬菌体M13的基因III外壳蛋白的羧基末端区域融合。多个参考文献都揭示通过聚合物连结或糖基化来修饰多肽。术语"多肽"包括与诸如PEG等聚合物连结的多肽，且可包含半胱氨酸、赖氨酸或其它残基的一种或一种以上额外衍生作用。此外，多肽可包含连接基或聚合物，其中与所述连接基或聚合物连结的氨基酸可为根据本发明的非天然氨基酸；或可利用所属领域中已知的技术(诸如与赖氨酸或半胱氨酸偶合)使多肽与天然编码的氨基酸连结。已报导多肽(包括(但不限于)hGH)的聚合物连结。例如参看美国专利第5,849,535号、第6,136,563号和第6,608,183号，所述专利以引用的方式并入本文中。美国专利第4，卯4,584号揭示耗尽聚乙二醇化赖氨酸的多肽，其中至少一个赖氨酸残基已缺失或经任何其它氨基酸残基置换。WO99/67291揭示一种使蛋白质与PEG连结的方法，其中所述蛋白质上至少一个氨基酸残基已缺失，并且所述蛋白质是在足以实现与所述蛋白质的连结的条件下与PEG接触。WO99/03887揭示属于生长激素超家族的聚乙二醇化多肽变体，其中已经用半胱氨酸残基取代位于所述多肽指定区域中的非必需氨基酸残基。WO00/26354揭示一种产生具有降低的过敏原性的糖基化多肽变体的方法，与相应的母体多肽相比，所述多肽变体包含至少一个额外的糖基化位点。美国专利第5,218,092号(其以引用的方式并入本文中)揭示对粒细胞群落刺激因子(G-CSF)和其它多肽进行修饰从而当与天然多肽相比时引入至少一个额外的碳水化合物链。术语"多肽"还包括糖基化多肽，以及(但不限于)在任何氨基酸位置处经糖基化的多肽、N键联或O键联糖基化形式的多肽。也可将含有单一核苷酸改变的变体看作多肽的生物活性变体。此外，还包括剪接变体。术语"多肽"还包括通过化学方式键联或以融合蛋白形式表达的任一种或一种以上多肽或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接基、配体或任何类型的其它生物活性分子的多肽杂二聚体、均二聚体、杂多聚体或均多聚体，以及例如含有特定缺失或其它修饰但仍保持生物活性的多肽类似物。除非另作明确说明(即，当声明比较是基于美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:1、美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:3或其它hGH序列时)，否则有关本文所述的GH(例如hGH)中氨基酸位置的所有相关内容都是基于美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2中的位置。所属领域技术人员将了解，与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:1、2、3或任何其它GH序列中的位置对应的氨基酸位置可易于在例如GH或hGH融合物、变体、片段等任何其它GH(例如hGH)分子中鉴别。举例来说，可使用诸如BLAST等序列比对程序比对并鉴别蛋白质中与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:1、2或3或者其它GH序列中的位置对应的特定位置。预期本文关于美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:1、2或3或者其它GH序列所述的氨基酸取代、缺失或添加还指在本文所述或所属领域已知的GH或hGH融合物、变体、片段等中的相应位置处的取代、缺失或添加，且都明显地涵盖于本发明中。术语"多肽"涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的多肽。本发明的多肽可包含一个或一个以上天然氨基酸的修饰与一个或一个以上非天然氨基酸修饰的组合。已对天然存在的多肽中多个氨基酸位置中的例示性取代进行描述，包括(但不限于)调节多肽的一种或一种以上生物活性的取代，诸如(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、降低蛋白酶敏感性、将多肽转化成拮抗剂等，且所述例示性取代都涵盖于术语"多肽"中。人类GH拮抗剂包括(但不限于)在第1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127位具有取代或在第1位(gp，N末端)具有添加或其任何组合(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDN0:2，或美国专利公开案第US2005/0170404号SEQIDNO:l或3中的相应氨基酸或者任何其它GH序列)的拮抗剂。在一些实施例中，hGH拮抗剂在区域1-5(N末端)、6-33(A螺旋)、34-74(介于A螺旋与B螺旋之间的区域，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(介于B螺旋与C螺旋之间的区域，B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(介于C螺旋与D螺旋之间的区域，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C末端)中包含至少一个导致GH充当拮抗剂的取代。在其它实施例中，并入非天然编码的氨基酸的例示性位点包括在A螺旋的氨基末端区域和一部分C螺旋内的残基。在另一实施例中，用诸如对叠氮基-L-苯丙氮酸或O-炔丙基-L-酪氨酸等非天然编码的氨基酸取代G120。在其它实施例中，将上文所列的取代与使hGH多肽成为hGH拮抗剂的其它取代组合。举例来说，在本文所鉴别的一个位置处取代非天然编码的氨基酸且同时在G120处引入取代(例如，G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)。在一些实施例中，hGH拮抗剂包含与水溶性聚合物键联的非天然编码的氨基酸，其存在于hGH分子的受体结合区内。在一些实施例中，多肽另外包含调节多肽生物活性的添加、取代或缺失。举例来说，所述添加、取代或缺失可调节多肽的一种或一种以上特性或活性。举例来说，所述添加、取代或缺失可调节对多肽受体或结合搭配物的亲和性、调节(包括(但不限于)增加或降低)受体二聚化、使受体二聚体稳定、调节结合搭配物的构象或者一种或一种以上生物活性、调节循环半衰期、调节治疗半衰期、调节多肽稳定性、调节蛋白酶所造成的裂解、调节剂量、调节释放或生物可用性、便利纯化或者改进或改变特定投药途径。类似地，多肽可包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或聚组氨酸)或其它基于亲和性的序列(包括(但不限于)FLAG、聚组氨酸、GST等)或键联分子(包括(但不限于)生物素)，其改进多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它特征。术语"多肽"还涵盖均二聚体、杂二聚体、均多聚体和杂多聚体，其与相同或不同的非天然编码的氨基酸侧链、天然编码的氨基酸侧链键联，包括(但不限于)经由非天然编码的氨基酸侧链直接键联或经由连接基间接键联。例示性连接基包括(但不限于)小有机化合物；各种长度的水溶性聚合物，诸如聚(乙二醇)或葡聚糖；或各种长度的多肽。"非天然编码的氯基酸"是指不为20种常见氨基酸中的任一种或吡咯赖氨酸或硒半胱氨酸的氨基酸。可以与术语"非天然编码的氨基酸"同义使用的其它术语为"非天然氨基酸("non-naturalaminoacid"、"unnaturalaminoacid，，)"、"非天然存在的氨基酸"和其各种以连字符连接和不以连字符连接的型式。术语"非天然编码的氨基酸"还包括(但不限于)通过对天然编码的氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸)进行修饰(例如，翻译后修饰)而产生但其本身未通过翻译复合物天然并入到生长的多肽链中的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。"氨基末端修饰基团"是指可与多肽的氨基末端连接的任何分子。类似地，"羧基末端修饰基团"是指可与多肽的羧基末端连接的任何分子。末端修饰基团包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(诸如血清白蛋白)或增加肽的血清半衰期的其它部分。所属领域中和本文中使用术语"官能团"、"活性部分"、"活化基团"、"离去基团"、"反应性位点"、"化学反应性基团"和"化学反应性部分"是指分子中截然不同的可定义的部分或单元。所述术语在某种程度上与化学技术中的含义同义，且在本文中用于表明分子中执行某种功能或活性并可与其它分子反应的部分。本文中使用术语"键"或"连接基"是指通常由化学反应形成且通常为共价键的基团或键结。水解稳定的键意思是指所述键在水中实质上稳定并且在有用pH值下(包括(但不限于)在生理学条件下)一段较长时间内(可能甚至无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解的键意思是所述键可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解的键意思是所述键可通过一种或一种以上酶降解。如所属领域中所了解，PEG和相关聚合物可在聚合物主链中或聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基团中包括可降解键。举例来说，由PEG羧酸或活性PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键一般在生理学条件下水解以释放所述试剂。其它水解可降解键包括(但不限于)碳酸酯键；由胺与醛反应产生的亚胺键；通过醇与磷酸基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸酯与醇的反应产物的原酸酯键；由(包括(但不限于))聚合物(诸如PEG)末端的胺基与肽的羧基形成的肽键；和由(包括(但不限于))聚合物末端的亚磷酰胺(phosphoramidite)基与寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。术语"生物活性分子"、"生物活性部分"或"生物活性剂"当用于本文中时意思是指可影响涉及有机体(包括(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转座子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类)的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或化学特性的任何物质。具体来说，如本文所使用，生物活性分子包括(但不限于)预期用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病或者以其它方式增强人类或动物的身体或精神健康状况的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、疫苗、免疫原、硬药(harddrug)、软药(softdrug)、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡聚核苷酸、类毒素、毒素、原核和真核细胞、病毒、多糖、核酸和其得自或来源于病毒、细菌、昆虫、动物或任何其它细胞或细胞类型的部分、脂质体、微粒和胶束。适用于本发明的生物活性剂的类别包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管药、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇药、微生物来源的毒素等。"双官能聚合物"是指包含两个独立官能团的聚合物，所述官能团能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键。可使用一个官能团可与特定生物活性组份上的基团反应且另一基团可与第二生物组份上的基团反应的双官能连接基形成连结物，其包括第一生物活性组份、双官能连接基和第二生物活性组份。已知许多将各种化合物与肽连接在一起的程序和连接基分子。例如参看欧洲专利申请案第188,256号、美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号和第4,569,789号，所述专利以引用的方式并入本文中。"多官能聚合物"是指包含两个或两个以上独立官能团的聚合物，所述官能团能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可具有任何所需长度或分子量，且可经选择以于一个或一个以上与所述分子键联的分子之间提供特定所需间隔或构象。当通过从左向右书写的常规化学式说明取代基时，其同样涵盖由从右向左书写结构所得到的在化学上相同的取代基，例如，结构-CH20-与结构-OCH2-相同。术语"取代基"包括(但不限于)"非干扰性取代基"。"非干扰性取代基"为得到稳定化合物的基团。适当的非干扰性取代基或基团包括(但不限于)卤基、d-Cu)烷基、C2-Ck)稀基、C2-C10块基、Ci-Cio院氧基、Ci-Ci2芳院基、Ci-Ci2院芳基、C3-C12环院基、C3-d2环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-d2烷氧基烷基、C2-d2烷氧基芳基、C7-d2芳氧基垸基、CVd2氧基芳基、d-C6烷基亚磺酰基、Q-Cu)垸基磺酰基、-(<:112)1-0-((:1-(:1()烷基)(其中m为i到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基垸基、-N02、-CN、-NRC(O)-(d-do垸基)、-C(O)-(d-do垸基)、CVCK)垸基硫烷基、-C(O)O-(C广do垸基)、-OH、-S02、=S、隱COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C广do垸基)-CF3、-C(0)-CF3、-C(0)NR2、陽(C广do芳基)-S-(Q-do芳基)、-C(O)-(Q-do芳基)、-(<^2)1墨0-(<:112)1-0-((:1-(:10烷基)(其中各m为1到8)、-C(0)NR2、-C(S)NR2、-S02NR2、-NRC(0)NR2、-NRC(S)NR2、其盐等。如本文所使用，各R为H、垸基或经取代垸基、芳基或经取代芳基、芳垸基或垸芳基。术语"卤素"包括氟、氯、碘和溴。除非另作说明，否则术语"垸基"本身或作为另一取代基的部分时意思是指具有指定碳原子数量(即，Ci-do意思是1到IO个碳)的直链或支链或环状烃基或其组合，其可为完全饱和、单或多不饱和的并且可包括二价和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)诸如以下基团甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构物等。不饱和垸基是具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和垸基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(l,4-戊二烯基)、乙炔基、l-和3-丙炔基、3-丁炔基和高级同系物和异构物。除非另作说明，否则术语"垸基"还打算包括下文更为详细地定义的垸基衍生物，诸如"杂垸基"。局限于烃基的烷基称为"同系垸基(homoalkyl)"。术语"亚烷基"本身或作为另一取代基的部分时意思是指衍生自烷烃的二价基团，例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，且另外包括下文描述为"亚杂垸基"的基团。通常，垸基(或亚垸基)将具有1到24个碳原子，其中具有10个或更少碳原子的基团为本文所述方法和组合物的特定实施例。"低碳垸基"或"低碳亚垸基"为通常具有8个或更少碳原子的链较短的烷基或亚烷基。术语"烷氧基"、"烷基氨基"和"垸硫基"(或硫垸氧基)是以其常规含义使用，并且分别是指经由氧原子、氨基或硫原子与分子剩余部分连接的烷基。除非另作说明，否则术语"杂垸基"本身或与另一术语组合时是指稳定直链或支链或环状烃基或其组合，其是由指定数量的碳原子和至少一个选自由O、N、Si和S组的群组的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷基的任何内部位置处或烷基与分子剩余部分连接的位置处。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-OCH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(0)-CH3、-CH2-CH2-S(0)2-CH3、-CH=CH-0-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3和-CH-CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可为连续的，诸如-CH2-NH-OCH3和-CH2-0-Si(CH3)3。类似地，术语"亚杂烷基"本身或作为另一取代基的部分时是指衍生自杂烷基的二价基团，例如(但不限于)-12-012-3-(:1^-(^2-和-(:112-5-(:112-(:112-]^1-(:112-。对于亚杂烷基来说，相同或不同杂原子也可占据任一个或两个链末端(包括(但不限于)亚垸基氧基、亚垸基二氧基、亚垸基氨基、亚垸基二氨基、氨氧基亚垸基等)。另外，对于亚烷基和亚杂垸基键联基团来说，键联基团的化学式所书写的方向并不表示键联基团的定向。举例来说，式-(3(0)211'-表示-C(0)2R'-和-R'C(0)2-。除非另作说明，否则术语"环垸基"和"杂环垸基"本身或与其它术语组合时分别表示"垸基"和"杂垸基"的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基可包括饱和、部分不饱和和完全不饱和的环键。此外，对于杂环烷基来说，杂原子可占据杂环与分子剩余部分连接的位置。环垸基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、l-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环垸基的实例包括(但不限于)l-(l,2,5,6-四氢吡啶基)、l-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、l-哌嗪基、2-哌嗪基等。此外，所述术语涵盖双环和三环结构。类似地，术语"亚杂环烷基"本身或作为另一取代基的部分时意思是指衍生自杂环烷基的二价基团，并且术语"亚环垸基"本身或作为另一取代基的部分时意思是指衍生自环垸基的二价基团。如本文所使用，术语"水溶性聚合物"是指可溶于水性溶剂的任何聚合物。水溶性聚合物与多肽键联可导致改变，包括(但不限于)相对于未经修饰的形式，血清半衰期增加或经调节或者治疗半衰期增加或经调节；免疫原性经调节；物理缔合特征(诸如聚集和多聚体形成)经调节；受体结合改变；与一个或一个以上结合搭配物的结合改变；和受体二聚化或多聚化改变。水溶性聚合物可具有或可不具有其自身的生物活性，且可用作将多肽与其它物质(包括(但不限于)一个或一个以上多肽或者一个或一个以上生物活性分子)连接的连接基。合适聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单d-do垸氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，其以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚环氧丙垸/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚亚垸二醇和其衍生物、聚亚烷二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙基醚和a-P-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。如本文所使用，术语"聚亚烷二醇"或"聚(亚垸二醇)"是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语"聚亚烷二醇"和/或"聚乙二醇"涵盖线性与分枝聚合物且平均分子量介于O.lkDa与100kDa之间。其它例示性实施例列于例如商业供应商目录中，诸如ShearwaterCorporation的目录"PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedicalApplications"(2001)。除非另作说明，否则术语"芳基"意思是指可为单一环或者稠合在一起或共价键联的多个环(包括(但不限于)1到3个环)的多不饱和、芳香烃取代基。术语"杂芳基"是指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)；其中氮和硫原子视情况经氧化且氮原子视情况经季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的剩余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、l-萘基、2-萘基、4-联苯基、l-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪哇基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、l-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中每一者的取代基选自下文所述的可接受取代基的群组。为简洁起见，术语"芳基"当与其它术语(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)组合使用时包括如上文所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语"芳基烷基"意欲包括芳基与烷基连接的基团(包括(但不限于)苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已经氧原子置换的垸基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(l-萘氧基)丙基等)。上述术语(包括(但不限于)"垸基"、"杂垸基"、"芳基"和"杂芳基")中的每一个意欲包括所述基团的经取代和未经取代的形式。各类基团的例示性取代基提供于下文中。垸基和杂垸基(包括通常称为亚垸基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可为选自(但不限于)以下各基团的多个基团中的一个或一个以上基团-OR'、=0、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-C02R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(0)2R'、-NR-C(NR'R"R"')=NR""、-NR-C(NR'R")=NR"'、-S(O)R'、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-NRS02R'、-CN和-N02，其数量在0到(2m'+l)的范围内，其中m'为所述基团中碳原子的总数。R'、R"、R'"和R""各自独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的垸基、垸氧基或硫烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包括一个以上r基团时，例如，各r基团是如当存在一个以上这些基团时各r'、r"、r'"和r""基团一样独立地选择。当r'与r"连接到相同氮原子时，其可与氮原子组合形成5、6或7元环。举例来说，-nr'r"意欲包括(但不限于)1-吡咯垸基和4-吗啉基。从上述有关取代基的论述，所属领域技术人员将了解，术语"垸基"意欲包括包含与除氢基外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤垸基(包括(但不限于)-cf3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-c(o)ch3、-c(o)cf3、-(:(0)<:820013等)。与关于烷基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基可变化且选自(但不限于):卣素、-OR'、=0、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-c02r'、-conr'r"、-oc(o)nr'r"、-nr"c(o)r'、-nr'-c(o)nr"r'"、-nr"c(0)2r'、-nr-c(nr'r"r'")=nr""、-nr-c(nr'r")=nr'"、-s(o)r'、-s(0)2r'、-s(0)2nr'r"、-nrs02r'、-CN和-NCb、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(d-C4)烷氧基和氟(d-C4)垸基，其数量在0到芳香族环系统上开放价态的总数的范围内；且其中r'、r"、r'"和r""独立地选自氢、垸基、杂烷基、芳基和杂芳基。当本发明的化合物包括一个以上r基团时，例如，各r基团是如当存在一个以上这些基团时各r'、r"、r"'和r""基团一样独立地选择。如本文所使用，术语"经调节的血清半衰期"是指经修饰多肽的循环半衰期相对于其未经修饰形式的正或负改变。血清半衰期是通过在投与多肽后于各个时间点时取得血液样本且测定各样本中所述分子的浓度来进行测量。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。血清半衰期合意地增加至少约两倍，但较小的增加可能也有用，例如在其促成令人满意的给药方案或避免有毒作用的情况下。在一些实施例中，所述增加为至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。如本文所使用，术语"经调节的治疗半衰期"意思是治疗有效量的经修饰多肽的半衰期相对于其未经修饰形式的正或负改变。治疗半衰期是通过测量投药后各个时间点时分子的药物动力学和/或药效特性来测量。增加的治疗半衰期能够合意地促成特别有益的给药方案、特别有益的总剂量或者避免不合需要的作用。在一些实施例中，治疗半衰期增加是由效力增加、经修饰分子与其靶的结合增加或减少、酶(诸如蛋白酶)所引起的分子分解的增加或减少或未经修饰分子的另一参数或作用机制的增加或减少而引起。术语"免疫原性"意思是蛋白质引起免疫反应的能力，所述反应包括(但不限于)产生中和及非中和抗体、形成免疫复合物、补体活化、肥大细胞活化、炎症和过敏性反应。免疫反应可为体液型(b淋巴细胞分泌抗体)、细胞介导型(t淋巴细胞)或二者皆有。术语"免疫原性"还涵盖过敏原性。过敏原性是定义为在免疫或暴露于物质后所述物质引起IgE免疫反应的能力。过敏原为诱发过敏的过敏状态并刺激在一些个体体内形成抗体的物质。过敏原可为天然存在的或为合成来源，且包括(但不限于)花粉、昆虫残骸、食物、血清、霉菌孢子、粉尘、动物鳞屑和药物。如本文所使用，术语"经调节的免疫原性"意思是当与野生型蛋白相比较时，活化免疫系统(无论是体液型或细胞介导型)的能力的正或负改变。举例来说，如果变体蛋白以比野生型多肽高或低的滴度或者在比野生型多肽多或少的个体体内产生中和和/或非中和抗体，或不产生中和和/或非中和抗体，那么可称所述变体蛋白具有"经调节的免疫原性"。中和抗体和/或非中和抗体的量可增加或减少。如果野生型多肽在一定百分比的个体体内产生免疫反应，那么具有降低的免疫原性的变体例如将在较低百分比的个体体内或不在个体体内产生免疫反应。举例来说，如果变体蛋白展现与一个或一个以上MHC等位基因结合的降低，或者如果相对于野生型蛋白，其在降低比例的个体体内诱导T细胞活化，那么也可称所述变体蛋白具有降低的免疫原性。在不限于任何特定作用机制的情况下，抗原摄取、T细胞结合或抗体结合可能受到增加或降低蛋白质免疫原性的修饰的影响。当用于核酸或蛋白质时，术语"经分离"表示所述核酸或蛋白质不含与其天然状态缔合的细胞组份中的至少某些，或已将所述核酸或蛋白质浓縮到大于其在活体内或活体外产生时的浓度的程度。其可为均质态。经分离的物质可为干燥或半干燥状态；或在溶液中，包括(但不限于)水溶液。其可为包含其它医药学上可接受的载剂和/或赋形剂的医药组合物的组份。纯度和均质性通常是使用分析化学技术(诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱)测定。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质实质上经纯化。具体说来，使经分离基因与侧接到所述基因且编码除所关注基因外的蛋白质的开放式阅读框分离。术语"经纯化"表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中实质上产生一条谱带。具体说来，其可能意味所述核酸或蛋白质为至少85%纯、至少90%纯、至少95%纯、至少99%纯或更高纯度。术语"核酸"是指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其聚合物。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合特性且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另作明确限制，否则所述术语还指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽基核酸(peptidonucleicacid))、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另作说明，否则特定核酸序列还含蓄地涵盖其保守修饰变体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体来说，可通过产生一个或一个以上所选(或所有)密码子的第三位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，iVwc/"cf"仏19:5081(1991);Ohtsuka等人，淑.C/ze/w.260:2605-2608(1985);Rossolini等人，Mo/.Ce〃.Pro6es8:91-98(1994))。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用以指代氨基酸残基聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述，并且针对肽的描述和蛋白质的描述也适用于多肽的描述。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基是通过共价肽键键联。术语"氨基酸"是指天然存在和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构的化合物，例如a碳与氢、羧基、氨基和R基团结合，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但仍保持与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸可在本文中以其通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(BiochemicalNomenclatureCommission)所推荐的单字母符号提及。同样，核苷酸可通过其通常接受的单字母代码提及。"保守修饰变体"适用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列来说，"保守修饰变体"是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸将编码任何指定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每一位置处，密码子可在不改变所编码多肽的情况下变成任何相应的密码子。所述核酸变异为"沉默变异(silentvariation)",其为保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的各核酸序列也描述核酸的每一可能的沉默变异。所属领域技术人员将认识到，核酸中的每一密码子(通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG除外)可经修饰以得到功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一沉默变异是每一所述序列中所固有的。对于氨基酸序列来说，所属领域技术人员将认识到，改变、添加或缺失单一氨基酸或编码序列中小百分比的氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为"保守修饰变异"，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或者化学上类似的氨基酸对氨基酸的取代。所属领域技术人员已知提供功能类似的氨基酸的保守取代表。所述保守修饰变体除为多形态变体外且不排除多形态变体，还为本发明的种间同系物和等位基因。所属领域技术人员已知提供功能相似的氨基酸的保守取代表。以下八个群组各自含有彼此互为保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)，(例如参看Creighton，户rato'"5v&rwc^ejMoZecw/orJVo/er"'es(WHFreeman&Co.;第2版U993年12月))。在两个或两个以上核酸或多肽序列的情况中，术语"一致"或"一致性"百分比是指两个或两个以上序列或子序列相同。当在比较窗或指定区域上比较和比对最大相应性时，如使用以下序列比较算法(或所属领域技术人员可用的其它算法)或通过手工比对和目测中的一种所测量，如果各序列具有一定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域内约60%—致、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约卯％、约95%或约99%—致)，那么所述序列"实质上一致"。此定义也是指测试序列的互补性。一致性可存在于至少约50个氨基酸或核苷酸长的区域，或约75-100个氨基酸或核苷酸长的区域，或(未指定时)聚核苷酸或多肽的整个序列内。对于序列比较来说，通常一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机内，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或者可指定替代参数。随后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。如本文所使用，"比较窗"包括提及具有选自由20到600、通常约50到约200、更通常约100到约150组成的群组的邻接位置数量中的任一者的区段，其中在最佳比对两个序列后，可将序列与具有相同数量的邻接位置的参考序列相比较。所属领域技术人员已知供比较的序列比对方法。可通过(包括(但不限于))Smith和Waterman(1970)A/v.j/^/.Ma仇2:482c的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)/Mo/.祝o/.48:443的同源性比对算法；Pearson和Lipman(1988)WW/.Scz'.85:2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI);或者人工比对和目领(J(例如参看Ausubel等人，Cwre"f/Vo/ocoAy/"Mo/ecw/w所o/ogy(1995增补版))来进行供比较的序列的最佳比对。适用于测定序列一致性和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1997)M/c.Jcf^si"25:3389-3402和Altschul等人(1990)/Mo/.5/o/.215:403-410中。进行BLAST分析的软件可通过万维网ncbi.nlm.nih.gov可见的美国生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公共可用。BLAST算法参数W、T及X决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用如下默认参数字长(W)为11，期望值(E)为10，M=5，N^4并比较两条链。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用如下默认参数字长为3且期望值(E)为10，和BLOSUM62计分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1992)iVoc.A^/，JcadSc/.89:10915)，比对值(B)为50，期望值(E)为10，M=5，N=-4以及比较两条链。在进行BLAST算法时通常关闭"低复杂度"筛选程序。BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(例如参看Karlin和Altschul(1993)/Voc.TVa".Jc"cZ.Sc/.t/&490:5873-5787)。BLAST算法所提供的一种相似性测量法为最小总和概率(P(N))，其提供对两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。举例来说，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率可小于约0.2或小于约0.01或小于约0.001，那么认为核酸与参考序列类似。短语"与...选择性(或特异性)杂交"是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(包括(但不限于)全细胞或文库DNA或RNA)中时，分子只与所述序列在严格杂交条件下结合、形成双链体或杂交。短语"严格杂交条件"是指DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列在所属领域已知的低离子强度和高温条件下杂交。通常，在严格条件下，探针将与其在核酸的复杂混合物(包括(但不限于)全细胞或文库DNA或RNA)中的靶序列杂交，但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件为序列依赖性的并且将随不同环境而不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的广泛指导见于Tijssen，ZVo6ej,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)中。通常，将严格条件选择为在指定离子强度和pH值下比特定序列的热熔点(Tm)低约5-l(TC。Tm为平衡时50n/。与靶互补的探针与靶序列杂交的温度(在指定离子强度、pH值和核酸浓度下)(当靶序列过量存在时，在Tm下，平衡时50%探针被占据)。严格条件可为在pH7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子、通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)为至少约30'C且对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)为至少约6(TC的条件。严格条件也可通过加入去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号可为背景杂交的至少两倍，视情况为背景杂交的10倍。例示性严格杂交条件可如下50%甲酰胺、5xSSC和1°/。SDS，在42。C下培育；或5xSSC、1%SDS，在65。C下培育，且在65。C下在0.2xSSC和0.1%SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。如本文所使用，术语"真核生物"是指属于系统发生真核领域的有机体，诸如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物和藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、小孢子虫、原生生物等。如本文所使用，术语"非真核生物"是指非真核有机体。举例来说，非真核有机体可属于真菌系统发生域(包括(但不限于)大肠杆菌(^c^m'c/u》co/0、极端嗜热细菌(f77eA7wwsf/zermop/n7/)、嗜热月旨肪芽孢杆菌C6a"7/wsWeflrof/era7o;/n7zw)、荧光假单胞杆菌(T^yew(io7wo"ayy7womscez7w)、铜绿假单胞菌(T^ewcfowomwaerwg7."(wa)、恶臭假单胞菌a^^/owomw戶"^)等)；或古菌系统发生域(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(M"hawococcwsya朋。"W)、嗜热自养甲烷杆菌(Me^7a;wo&a"e〃'wm^enwom^o^o/Wci/m)、诸如沃氏嗜盐富饶菌(i/a/o/emxvo/corm7)和嗜盐菌属NRC-1(i/a/o6a"m'w附speciesiViC-7)的嗜盐菌(i/a/o6a"e"'函)、超嗜热古菌"rc^eog/o^/w/g油s)、强烈嗜热球菌(尸yrococcws/wn'oms)、嗜热泉生古细菌(Jewrop"謡/^m';c)等)。如本文所使用，术语"个体"是指作为治疗、观察或实验对象的动物，在一些实施例中为哺乳动物，且在其它实施例中为人类。如本文所使用，术语"有效量"是指所投与的经修饰非天然氨基酸多肽的量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状。可投与含有本文所述的经修饰非天然氨基酸多肽的组合物以达到预防性、增强性和/或治疗性治疗的目的。术语"增强"意思是增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此，就增强治疗剂的作用而言，术语"增强"是指增加或延长其它治疗剂对系统的作用的效力或持续时间的能力。如本文所使用，"增强有效量"是指适于增强所需系统中另一治疗剂的作用的量。当用于患者时，可有效用于此用途的量将视疾病、病症或病状的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状态和对药物的反应以及主治医生的判断而定。如本文所使用，术语"经修饰"是指对指定多肽所作的任何改变，诸如多肽长度、氨基酸序列、化学结构的改变、多肽的共翻译修饰或翻译后修饰。术语"(经修饰)"形式意思是所讨论的多肽视情况经修饰，也就是说，所讨论的多肽可经修饰或不经修饰。术语"翻译后修饰"是指在并入多肽链中后对天然氨基酸或非天然氨基酸进行的所述氨基酸的任何修饰。所述术语涵盖(仅举例来说)共翻译活体内修饰、共翻译活体外修饰(诸如，在无细胞翻译系统中)、翻译后活体内修饰和翻译后活体外修饰。在预防性应用中，将含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物投与易受特定疾病、病症或病状影响或者有患特定疾病、病症或病状风险的患者。所述量被定义为"预防有效量"。在此使用中，确切量也视患者的健康状态、体重等而定。认为所属领域技术人员将能够通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述预防有效量。术语"经保护"是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的"保护基"或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而变化。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自由叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)组成的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(诸如，丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苯甲基或烷基(诸如，甲基、乙基或叔丁基)。还可将所属领域已知的其它保护基用于本文所述的方法和组合物中，包括对光不稳定的基团，诸如Nvoc和MeNvoc。还可将所属领域已知的其它保护基用于本文所述的方法和组合物中。仅举例来说，封端/保护基可选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>Greene禾口Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版,JohnWiley&Sons,NewYork,NY，1999中描述其它保护基，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在治疗性应用中，将含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物以足以治愈或至少部分遏制疾病、病症或病状的症状的量投与已罹患疾病、病状或病症的患者。所述量被定义为"治疗有效量"，且将视疾病、病症或病状的严重程度和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断而定。认为所属领域技术人员将能够通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述治疗有效量。术语"治疗"用于指代预防性和/或治疗性治疗。本文所提供的非天然编码的氨基酸多肽可包括一个或一个以上原子经原子质量或质量数与自然界常见的原子质量或质量数不同的原子置换的经同位素标记的化合物。可并入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素，分别诸如2H、3H、13C、14C、15N、180、170、35S、18F、36C1。本文所述的某些同位素标记的化合物(例如，并有诸如311和"C等放射性同位素的化合物)可用于药物和/或底物组织分布检定中。此外，用同位素(诸如氘，即210取代可因较高的代谢稳定性而提供某些治疗优势，例如增加的活体内半衰期或降低的剂量需求。认为所有异构体(包括(但不限于)非对映异构体、对映异构体和其混合物)都为本文所述的组合物的部分。在额外或其它实施例中，在对有需要的有机体投与非天然编码的氨基酸多肽后，其代谢产生代谢物，随后使用所述代谢物产生所需作用，包括所需治疗作用。其它或额外实施例为非天然编码的氨基酸多肽的活性代谢物。在一些情形中，非天然编码的氨基酸多肽可以互变异构体的形式存在。此外，本文所述的非天然编码的氨基酸多肽可以未溶剂化形式以及与医药学上可接受的溶剂(诸如，水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。还认为本文中揭示溶剂化形式。所属领域技术人员将认识到本文中的一些化合物可以若干互变异构形式存在。认为所有所述互变异构形式都为本文所述的组合物的部分。除非另作说明，否则所属领域技术范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学等常规方法都可使用。I.引言一种最广泛使用的降低多肽免疫原性和/或过敏原性的策略为遮蔽多肽的表位，所述表位会和与多肽连结的聚合物分子(诸如，聚(乙二醇)(PEG))—起引起不合需要的免疫或过敏反应。美国专利第5,856,451号(其以引用的方式并入本文中)描述具有降低的过敏原性的经修饰多肽，所述多肽包含与分子量在1-60kDa范围内的聚合物连结的分子量在10-100kDa范围内的母体多肽。多肽可为具有额外连接基(诸如不存在于母体蛋白质中的氨基)的母体蛋白质的变体。WO96/40792(其以引用的方式并入本文中)揭示一种聚乙二醇化蛋白质以降低过敏原性和/或免疫原性的特定方法。WO97/30148(其以引用的方式并入本文中)揭示一种降低蛋白质过敏原性的方法，其中所述蛋白质与至少两个聚合物分子连结。WO98/35026(其以引用的方式并入本文中)揭示多肽-聚合物连结物，其已添加和/或去除一个或一个以上所选连接基以偶合多肽三维结构表面上的聚合物分子。使用定点诱变法，可将聚合物分子的连接基加到多肽表面的预定位置处以尝试增加可连接的聚合物分子的数量，和/或去除所述多肽活性位点处或邻近所述多肽活性位点的连接基，以避免邻近活性位点处会导致多肽活性的降低的过度聚乙二醇化。WO92/10755(其以引用的方式并入本文中)中揭示修饰多肽的另一种方法，其中已提出通过鉴别表位且随后通过修饰构成表位的氨基酸残基破坏表位来降低蛋白质的过敏原性。美国专利第5,218,092号(其以引用的方式并入本文中)揭示连接至少一个新的或额外碳水化合物的多肽，与相应未经修饰的多肽相比，所述多肽具有增加的稳定性。额外碳水化合物分子是通过将一个或一个以上额外N-糖基化位点加到多肽主链中并在糖基化宿主细胞中表达多肽来提供。WO00/26354(其以引用的方式并入本文中)揭示一种降低蛋白质、尤其酶的过敏原性的方法，其中过敏原性的降低是由通过一个或一个以上额外糖基化位点增加蛋白质糖基化所介导。除引起免疫反应外，与使用基于多肽的药物相关的另一已知缺点为这些药物通常会在体内迅速降解或消除。据报导，多肽与聚合物分子连结可增加功能性活体内半衰期。举例来说，美国专利第4,935,465号(其以引用的方式并入本文中)揭示因增加所论及的多肽的PEG连结物的尺寸而延长的聚乙二醇化多肽的清除时间。WO98/48837(其以引用的方式并入本文中)涉及具有降低的抗原性和增加的血流半衰期的单链抗原结合多肽-聚环氧烷连结物。待修饰的单链抗原结合多肽可包括一个或一个以上能够在某些预定位点处连结聚环氧烷的插入Cys或Lys。参看Delgado等人，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,9(3,4》249-304(1992)WO96/12505(其以引用的方式并入本文中)揭示多肽与低分子量亲脂化合物的连结物，据报导，其具有改进的药理学特性。据报导，多肽聚乙二醇化可导致多肽功能的降低。已提出在聚乙二醇化期间遮蔽多肽的活性位点以尝试避免活性的此种降低。更具体地说，WO94/13322(其以引用的方式并入本文中)揭示一种制备聚合物与第一物质的连结物的方法，所述第一物质的生物活性由其某一区域介导，其中在连结期间，所述第一物质的区域受第二物质保护，所述第二物质在连结发生后去除。与可能导致具有降低的生物活性的聚合物连结物的常规连结方法相比，使用此方法，第一物质的生物活性受到完全保护。WO93/15189(其以引用的方式并入本文中)涉及一种制备蛋白水解酶-PEG加合物的方法，其中所述蛋白水解酶当与PEG反应时与大分子抑制剂键联，从而封端酶的活性位点且因此防止PEG结合到活性位点或邻近活性位点之处。WO97/11957(其以引用的方式并入本文中)揭示一种通过遮蔽多肽的暴露靶来改进所述多肽、尤其因子VIII的活体内功能的方法，在所述方法中，通过与由有机化学合成制造的带有基团特异性吸附剂的配体相互作用而使所述多肽固定，将生物可相容聚合物活化并且将其与固定多肽连结，并将所述连结物从吸附剂洗脱。WO97/47751(其以引用的方式并入本文中)揭示例如通过与聚合物、糖部分或有机衍生试剂连结来修饰DNAse的各种形式。WO99/40198(其以引用的方式并入本文中)揭示经修饰从而引起免疫原性降低的各种链激酶变体。美国专利第4,904,584号(其以引用的方式并入本文中)揭示耗尽聚乙二醇化赖氨酸的多肽，其中至少一个赖氨酸残基已缺失或经任何其它氨基酸残基置换。WO99/67291(其以引用的方式并入本文中)揭示一种使蛋白质与PEG连结的方法，其中所述蛋白质上至少一个氨基酸残基已缺失，并且所述蛋白质是在足以使PEG与所述蛋白质连结的条件下与PEG接触。WO99/03887(其以引用的方式并入本文中)揭示属于生长激素超家族的聚乙二醇化多肽变体，其中已经用半胱氨酸残基取代位于所述多肽指定区域中的非必需氨基酸残基。所有上述现有技术方法都是建立在使用定向诱变方法以修饰所关注多肽的基础之上。使用所述定点诱变技术，加入或去除聚合物连接基，借此能够构建多肽-聚合物连结物，其中将聚合物分子连接到通常在待修饰的多肽表面处的某些预定位置处。WO98/27230(其以引用的方式并入本文中)揭示改组技术用于修饰蛋白质的用途。外显子改组、单克隆抗体人源化和位点特异性诱变是已提出的消除免疫原性表位的其它方式。若干因素可促成蛋白质免疫原性，包括(但不限于)蛋白质序列、投药途径和频率和患者群体。己将聚集与干扰素a的免疫原性关联[Bmun等人Pharm.Res.199714:1472-1478]。另一研究提出DR15MHC等位基因的存在可增加对中和抗体形成的易感性；有趣的是，相同等位基因还赋予对多发性硬化的易感性[Stickler等人GenesImm皿.20045:1-7]。由于聚集可能引起多肽(诸如干扰素，尤其干扰素P)的免疫原性，故针对改进溶解性而工程改造的变体也可具有降低的免疫原性。已产生半胱氨酸耗尽的变体以使不合需要的分子间或分子内二硫键的形成减到最少(美国专利第4,518,584号、第4,588,585号、第4,959,314号，其以引用的方式并入本文中)；所述变体展现降低的聚集倾向。已提出具有增强的稳定性的干扰素p变体，其中使用合理的设计方法来优化疏水核心(WO00/68387，其以引用的方式并入本文中)；在一些情况下可通过改进稳定性来增强溶解性。也已揭示促进干扰素稳定性和溶解性的其它调配物(美国专利第4,675,483号、第5,730,969号、第5,766,582号、WO02/38170，其以引用的方式并入本文中)。已提出具有增强的溶解性的干扰素(3突变蛋白，其中若干亮氨酸和苯丙氨酸残基经丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基置换(WO98/48018,其以引用的方式并入本文中)。美国专利公开案第20050181446号(其以引用的方式并入本文中)描述在表位区域引入修饰和建立各自引入一个或一个以上改变的氨基酸的多样化变异体的文库，以及选择展现良好的功能保持力且同时抗原性显著降低的变体的随机化方法。可通过所属领域技术人员已知的多种技术来建立所述多样化文库(ReetzMT;JaegerKE,"Biocatalysis--fromDiscoverytoApplication"FessnerWD编,第200巻,第31-57页(1999);Stemmer,Nature,第370巻，第389-391页，1994;Zhao和Arnold,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,第94巻，第7997-8000页，1997;或Yano等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,第95巻,第5511-5515页，1998)。这些技术包括(但不限于)尖峰诱变(spikedmutagenesis),其中通过使用一种或一种以上使用针对某些位置的核苷酸混合物合成的寡核苷酸引物进行PCR诱变来使蛋白质序列的某些位置随机化(LanioT,JeltschA,Biotecliniques,第25(6)巻，958,962,964-965(1998))。各三联体内使用的寡核苷酸的混合物可设计成使突变基因产物内的相应氨基酸在某种预定分布功能内随机化。已揭示便利此设计的算法(JensenLJ等人，NucleicAcidsResearch,第26(3)巻，697-702(1998))。已开发出其它方法来调节蛋白质的免疫原性，包括通过去除MHC结合抗原限制位、避开T细胞受体或抗体结合来破坏T细胞活化的方法。MHC分子的多样性仅包含约103个等位基因，而预计抗体谱系为约10S且T细胞受体谱系更大。通过鉴别和去除或修饰蛋白质序列内的II类MHC结合肽可避开免疫原性的分子基础。先前己揭示可消除所述抗原限制位来达到产生较少免疫原性蛋白质的目的；例如参看WO98/52976、WO02/079232和WO00/3317，其以引用的方式并入本文中。Adair,F.etD.Ozanne,BioPharm2002年2月；第30-6页和MuchaJM等人BMCImmunology2002;3:2中还描述T细胞表位的去除或修饰以及T细胞表位的预测。患者产生针对治疗性蛋白质的抗体后，可中断治疗过程，可用不同型式的蛋白质代替所述蛋白质，可起始使用免疫抑制药物的治疗，可诱导免疫耐受，或可采用其它作用过程。本发明提供包含至少一个非天然氨基酸的多肽。在本发明某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的多肽包括至少一个翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一个翻译后修饰包含利用所属领域技术人员己知适用于特定反应性基团的化学方法使包含第二反应性基团的分子与至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸连接，所述包含第二反应性基团的分子包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、糖、水溶性树突状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射可激发部分、可光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、延长的侧链、碳键联糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米递质、放射性核苷酸、放射性递质、中子捕获剂或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也称为乙炔部分)且第二反应性基团为叠氮基部分，且利用[3+2]环加成化学方法。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)且第二反应性基团为炔基部分。在本发明的经修饰多肽的某些实施例中，使用至少一个包含至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能团的非天然氨基酸)，其中所述至少一个翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中于活体内进行。连接基、聚合物、水溶性聚合物或其它分子可将分子与多肽连接。可将分子与多肽直接键联。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个在活体内由一种宿主细胞进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不是由另一宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个在活体内由真核细胞进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常不是由非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等。在一个实施例中，翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键将寡糖与天冬酰胺连接在一起(包括(但不限于)寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等的情形)。在另一实施例中，翻译后修饰包含将寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键连接在一起。在某些实施例中，本发明的蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、表位标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。分泌信号序列的实例包括(但不限于)原核分泌信号序列、真核分泌信号序列、针对细菌表达5'优化的真核分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶酸裂解酶分泌信号序列、OmpA分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)STII(原核生物)、FdGIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和来源于转座子的信号序列bla。所关注的蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或者十个或十个以上非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如蛋白质中1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO个或更多不同位点可包含l、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同非天然氨基酸。在某些实施例中，天然存在的蛋白质型式中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代。本发明提供基于包含至少一个非天然编码的氨基酸的多肽的方法和组合物，所述多肽包括(但不限于)GH、尤其hGH超基因家族成员。将至少一个非天然编码的氨基酸引入多肽中可允许应用连结化学，其涉及(包括(但不限于))与一个或一个以上非天然编码的氨基酸的特定化学反应，而不与通常存在的20种氨基酸反应。在一些实施例中，包含非天然编码的氨基酸的多肽经由非天然编码的氨基酸的侧链与水溶性聚合物(诸如，聚乙二醇(PEG))键联。本发明提供利用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的特别有效的方法，其涉及响应选择密码子将非基因编码的氨基酸(包括(但不限于)含有未见于20种天然并入的氨基酸中的官能团或取代基的氨基酸，所述官能团或取代基包括(但不限于)酮、叠氮化物或乙炔部分)选择性并入蛋白质中，且随后利用适当的反应性PEG衍生物修饰所述氨基酸。并入后，随后可通过利用所属领域技术人员已知适用于非天然编码的氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰氨基酸侧链。多种已知的化学方法都适用于本发明中以将水溶性聚合物并入蛋白质中。所述方法包括(但不限于)Huisgen[3+2]环力口成反应(例如参看Padwa,A.ComprehensiveOrganicSynthesis,第4巻.(1991)Trost,B.M.编，Pergamon,Oxford,第1069-1109页；和Huisgen,R.1,3-DipolarCvcloadditionChemistry,(1984)Padwa,A.编，Wiley,NewYork,第1-176页)且分别包括(但不限于)乙炔或叠氮化物衍生物。由于Huisgen[3+2]环加成方法涉及环加成而非亲核取代反应，故可以极高的选择性修饰蛋白质。可在室温下于水性条件中通过将催化量的Cu(I)盐加到反应混合物中而以优良的区位选择性(1,4>1，5)进行所述反应。例如参看Tornoe等人，(2002).Org.Chem.67:3057-3064;和Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599;和WO03/101972。可通过[3+2]环加成加到本发明的蛋白质中的分子包括具有适当官能团或取代基(包括(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物)的几乎任何分子。可将这些分子分别加到具有乙炔基(包括(但不限于)对炔丙基氧基苯丙氨酸)或叠氮基(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)的非天然氨基酸中。由Huisgen[3+2]环加成产生的五元环在还原环境中通常不是可逆的，且可在水性环境中对水解稳定较长时间。因此，在所需水性条件下用本发明的活性PEG衍生物修饰多种物质的物理和化学特征。甚至更重要的是，由于叠氮化物和乙炔部分彼此具特异性(且例如不会与20种常见的基因编码的氨基酸中的任一种反应)，故可在一个或一个以上特定位点中以极高的选择性修饰蛋白质。本发明还提供PEG衍生物的可溶于水且水解稳定的衍生物以及具有一个或一个以上乙炔或叠氮基部分的相关亲水聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物对于与己响应选择密码子而选择性引入蛋白质中的叠氮基部分偶合具有高度选择性。类似地，含有叠氮基部分的PEG聚合物衍生物对于与已响应选择密码子而选择性引入蛋白质中的乙炔部分偶合具有高度选择性。更具体说来，叠氮基部分包含(但不限于)烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可包括其它取代基，只要保持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包含垸基和芳基乙炔以及各自的衍生物。垸基和芳基乙炔的衍生物可包括其它取代基，只要保持叠氮基特异性反应性即可。本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的连结物，所述其它物质包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、糖、水溶性树突状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射可激发部分、可光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、延长的侧链、碳键联糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米递质、放射性核苷酸、放射性递质、中子捕获剂或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。本发明还包括具有叠氮基或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮基部分的PEG聚合物衍生物的连结物。举例来说，可在蛋白质中含有具有乙炔官能团的非基因编码的氨基酸的位置处将含有叠氮基部分的PEG聚合物与生物活性分子偶合。PEG与生物活性分子偶合的键包括(但不限于)Huisgen[3+2]环加成产物。所属领域充分确定，可使用PEG修饰生物材料的表面(例如参看美国专利第6,610,281号；Mehvar,R.,J.PharmPharmSci.,3(1):125-136(2000)，其以引用的方式并入本文中)。本发明还包括包含具有一个或一个以上反应性叠氮基或乙炔位点的表面的生物材料，和一个或一个以上经由Huisgen[3+2]环加成键与所述表面偶合的含叠氮基或乙炔的本发明的聚合物。还可经由除叠氮基键或乙炔键外的键，诸如经由包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键，将生物材料和其它物质与叠氮基或乙炔活化的聚合物衍生物偶合，从而存留可用于后续反应的叠氮基或乙炔部分。本发明包括一种合成含叠氮基和乙炔的本发明的聚合物的方法。在含叠氮基PEG衍生物的情况下，叠氮基可与聚合物碳原子直接键结。或者，可通过将在一个末端具有叠氮基部分的键联剂与常规活性聚合物连接从而使所得聚合物在其末端具有叠氮基部分来制备含叠氮基PEG衍生物。在含乙炔PEG衍生物的情况下，乙炔可与聚合物碳原子直接键结。或者，可通过将在一个末端具有乙炔部分的键联剂与常规活性聚合物连接从而使所得聚合物在其末端具有乙炔部分来制备含乙炔PEG衍生物。更具体说来，在含叠氮基PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物进行反应以产生具有更强反应性部分(诸如甲磺酸酯基、三氟乙磺酸酯基、甲苯磺酸酯基或卤素离去基团)的经取代聚合物。所属领域技术人员已知含有磺酰卤、卤素原子和其它离去基团的PEG衍生物的制备和使用。随后所得经取代聚合物进行反应以在聚合物末端处用更具反应性的部分取代叠氮基部分。或者，具有至少一个活性亲核或亲电部分的水溶性聚合物与在一个末端处具有叠氮基的键联剂进行反应，从而在PEG聚合物与键联剂之间形成共价键，且叠氮基部分位于聚合物末端处。所属领域技术人员己知亲核和亲电部分，包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等。更具体来说，在含乙炔PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物进行反应以从含有乙炔部分的前体中置换卤素或其它活性离去基团。或者，具有至少一个活性亲核或亲电部分的水溶性聚合物与在一个末端处具有乙炔的键联剂进行反应，从而在PEG聚合物与键联剂之间形成共价键，且乙炔部分位于聚合物末端处。所属领域技术人员己充分确定卤素部分、活性离去基团、亲核和亲电部分于有机合成以及PEG衍生物的制备和使用方面的用途。本发明还提供一种选择性修饰蛋白质以将其它物质加到经修饰蛋白质中的方法，所述其它物质包括(但不限于)水溶性聚合物，诸如PEG和含有叠氮基或乙炔部分的PEG衍生物。可使用含叠氮基和含乙炔PEG衍生物来修饰其中生物可相容性、稳定性、溶解性和缺乏免疫原性极为重要的表面和分子的特性，同时提供比所属领域先前已知的方式更具选择性的将PEG衍生物与蛋白质连接的方式。II.生长激素超基因家族实例本文所述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽或蛋白质的特定类型、类别或家族。事实上，可设计或修饰几乎任何多肽以使其包括至少一个本文所述的非天然编码的氨基酸。以下蛋白质包括由生长激素(GH)超基因家族的基因编码的蛋白质(Bazan,F.，/mmw"o/ogy7bcto少11:350-354(1990);Bazan,J.RSc/ewce257:410-413(1992);Mott，H.R.和Campbell,I.D.，Cwrew/Qp/m'owSfrwc/wa/所o/ogy5:114-121(1995);Silvennoinen,O.和Ihle,J.N.，SignallingbytheHematopoieticCytokineRECEPTORS(1996)):生长激素、催乳素、胎盘泌乳素、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL陽IO、IL-ll、IL-12(p35亚单元)、IL-13、IL-15、抑瘤素M、纤毛神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、a干扰素、p干扰素、s干扰素、Y干扰素、"干扰素、T干扰素、粒细胞群落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)和心营养素-1(cardiotrophin-l)("GH超基因家族")。预期将来将通过基因克隆和测序鉴别出此基因家族的其它成员。GH超基因家族的成员具有类似的二级和三级结构，但其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共有的结构特征使得易于鉴别基因家族的新成员且本文所述的非天然氨基酸方法和组合物同样适用。鉴于GH超基因家族成员之间结构同源性的程度，可使用本发明将非天然编码的氨基酸并入GH超基因家族的任何成员中。此蛋白质家族的每一成员都包含四螺旋束。已通过X射线衍射和NMR研究测定多种细胞因子的结构，包括G-CSF(Zink等人,FEBSLett.314:435(1992);Zink等人，Biochemistry33:8453(1994);Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sd.USA90:5167(1993))、GM-CSF(Diederichs，K.等人肠"ce154:1779-1782(1991);Walter等人，Mo/層.224:1075-1085(1992))、IL-2(Bazan,J.F.和McKay,D.B.257:410-413(1992))、IL-4(Redfield等人，所oc/z麵勿30:11029-11035(1991);Powers等人，Sc/e"ce256:1673-1677(1992))和IL-5(Milburn等人，363:172-176(1993))，并且所述结构展现惊人的GH结构保守性，但缺乏显著的一级序列同源性。根据建模和其它研究，认为IFN为此家族的成员(Lee等人，J.InterferonCytokineRes.15:341(1995);Murgolo等人，Proteins17:62(1993);Radhakrishnan等人，Structure4:1453(1996);Klaus等人，J.Mol.Biol.274:661(1997))。根据建模和诱变研究，认为EPO为此家族的成员(Boissel等人，/C&w.268:15983-15993(1993);Wen等人，J.Biol.Chem.269:22839-22846(1994))。现认为所有上述细胞因子和生长因子都构成一个大的基因家族。除共有类似的二级和三级结构外，此家族的成员还共有一个特性，即其必须寡聚合细胞表面受体以活化细胞内信号转导路径。一些GH家族成员(包括(但不限于)GH和EPO)结合单一类型的受体并使其形成均二聚体。其它家族成员(包括(但不限于)IL-2、IL-4和IL-6)结合一种以上类型的受体并使所述受体形成杂二聚体或更高级的聚集体(Davis等人,(1993),肠"ce260:1805-1808;Paonessa等人,(1995),EMBOJ.14:1942-1951;Mott和Campbell,.CWeW0;z"/ow5^w"固/S油gy5:114-121(1995))。诱变研究已经表明，与GH类似，这些其它细胞因子和生长因子含有多个(通常两个)受体结合位点且依次结合其同源受体(Mott和Campbell,Q^re"fQp/"/owSfrw"wm/5io/ogy5:114-121(1995);Matthews等人，(1996)尸roc.A^/.^cadSc/.93:9471-9476)。与GH类似，这些其它家族成员的主要受体结合位点主要出现在四个a螺旋和A-B环中。螺旋束中参与受体结合的特定氨基酸随家族成员不同而不同。与GH超基因家族成员相互作用的大部分细胞表面受体在结构上相关，且包含另一大型多基因家族。例如参看美国专利第6,608,183号，其以引用的方式并入本文中。由针对各个GH超基因家族成员的突变研究得到的一般结论为连接a螺旋的环通常倾向于不涉及在受体结合中。具体来说，短B-C环看来对大部分(如果并非全部)家族成员的受体结合并非必需的。为此，在GH超基因家族成员中可用如本文所述的非天然编码的氨基酸取代B-C环。A-B环、C-D环(和GH超家族的干扰素/IL-10样成员的D-E环)也可经非天然存在的氨基酸取代。邻近螺旋A和远离最后一个螺旋的氨基酸也倾向于不涉及在受体结合中且还可能为引入非天然存在的氨基酸的位点。在一些实施例中，在环结构内的任何位置处取代非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)A-B、B-C、C-D或D-E环的前1、2、3、4、5、6、7或更多氨基酸。在一些实施例中，在A-B、B-C、C-D或D-E环的后1、2、3、4、5、6、7或更多氨基酸内取代一个或一个以上非天然编码的氨基酸。GH家族的某些成员(包括(但不限于)EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、G-CSF、GM-CSF、TPO、IL-IO、IL-12p35、IL-13、IL-15和p干扰素)含有N键联和/或0键联糖。蛋白质中的糖基化位点几乎只出现在环区域中且不在a螺旋束中。由于受体结合通常不涉及环区域且由于环区域为糖基共价连接的位点，故其可为将非天然存在的氨基酸取代引入蛋白质中的有用位点。由于在蛋白质中的包含N键联和0键联糖基化位点的氨基酸表面暴露，故其可为非天然存在的氨基酸取代的位点。因此，天然蛋白质可容许在这些位点处与蛋白质连接的庞大糖基且糖基化位点倾向于远离受体结合位点。将来可能发现GH超基因家族的其它成员。可通过预测蛋白质序列的计算机辅助二级和三级结构分析以及经设计以鉴别与特定靶结合的分子的选择技术来鉴别GH超基因家族的新成员。GH超基因家族的成员通常具有四个或五个通过非螺旋氨基酸(环区域)连接的两亲螺旋。蛋白质可在其N末端含有疏水信号序列以促进细胞分泌。所述新近发现的GH超基因家族成员也包括在本发明内。相关申请案有2005年8月18日作为W005/074650公开的名为"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的国际专利申请案，其以引用的方式并入本文中。GH超基因家族的一个成员为人类生长因子(hGH)。人类生长体激素参与正常人类生长和发育的大部分调控。此天然存在的单链垂体激素是由191个氨基酸残基组成，且具有约22kDa的分子量。hGH展现多种生物作用，尤其包括线性生长(体征形成)、泌乳、巨噬细胞活化以及类胰岛素和致糖尿病作用(Chawla,R.等人，iev.Med34:519-547(1983);Isaksson，O.等人，X朋.及ev.i5/^/。/,47:483-499(1985);Hughes,J.和Friesen,^肌及ev.尸—'o/.,47:469-482(1985))。hGH的结构众所周知(Goeddel,D.等人，iV^we281:544-548(1979))，且己通过X射线结晶法解析hGH的三维结构(deVos,A.等人，Scz'ewce255:306-312(1992))。所述蛋白质具有致密的球状结构，其包含通过环连接的四个两亲a螺旋束，从N末端起称为A-D。hGH还含有四个半胱氨酸残基，其参与两个分子内二硫键C53与C165配对且C182与C189配对。所述激素未经糖基化且已于大肠杆菌中以分泌形式表达(Chang，C等人，55:189-196(1987))。已鉴别出多种天然存在的hGH突变体。这些包括hGH-V(Seeburg,ZW^1:239(1982);美国专利第4,446,235号、第4,670,393号和第4,665,180号，其以引用的方式并入本文中)和含有hGH残基32-46缺失的20kDahGH(Kostyo等人，所o;^".925:314(1987);Lewis,U.等人，所o/.253:2679-2687(1978))。此外，已报导由转录后加工、翻译后加工、分泌加工、代谢加工和其它生理学过程产生的多种hGH变体(Baumann,G,￡m/ocr/"e及evzews12:424(1991))。hGH的生物作用是由其与特定细胞受体相互作用所引起。激素为包括胎盘泌乳素和催乳素的同源蛋白家族的成员。然而，hGH在家族成员中并不常见，这是因为其展现较宽的物种特异性且结合所克隆的体因性受体(Leung,D.等人，iVa&"330:537-543(1987))或催乳素受体(Boutin,J.等人，Ce//53:69-77(1988))。根据结构和生物化学研究，已提出泌乳和体因性结合域的功能性图谱(Cu皿ingham,B.和Wells,J.,Proc.Natl.Acad.Sci.88:3407(1991))。hGH受体为造血/细胞因子/生长因子受体家族的成员，所述家族包括若干其它生长因子受体(诸如白细胞介素(IL)-3、-4和-6受体)、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)受体、促红细胞生成素(EPO)受体以及G-CSF受体。参看Bazan,户rac.WW/.JcfldSc/87:6934-6938(1990)。细胞因子受体家族成员含有四个保守半胱氨酸残基和恰好位于跨膜区外的色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基元。认为蛋白质-蛋白质相互作用中涉及所述保守序列。例如参看Chiba等人，所oc/z/肌5Zo//^.及仏Cowm.184:485-490(1992)。hGH与其受体(hGHbp)的细胞外区域的相互作用是最充分了解的激素-受体相互作用之一。高解析度X射线结晶学数据(Cunningham,B.等人，&^"ce,254:821-825(1991))已经展示hGH具有两个受体结合位点且使用分子上截然不同的位点依次结合两个受体分子。两个受体结合位点称为位点I和位点II。位点I包括螺旋D的羧基末端以及螺旋A和A-B环的部分，而位点II涵盖螺旋A的氨基末端区域和一部分螺旋C。GH与其受体的结合依次发生，其中首先结合位点I。随后位点II与另一GH受体啮合，引起受体二聚化和细胞内信号转导路径的活化，其导致对激素的细胞反应。已将G120R取代引入位点II的hGH突变蛋白能够结合单一hGH受体，但无法二聚合两个受体。突变蛋白可能通过占据受体位点而不活化细胞内信号转导路径来充当活体外hGH拮抗剂(Fuh,G.等人，Scfe"ce256:1677-1680(1992))。因此，出于说明性目的并且仅借助实例提供有关生长激素超基因家族的描述，且并不对本文所述的方法、组合物、策略和技术的范围构成限制。另外，本申请案中提及GH多肽意欲将所述通用术语用作任何多肽的实例。因此，应了解，本文所述的关于hGH多肽或蛋白质的修饰和化学同样可应用于任何多肽，包括(但不限于)GH超基因家族成员，包括本文具体列出的成员。III.用于本发明的通用重组核酸方法在本发明的多个实施例中，将使用重组方法分离、克隆且通常改变编码所关注多肽的核酸。将所述实施例用于(包括(但不限于))蛋白质表达或多肽来源的变体、衍生物、表达盒或其它序列的产生中。在一些实施例中，将编码本发明多肽的序列可操作地键联到异源启动子。例如在美国专利第4,601,980号、第4,604,359号、第4,634,677号、第4,658,021号、第4,898,830号、第5,424,199号、第5,795,745号、第5,854,026号、第5,849,535号、第6,004,931号、第6,022,711号、第6,143,523号和第6,608,183号中描述宿主细胞中hGH的分离和GH的产生，所述专利以引用的方式并入本文中。可在母体多肽的氨基酸序列的基础上合成编码包含非天然编码的氨基酸的多肽的核苷酸序列，包括(但不限于)具有美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列(hGH)且随后改变核苷酸序列，从而实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)或去除(即，缺失或取代)。可根据常规方法通过定点诱变便利地修饰核苷酸序列。或者，可通过化学合成(包括(但不限于)通过使用寡核苷酸合成仪)来制备核苷酸序列，其中寡核苷酸是基于所需多肽的氨基酸序列设计，且优选选择将产生重组多肽的宿主细胞所青睐的密码子。举例来说，可通过PCR、接合或接合链反应来合成和组装编码所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如参看Barany等人，脂/.Sc/.88:189-193(1991);美国专利6,521,427，其以引用的方式并入本文中。本发明利用重组遗传学领域的常规技术。揭示本发明中使用的通用方法的基本文章包括Sambrook等人，Mo/ec由rC7o"Zwg,X丄a6or她ryMimwof/(第3版,2001);Kriegler,GeweZhms/erEx^r柳/o".,X丄a6omtor少Mmwa/(1990);禾口Cw"e"fiVo/oco/jMo/ecWar所o/ogy(Ausubel等人编，1994)。描述分子生物学技术的常见文章包括Berger和Kimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques.MethodsinEnzymology第152巻AcademicPress,Inc.,SanDiego，CA(Berger);Sambrook等人、MolecularCloning-ALaboratoryManual(第2版)，第1-3巻ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989("Sambrook")禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等人编,CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.的合资公司，(1999增刊)("Ausubel")。这些文章描述诱变、载体的使用、启动子和许多其它相关课题，其涉及(包括(但不限于))产生包括用于制备包括非天然氨基酸的蛋白质的选择密码子、正交tRNA、正交合成酶和其对的基因或聚核苷酸。多类诱变方法可用于本发明中以用于各种目的，包括(但不限于)产生新颖合成酶或tRNA、使tRNA分子突变、使编码合成酶的聚核苷酸突变、产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、插入编码所关注蛋白质或多肽中的非天然氨基酸的选择密码子。所述诱变方法包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构筑、使用含尿嘧啶模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用缺口双螺旋DNA的诱变等，或其任何组合。其它适当方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过全基因合成诱变、双股断裂修复等。(包括(但不限于))涉及嵌合构筑体的诱变也包括在本发明中。在一个实施例中，可通过有关天然存在分子或者改变或突变的天然存在分子的已知信息(包括(但不限于)序列；序列比较；物理特性；二级、三级或四级结构；晶体结构等)指导诱变。本文所见的文章和实例描述这些程序。其它信息见于其中所引用的以下公开案和参考文献中Ling等人，^proflc/zesZWJww/"g^we^.,awoverv/ew，AnalBiochetn.254(2》157-178(1997);Dale等人，mm/o附歸/ag^w^y/sws/wg卢—m"/zo《MethodsMol.Biol.57:369-374(1996);Smith,J>vzYtoAnn.Rev.Genet.19:423-462(1985);Botstein&Shortle,i5/r她g/e51am/"p;/zca"'<myo/v/加Sckncc229:1193-1201(1985);Carter,幼e-^^"e^附w/"gewes/51，Biochem.丄237:1-7(1986);Kunkel，TTzeej^7"ewcyo"go打wc/eofk/et/^ecfeii應啤ewe57j，NucleicAcids&MolecularBiology(Eckstein,R禾口Lilley,D.M.J，编，SpringerVerlag,Berlin)(1987);Kunkel，ia/zWawde^Cew/w'/e-5"/ec^/c/ww/ag^wes/siW/7ow/1//ze"oO^/cw/ec"o",Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492(1985);Kunkel等人，及a;/dawds"e-5^eczycmi/啤ewesfsMn^owfj9/2ewo妙/cse/ec"ow,MethodsinEnzvmol.154,367-382(1987);Bass等人，Mw加/7>j!7^pms^sw51ewZ)7V/4-6/m//^5^e"y"Y/e51,Science242:240-245(1988);Zoller&Smith,ww/agewe^wsfwgawyDA^4如g附ew/1,NuclsicAcidsRss,10:6487-6500(1982);Zoller&Smith,(9//go/2wc/eo/7^fe-d/;^c/^Jwwf"gewes/sZ)A^f/r"g附ew"veCo/^y,MethodsinEnzymol.100:468-500(1983);Zoller&Smith,(9//gowwc/eo^/e-c//re"ed腦啤e"e^.'aMethodsinEnzvmol.154:329-350(1987);Taylor等人，77^o/p/zo5^ora^o她-mot^/^ZW乂z打？^n'"fowewz戸ereac"'owfom'cA:ed￡)濕，Nucl.AcidsRes.13:8749-8764(1985);Taylor等人，77^mpzWo/Nucl.AcidsRss.13:8765-8785(1985);Nakamaye&Eckstein,/"/z/础owre欲/"/owo/fgowwc/eo"We-A>^"e(imwfage/iesfs,Nucl.AcidsRes.14:9679-9698(1986》Sayers等人，Exowwc/eoses;7/2as/7/;oro"/oafe-6"5^o/zgowwc/eoWe-d/rec/ed;wwf"gewe减Nucl.AcidsRes.16:791-802(1988);Sayers等人，577"zycc/e"vage0/"/nW/wm6row地(1988)Nucl.AcidsRes.16:803-814;Kramer等人，7Tzeg"/;et/d一exapproachfoo/zgowwc/eo"^-Are"edcowZrw"fo;7,Nucl.AcidsRes.12:9441-9456(1984);Kramer&Fritz0//gowwc/eo/7^fe-<^>e"e<icow欲w"/owo/附w加/cwv/aga/7戸ddw//exZ)崩，MethodsinEnzymol.154:350-367(1987);Kramer等人，T/wpravedcomtrw"/owq/"附wto7ora，Nucl.AcidsRes.16:7207(1988);Fritz等人，ewz>7wa/7creae//o/wfv/fro，Nucl.AcidsRes.16:6987-6999(1988);Kramer等人，Zh^re打fw/sm"fc/z-rep"/rs少5temco//，Cell38:879-887(1984);Carter等人，/附/roveds7Ye-A>e"ed/wwfag^we^51wjz>7gM/3ve加rs,Nucl.AcidsRes.13:4431-4443(1985);Carter,/w/rove<i/ww^^we57、W57'wgMZve"ony,MethodsinEnzvmol.154:382-403(1987);Eghtedarzadeh&Henikoff,L/ise0/o/igowwc/eo"'*gewera/^/argeNucl.AcidsRes,14:5115(1986);Wells等人,0//zj^/n9g^w-6o/7t/s/aZ^7/z/wg/7zefrtf/iyz"》wy/a"0/5^6"7/57>,Phil.Trans.R.Soc.Loud.A317:415-423(1986》Nambiar等人，7b/a/，Ae^朋dc/om'"go/ageweco<i/wg/orn'6o露/ea5^S戸她，Science223:1299-1301(1984);Sakmar和Khorana,7bM/5^w^e^awee;cpmyjfowo/agewe/o尸/7zea/z/20!-ra6M""o/6ov/weow/e/"seg膨"/"gwam'wewwc/ec^/<ie-6/m//g/raWw(r^ms^wc/"义Nucl.AcidsRes.14:6361-6372(1988);Wells等人,s"es,Gene34:315-323(1985);Grundstrom等人，Wgcwwc/eo"We-<iz>*e"e(i附wtoge"gj7'51脂'cmscfl/e'57o^gww'gewejyw/7ze57、Nucl.AcidsRes.13:3305-3316(1985);Mandecki，附"ZzO(iWe-，"7c戲鄉ewe&,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83:7177-7181(1986);Arnold,尸roe/"e"g/"een'"gybrw"wjwfl/e"vzVo"附e"",CurrentOpinioninBiotechnology4:450-455(1993);Sieber,等人，NatureBiotechnology,19:456-460(2001);W.P.C.Stemmer,Nature370,389-91(1994);和I.A.Lorimer,I.Pastan,NucleicAcidsRes.23，3067-8(1995)。有关上述许多方法的其它细节可见于MethodsinEnzvmology第154巻，其还描述对于利用各种诱变方法引起的故障检修问题的有用控制。通常根据Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetts.22(20):1859-1862,(1981)中所述的固相氨基磷酸三酯方法，例如使用如Needham-VanDevanter等人，NucleicAcidsRes.,12:6159-6168(1984)所述的自动化合成仪，通过化学方法合成用于本发明的诱变(例如，使合成酶文库突变或改变tRNA)的寡核苷酸。本发明还涉及用于经由正交tRNA/RS对在活体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和有机体。利用本发明的聚核苷酸或包括本发明聚核苷酸的构筑体(包括(但不限于)本发明的载体，例如其可为克隆载体或表达载体)以遗传学方法工程改造(包括(但不限于)转化、转导或转染)宿主细胞。举例来说，将正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生化的蛋白质的编码区可操作地键联到在所需宿主细胞中起作用的基因表达控制元件。所述载体例如可为质粒、科斯质粒(cosmid)、噬菌体、细菌、病毒、裸聚核苷酸或连结聚核苷酸的形式。可通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,5824(1985))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上用具有核酸的小粒子高速弹道渗透(Klein等人，Nature327,70-73(1987))等。可在经改变适用于诸如筛选步骤、活化启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养经工程改造的宿主细胞。这些细胞可视情况培养入转基因有机体中。用于(包括(但不限于))细胞分离和培养(例如用于随后核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第3版，Wiley-Liss,NewYork及其中引用的参考文献；Payne等人(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWiley&Sons,Inc.NewYork,NY;Gamborg和Phillips(编)(1995)PlantCell,TissueandOrganCulture;FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)以及Atlas和Parks(编)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL。可使用将靶核酸引入细胞中的若干种众所周知的方法，其中任一种都可用于本发明中。这些方法包括受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法和经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌内的质粒(例如参看Sambrook)。另外，可购得试剂盒以从细菌中纯化质粒(例如参看都来自PharmaciaBiotech的EasyPrep、FlexiPrep;来自Stratagene的StrataCleanTM;和来自Qiagen的QIAprepTM)。随后进一步操纵经分离且经纯化的质粒以产生其它质粒，所述质粒用于转染细胞或并入相关载体中以感染有机体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控特定靶核酸的表达的启动子。载体视情况包含通用表达盒，其含有至少一个独立终止子序列、允许表达盒在真核细胞或原核细胞或两者(包括(但不限于)穿梭载体)中复制的序列和用于原核系统与真核系统的选择标记。载体适用于在原核细胞、真核细胞或两者中复制和整合。参看Gillam&Smith,Gene8:81(1979);Roberts等人，Nature.328:731(1987);Schneider,E.等人，ProteinExpr.Purif.6(1)10-14(1995);Ausubel,Sambrook,Berger(都同上文)。可用于克隆的细菌和噬菌体的目录由例如ATCC提供，例如由ATCC出版的TheATCCCatalogueofBacteriaandBacteriophage(1992)Gherna等人(编)。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑也见于Watson等人(1992)RecombinantDNA第2版ScientificAmericanBooks,NY中。另外，基本上任何核酸(和几乎任何标记核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一种定制或标准定购，这些商业来源诸如MidlandCertifiedReagentCompany(Midland,TX，可通过万维网在mcrc.com上获得)、TheGreatAmericanGeneCompany(Ramona,CA，可通过万维网在genco.com上获得)、ExpressGenInc.'(Chicago,IL,可通过万维网在expressgen.com上获得)、OperonTechnologiesInc.(Alameda,CA)和许多其它来源。选择密码子本发明的选择密码子扩展蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特的三碱基密码子、无义密码子(诸如终止密码子，其包括(但不限于)琥珀密码子(UAG)、赭石密码子或蛋白石密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子等。所属领域技术人员易于了解，可引入所需基因或聚核苷酸中的选择密码子的数目范围很广，包括(但不限于)在编码至少一部分多肽的单一聚核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个或三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、IO个或IO个以上选择密码子。在一个实施例中，所述方法涉及使用作为用于在活体内并入一个或一个以上非天然氨基酸的终止密码子的选择密码子。举例来说，产生识别终止密码子(包括(但不限于)UAG)的O-tRNA，且通过具有所需非天然氨基酸的O-RS使其氨酰基化。此O-tRNA并不由天然存在的宿主的氨酰基-tRNA合成酶所识别。常规定点突变诱发可用于在所关注多肽中的所关注位点处引入终止密码子(包括(但不限于)TAG)。例如参看Sayers，J.R.等人，(1988),5'-3'五xowwc/ea5^//zo5/^o,o^'o她-Z^ed0/z-gowwcAo"We-(i/re"eJwWagewe;^.NucleicAcidsRes,16:791-802。当O-RS、O-tRNA和编码所关注多肽的核酸在活体内组合时，响应UAG密码子而并入非天然氨基酸以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。可在不显著干扰真核宿主细胞的情况下在活体内进行非天然氨基酸的并入。举例来说，由于对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制tRNA)与真核释放因子(包括(但不限于)eRF)(其与终止密码子结合且起始核糖体释放生长肽)之间的竞争，故可通过(包括(但不限于))增加O-tRNA和/或抑制tRNA的表达水平来调节抑制效率。也可用稀有密码子编码非天然氨基酸。举例来说，当在活体外蛋白质合成反应中降低精氨酸浓度时，经证实，稀有精氨酸密码子AGG对于通过经丙氨酸酰基化的合成tRNA插入Ala有效。例如参看Ma等人，Biochemistry,32:7939(1993)。在此情况下，合成tRNA与天然存在的tRNAArg竞争，所述tRNAArg是作为大肠杆菌中的微量物质存在。一些有机体不使用所有三联体密码子。已在藤黄微球菌(M/crococow/"&w)中利用未指定的密码子AGA在活体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。例如参看Kowal和Oliver,Nucl.Acid.Res.,25:4685(1997)。可产生本发明的组件以在活体内使用这些稀有密码子。选择密码子还包含延长密码子，包括(但不限于)四个或四个以上碱基的密码子，诸如，四个、五个、六个或更多个碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的特征包括使用基于移码抑制的延长密码子。四个或四个以上碱基密码子可将(包括(但不限于))一个或一个以上非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在存在突变O-tRNA(包括(但不限于)具有反密码子环(例如，具有至少8-10个核苷酸的反密码子环)的特定移码抑制tRNA)的情况下，四个或四个以上碱基密码子被读成单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码(包括(但不限于))至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基密码子。由于存在256种可能的四碱基密码子，故可使用四个或四个以上碱基密码子在同一细胞中编码多种非天然氨基酸。参看Anderson等人,(2002)Ex//or/"gZ/ze丄/mz'fc<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>举例来说，使用活体外生物合成方法，已经用四碱基密码子将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看Ma等人，(1993)Biochemistry,32:7939;和Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc,121:34。CGGG和AGGU用于在活体外通过两种化学酰化的移码抑制tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时并入抗生物素蛋白链菌素中。例如参看Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc,121:12194。在活体内研究中，Moore等人研究具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13%到26%的效率解码，其中在0或-l框架中几乎无解码。参看Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.,298:195。在一个实施例中，可将以稀有密码子或无义密码子为基础的延长密码子用于本发明中，其可降低在其它不需位点处的错义通读和移码抑制。对于给定系统来说，选择密码子也可包括天然三碱基密码子中的一种，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展现存的遗传代码。一个额外碱基对将三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的特性包括稳定和选择性的碱基配对、通过聚合酶以高保真度有效地酶促并入DNA中以及在合成新生非天然碱基对之后有效持续的引物延伸。可用于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括例如Hirao等人，(2002)w朋a/wm/6ase戸!>/or/wco"/7or加'wgam/woarc/iiawa/ogwesmfo_pra&/"，NatureBiotechnology,20:177-182。还参看Wu,Y.等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630。其它相关公开案列于下文中。对于活体内使用来说，非天然核苷可透过膜且经磷酸化以形成相应三磷酸盐。另外，增加的遗传信息为稳定的且不受细胞酶所破坏。Benner等人的先前努力利用不同于标准Watson-Crick对中的氢键结模式，其最值得注意的实例为iso-C:iso-G对。例如参看Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc,111:8322;和Piccirilli等人，(1990)Nature,343:33;Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol,4:602。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。Kool和同事证实碱基之间的疏水填充相互作用可替代氢键结来驱动碱基对的形成。参看Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol,4:602;和Guckian及Kool,(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl..36,2825。在致力于开发满足所有上述要求的非天然碱基对的过程中，Schultz、Romesberg和同事已系统地合成且研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身对比天然碱基对更稳定，且可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地并入DNA中。例如参看McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc,121:11585-6;以及Ogawa等人，(2000).Am.Chem.Soc,122:3274。可通过KF以对于生物功能足够的效率和选择性合成3MN:3MN自身对。例如参看Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc..122:8803。然而，两种碱基都充当进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来己得到发展，其可用于复制PICS自身对。此外，可复制7AI自身对。例如参看Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc.,123:7439。也已研发新颖金属碱基对Dipic:Py,其在结合Cu(II)后形成稳定对。参看Meggers等人，(2000、J.Am.Chem.Soc.,122:10714。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本发明的方法可利用此特性来产生其正交tRNA。翻译旁路系统(translationalbypassingsystem)也可用于将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并不翻译成蛋白质。所述序列含有充当诱导核糖体跃过序列且继续插入下游的翻译的线索的结构。在某些实施例中，在本发明的方法和/或组合物中的所关注蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常，核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。可使用所属领域技术人员已知且在本文中描述的方法诱变编码所关注蛋白质或多肽的基因以包括例如一个或一个以上选择密码子以并入非天然氨基酸。举例来说，使所关注蛋白质的核酸诱变以包括一个或一个以上选择密码子，从而提供一个或一个以上非天然氨基酸的并入。本发明包括例如包括至少一个非天然氦基酸的任何蛋白质的任何此种变体(包括(但不限于)突变体)形式。类似地，本发明也包括相应核酸，g卩，具有一个或一个以上编码一个或一个以上非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。可容易地使编码所关注蛋白质(诸如hGH多肽)的核酸分子突变以在多肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入所关注蛋白质上。所属领域技术人员已知适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法，诸如在美国专利第6,608,183号(其以引用方式并入本文中)中所述的那些方法，并且包括标准诱变技术。IV.非天然编码的氨基酸多种非天然编码的氨基酸适用于本发明中。许多非天然编码的氨基酸可引入多肽中。一般来说，所引入的非天然编码的氨基酸实质上对20种常见的基因编码的氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)呈化学惰性。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包括与未见于20种常见氨基酸中的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮、醛和氨氧基)有效且选择性地反应以形成稳定连结物的侧链官能团。举例来说，包括含有叠氮基官能团的非天然编码的氨基酸的多肽可与聚合物(包括(但不限于)聚(乙二醇))或者含有炔部分的第二多肽反应以形成稳定连结物，所述稳定连结物是由叠氮基与炔官能团的形成Huisgen[3+2]环加成产物的选择性反应形成。a氨基酸的一般结构说明如下(式I)-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>非天然编码的氨基酸通常为具有上述式(其中R基团为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)的任何结构，且可适用于本发明中。由于本发明的非天然编码的氨基酸通常仅侧链结构不同于天然氨基酸，故非天然编码的氨基酸以其形成于天然存在多肽中的相同方式与其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然编码的氨基酸)形成酰胺键。然而，非天然编码的氨基酸具有将其区别于天然氨基酸的侧链基团。举例来说，R视情况包含垸基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基(borate)、硼酸酯基(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等，或其任何组合。可适用于本发明中的其它所关注的非天然存在氨基酸包括(但不限于)包含可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记氨基酸、荧光氨基酸、结合金属的氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼蔽和/或可光异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(诸如糖取代丝氨酸)、其它碳水化合物修饰氨基酸、含酮基氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链(包括(但不限于)聚醚或长链烃，包括(但不限于)大于约5个或大于约10个碳)的氨基酸、含碳键联糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或一个以上有毒部分的氨基酸。可适用于本发明中且可用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码的氨基酸包括(但不限于)具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮基和炔反应性基团的非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包含糖部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。所述氨基酸的实例还包括氨基酸与糖之间的天然存在的N或0键经自然界中不常见的共价键(包括(但不限于)烯烃、肟、硫醚、酰胺等)置换的实例。所述氨基酸的实例也包括天然存在的蛋白质中不常见的糖，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。本文中所提供的众多非天然编码的氨基酸可购自例如Sigma-Aldrich(St.Louis,MO，USA)、Novabiochem(EMDBiosciences,Darmstadt,Germany的分公司)或Peptech(Burlington,MA,USA)。不能购得的氨基酸视情况按本文所提供进行合成或使用所属领域技术人员已知的标准方法进行合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon的OrganicChemistry,(1982,第2版,"WillardGrantPress,BostonMass.);March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985,WileyandSons,NewYork);以及Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry(第3版，A和B部分，1990,PlenumPress,NewYork)。也参看美国专利第7,045,337号和第7,083,970号，其以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸之外，可适用于本发明中的非天然氨基酸还视情况包含(包括(但不限于))如由式II和III的结构所说明的经修饰主链结构其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R'或S-R';X和Y可相同或不同，其通常包含S或O;且R和R'视情况相同或不同，其通常选自上文关于具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的相同组分列表以及氢。举例来说，本发明的非天然氨基酸视情况包含在如式II和m所示的氨基或羧基中的取代。此类非天然氨基酸包括(但不限于)ot-羟基酸、a-硫代酸、a-氨基硫代羧酸酯，包括(但不限于)具有对应于20种常见天然氨基酸的侧链或非天然侧链。另外，在a-碳上的取代视情况包括(但不限于)L、D或a-a-二取代氨基酸，诸如D-谷氨酸盐、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸，诸如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物；P和y氨基酸，诸如经取代P-丙氨酸和y-氨基丁酸。许多非天然氨基酸是以诸如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸为基础且适用于本发明中。酪氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸，其中经取代酪氨酸包含(包括(但不限于))酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、c6-c20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基、硝基、炔基等。另外，也涵盖多取代芳基环。可适用于本发明中的谷氨酰胺类似物包括(但不限于)a-羟基衍生物、y-取代衍生物、环状衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明中的苯丙氨酸类似物的实例包括(但不限于)对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含(包括(但不限于))羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘、溴、酮基(包括(但不限于)乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可适用于本发明中的非天然氨基酸的特定实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcP-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸和对炔丙基氧基-苯丙氨酸等。可适用于本发明中的多种非天然氨基酸的结构的实例提供于例如名为"Invivoincorporationofunnaturalaminoacids"的WO2002/085923中。关于其它甲硫氨酸类似物，也参看Kiick等人，(2002)/"cor;ora"o"o/P謹99:19-24，其以引用的方式并入本文中。在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸(诸如对-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的多肽组合物。还提供包含对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸且包括(但不限于)蛋白质和/或细胞的各种组合物。一方面，包括对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键结(包括(但不限于)共价键结)，其包括(但不限于)通过氨基-酰基键与正交tRNA共价键结、与正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH共价键结等。经由非天然氨基酸可并入蛋白质中的化学部分提供多种优点以及对蛋白质的操作。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许在活体外和活体内用众多含肼或含羟胺试剂中的任一种对蛋白质进行选择性修饰。重原子非天然氨基酸例如可用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸进行重原子的位点特异性引入在选择重原子的位置时也提供选择性和灵活性。光反应性非天然氨基酸(包括(但不限于)具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括(但不限于)叠氮基苯)侧链的氨基酸)例如允许在活体内和活体外有效地光交联蛋白质。光反应性非天然氨基酸的实例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后可通过激发提供光反应性基团的时间控制使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中，可通过使用(包括(但不限于))核磁共振和振动光谱学，用作为局部结构和动力学的探针的同位素标记(包括(但不限于))的甲基取代非天然氨基的甲基。炔基或叠氮基官能团例如允许通过[3+2]环加成反应用分子对蛋白质进行选择性修饰。并入多肽的氨基末端处的非天然氨基酸可由R基团(其为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)和不同于a-氨基酸(参看式I)中通常存在的NH2基团的第二反应性基团组成。可在具有不同于a-氨基酸(参看式I)中通常存在的COOH基团的第二反应性基团的羧基末端处并入类似的非天然氨基酸。可选择或设计本发明的非天然氨基酸以提供20种天然氨基酸中不可得到的额外特征。举例来说，可视情况设计或选择非天然氨基酸以改变并入所述非天然氨基酸的蛋白质的生物特性。举例来说，可通过将非天然氨基酸包涵于蛋白质中来视情况改变以下特性毒性、生物分布、溶解性、稳定性(例如，热、水解、氧化稳定性)、对酶降解的抗性等、纯化和加工便利性、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化活性、氧化还原势、半衰期、与其它分子(例如共价或非共价)反应的能力等。非天然氨基酸的结构和合成羰基、类羰基、经遮蔽羰基、经保护羰基和羟胺基团在一些实施例中，本发明提供一种多肽，其包括(但不限于)通过肟键与水溶性聚合物(例如PEG)键联的多肽。许多类型的非天然编码的氨基酸适用于形成肟键。这些氨基酸包括(但不限于)含有羰基、二羰基或羟胺基团的非天然编码的氨基酸。所述氨基酸描述于2004年12月22日申请的名为"Compositionscontaining,methodsinvolving,andusesofnon-naturalaminoacidsandpolypeptides"的美国专利申请案第60/638,418号、第60/638,527号和第60/639,195号中，其以全文引用的方式并入本文中。所述氨基酸还描述于2005年7月1日申请的名为"Compositionscontaining,methodsinvolving,andusesofnon-naturalaminoacidsandpolypeptides"的美国专利申请案第60/696,210号、第60/696,302号和第60/696,068号中，其以全文引用的方式并入本文中。非天然编码的氨基酸还在美国专利第7,045,337号和第7，083，970号中有所描述，所述专利以全文引用的方式并入本文中。本发明一些实施例利用在一个或一个以上位置处经对乙酰基苯丙氨酸氨基酸取代的多肽。对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人,.Biochemistry42:6735-6746(2003)中，其以引用的方式并入。所属领域技术人员可类似地制备其它含有羰基或二羰基的氨基酸。另外，本文所包括的非天然氨基酸的非限制性例示性合成提供于美国专利第7,083,970号(其以全文引用的方式并入本文中)的图4、24-34和36-39中。具有亲电反应性基团的氨基酸允许多种反应以尤其经由亲核加成反应键联分子。所述亲电反应性基团包括羰基(包括酮基和二羰基)、类羰基基团(其具有与羰基(包括酮基和二羰基)类似的反应性且结构类似于羰基)、经遮蔽羰基(其可容易地转化成羰基(包括酮基和二羰基))或经保护羰基(其在去保护后具有与羰基(包括酮基和二羰基)类似的反应性)。所述氨基酸包括具有式(IV)结构的氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>(IV)，其中A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚垸基、经取代低碳亚垸基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂垸基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环垸基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳垸基；B.为可选的且当存在时，其为选自由以下基团组成的群组的连接基低碳亚烷基、经取代低碳亚垸基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂垸基、经取代低碳亚杂垸基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-S(0)k-(其中k为l、2或3)、-S(O)k(亚垸基或经取代亚垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)単')-、-N(R')S(O)kN(R')墨、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N^n-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、垸基或经取代烷基；J为R为H、烷基、经取代垸基、环烷基或经取代环烷基；各R"独立地为H、烷基、经取代垸基或保护基，或者当存在一个以上R"基时，两个R"视情况形成杂环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳垸基，或者R3和R4或两个R3基团视情况形成环垸基或杂环垸基；或-A-B-J-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经遮蔽羰基(包括经遮蔽二羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基；或-J-R基团一起形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经遮蔽羰基(包括经遮蔽二羰基)的单环或双环环烷基或杂环垸基；条件是当A为亚苯基且各R3为H时，B存在；且当A为-(CH2)4-且各R3为H时，B不为-NHC(0)(CH2CH2)-;且当A和B不存在且各R3为H时，R不为甲基。此外，包括具有式(V)结构的氨基酸A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚垸基、经取代低碳亚垸基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环垸基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂垸基、经取代亚杂垸基、低碳亚杂环垸基、经取代低碳亚杂环垸基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳垸基；B为可选的且当存在时，其为选自由以下基团组成的群组的连接基低碳亚烷基、经取代低碳亚垸基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂垸基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-S(0)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚垸基或经取代亚垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-N(R')CO-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、《(!1')2^=^和-(:(11')2^(11')^(10-，其中各R'独立地为H、垸基或经取代烷基；R为H、烷基、经取代垸基、环垸基或经取代环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；其中:且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；条件是当A为亚苯基时，B存在；且当A为-(CH2)4时，B不为-NHC(0)(CH2CH2)-;且当A和B不存在时，R不为甲基。此外，包括具有式(VI)结构的氨基酸其中B为选自由以下基团组成的群组的连接基低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂垸基、经取代低碳亚杂垸基、-o-、-o-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-S-、-S-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-S(0)k-(其中k为1、2或3)、-S(OM亚垸基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-N(R')-、-NR'-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')國、-N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N-和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、垸基或经取代烷基；R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、经取代垸基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k为l、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中各R'独立地为H、烷基或经取代垸基。此外，包括以下氨基酸，其中所述化合物视情况为氨基经保护的基团、羧基经保护的基团或其盐。此外，可将以下非天然氨基酸中的任一种并入非天然氨基酸多肽中。此外，包括具有式(VII)结构的以下氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>B为可选的且当存在时，其为选自由以下基团组成的群组的连接基低碳亚垸基、经取代低碳亚垸基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂垸基、经取代低碳亚杂垸基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-S-、-S-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-S(O)k-(其中k为l、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-N(R')-、-NR'-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N^tI-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、垸基或经取代烷基；R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环垸基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、经取代垸基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k为l、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中各R'独立地为H、烷基或经取代垸基，且n为0到8;条件是当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(0)(CH2CH2)-。此外，包括以下氨基酸和a，其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基和羧基都经保护，或为其盐。此外，可将这些非天然氨基酸和任何以下非天然氨基酸并入非天然氨基酸多肽中。此外，包括具有式(VIII)结构的以下氨基酸其中A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环垸基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环垸基、经取代低碳亚杂环垸基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚烷芳基、亚芳垸基或经取代亚芳烷基;B为可选的且当存在时，其为选自由以下基团组成的群组的连接基低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-o-、-o-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-s-、-s-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-s(o)k-(其中k为l、2或3)、-S(O)k(亚垸基或经取代亚垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N4tI-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、垸基或经取代烷基；!^为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。此外，包括具有式(IX)结构的以下氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>(IX)，B为可选的且当存在时，其为选自由以下基团组成的群组的连接基低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂垸基、-O-、-O-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(0)k-(其中k为l、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、陽N(R')S(O)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=Nm-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、垸基或经取代烷基；R为H、垸基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；Rj为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；其中各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k为l、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中各R'独立地为H、垸基或经取代烷基。此外，包括以下氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基和羧基都经保护，或为其盐。此外，可将这些非天然氨基酸和任何以下非天然氨基酸并入非天然氨基酸多肽中。此外，包括具有式(X)结构的以下氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>其中B为可选的且当存在时，其为选自由以下基团组成的群组的连接基低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂垸基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(0)k-(其中k为l、2或3)、-S(O)k(亚垸基或经取代亚垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')曙、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')-N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N4tI-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代垸基；其中所述化R为H、垸基、经取代垸基、环烷基或经取代环垸基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；各Ra独立地选自由H、卤素、垸基、经取代垸基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k为1、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中各R'独立地为H、垸基或经取代烷基，且n为0到8。此外，包括以下氨基酸:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>a.,其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基和羧基都经保护，或为其盐。此外，可将这些非天然氨基酸和任何以下非天然氨基酸并入非天然氨基酸多肽中。除单羰基结构外，本文所述的非天然氨基酸还可包括诸如二羰基、类二羰基、经遮蔽二羰基和经保护二羰基的基团。举例来说，包括具有式(XI)结构的以下氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>(XI)，其中A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚垸基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环垸基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚垸芳基、亚芳垸基或经取代亚芳烷基;B为可选的且当存在时，其为选自由以下基团组成的群组的连接基低碳亚垸基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂垸基、经取代低碳亚杂垸基、-o-、-o-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-s-、-s-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-s(o)k-(其中k为l、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-単')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、画C(R')2-N二N國和-C(R')2-N(R')-N(R')-，其中各R'独立地为H、垸基或经取代垸基；R为H、垸基、经取代垸基、环垸基或经取代环烷基；R!为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。此外，包括具有式(XII)结构的以下氨基酸B为可选的且当存在时，其为选自由以下基团组成的群组的连接基低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂垸基、经取代低碳亚杂垸基、-O-、-O-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(0)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')-、-NR'-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')-N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-(3(11')2^=^和-<:(11')2^(11')^(11')-，其中各R'独立地为H、烷基或经取代垸基；R为H、烷基、经取代垸基、环垸基或经取代环垸基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；其中各Ra独立地选自由H、卤素、垸基、经取代烷基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k为1、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中各R'独立地为H、烷基或经取代垸基。此外，包括以下氨基酸保护、视情况氨基和羧基都经保护，或为其盐。此外，可将这些非天然氨基酸和任何以下非天然氨基酸并入非天然氨基酸多肽中。此外，包括具有式(XIII)结构的以下氨基酸其中B为可选的且当存在时，其为选自由以下基团组成的群组的连接基低碳亚垸基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂垸基、经取代低碳亚杂垸基、-O-、-O-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚垸基)-、-S(0)k-(其中k为l、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚垸基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-N(R')-、-NR'-(亚垸基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R')-、-CON(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R')-、-CSN(R')-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R')CO-(亚垸基或经取代亚垸基)-、-N(R')C(O)O-、-S(0)kN(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(S)N(R')-、-N(R')S(0)kN(R')-、-N(R')-N=、-C(R')=N-、-C(R')=N-N(R')-、-C(R')=N-N=、-C(R')2-N=N^tl-C(R')2-N(R')-N(R')-,其中各R'独立地为H、垸基或经取代垸基；R为H、烷基、经取代烷基、环垸基或经取代环烷基；^为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经(XIII)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage70</formula>R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k为l、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中各R'独立地为H、烷基或经取代烷基，且n为0到8。此外，包括以下氨基酸和1.，其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基和羧基都经保护，或为其盐。此外，可将这些非天然氨基酸和任何以下非天然氨基酸并入非天然氨基酸多肽中。此外，包括具有式(XIV)结构的以下氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula>其中A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚垸基、经取代低碳亚垸基、低碳亚环垸基、经取代低碳亚环垸基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂垸基、低碳亚杂环垸基、经取代低碳亚杂环垸基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚垸芳基、亚芳垸基或经取代亚芳垸基；R为H、烷基、经取代垸基、环烷基或经取代环垸基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；X！为C、S或S(O);且L为亚垸基、经取代亚垸基、N(R')(亚垸基)或N(R')(经取代亚烷基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。此外，包括具有式(XIV-A)结构的以下氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>其中A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚垸基、低碳亚环垸基、经取代低碳亚环垸基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂垸基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环垸基、经取代低碳亚杂环垸基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚烷芳基、亚芳垸基或经取代亚芳烷基；R为H、烷基、经取代垸基、环烷基或经取代环烷基；R,为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；L为亚垸基、经取代亚烷基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚垸基)，其中R'为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。此外，包括具有式(XIV-B)结构的以下氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>其中:A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚垸基、经取代低碳亚垸基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环垸基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂垸基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环垸基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚垸芳基、亚芳烷基或经取代亚芳垸基；R为H、垸基、经取代垸基、环垸基或经取代环垸基；R!为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula>R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；L为亚垸基、经取代亚烷基、N(R')(亚垸基)或N(R')(经取代亚垸基)，其中R'为H、垸基、经取代烷基、环烷基或经取代环垸基。此外，包括具有式结构的以下氨基酸A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环垸基、经取代低碳亚环垸基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂垸基、经取代亚杂垸基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚烷芳基、亚芳垸基或经取代亚芳垸基；R为H、垸基、经取代垸基、环垸基或经取代环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；Xi为C、S或S(O);且n为0、1、2、3、4或5;且各CR8R9基团上的各R8和R9独立地选自由H、烷氧基、垸基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组；或者任何RS和R9可一起形成=0或环垸基，或任何与RS基团相邻者可一起形成环垸基。此外，包括具有式(XV-A)结构的以下氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>其中A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚垸基、经取代低碳亚垸基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂垸基、低碳亚杂环垸基、经取代低碳亚杂环垸基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚垸芳基、亚芳垸基或经取代亚芳垸基；R为H、垸基、经取代垸基、环烷基或经取代环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；n为0、1、2、3、4或5;且各CR8R9基团上的各R8和R9独立地选自由H、烷氧基、垸基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组；或者任何RS和W可一起形成zO或环烷基，或任何与RS基团相邻者可一起形成环烷基。此外，包括具有式(XV-B)结构的以下氨基酸其中A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚垸基、经取代低碳亚垸基、低碳亚环垸基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂垸基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚烷芳基、亚芳垸基或经取代亚芳烷基；R为H、垸基、经取代垸基、环烷基或经取代环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；n为0、1、2、3、4或5;且各CR8R9基团上的各R8和R9独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组；或者任何118和^可一起形成=0或环垸基，或任何与RS基团相邻者可一起形成环烷基。此外，包括具有式(XVI)结构的以下氨基酸R,HNC(0)R2(XVI),其中-A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂垸基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚垸芳基、亚芳垸基或经取代亚芳垸基；R为H、烷基、经取代垸基、环烷基或经取代环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；Xi为C、S或S(O);且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R')(亚垸基)或N(R')(经取代亚垸基)，其中R'为H、垸基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。此外，包括具有式(XVI-A)结构的以下氨基酸R<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚垸基、经取代低碳亚垸基、低碳亚环垸基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂垸基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环垸基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚垸芳基、亚芳垸基或经取代亚芳垸基；R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；L为亚烷基、经取代亚垸基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚垸基)，其中R'为H、垸基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。此外，包括具有式(XVI-B)结构的以下氨基酸其中A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚烷基、经取代低碳亚垸基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂垸基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环垸基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚垸芳基、亚芳烷基或经取代亚芳垸基；R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；L为亚烷基、经取代亚垸基、N(R')(亚烷基)或N(R')(经取代亚垸基)，其中R'为H、垸基、经取代烷基、环垸基或经取代环垸基。此外，包括具有式(XVII)结构的氨基酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>其中-A为可选的，并且当存在时，其为低碳亚垸基、经取代低碳亚垸基、低碳亚环垸基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂垸基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环垸基、经取代低碳亚杂环垸基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚垸芳基、经取代亚垸芳基、亚芳垸基或经取代亚芳垸基；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>其中(a)表示与A基团键结且(b)表示与个别羰基键结，R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环垸基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；R为H、卤素、烷基、经取代垸基、环烷基或经取代环烷基；T3为键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代垸基、环烷基或经取代环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。此外，包括具有式(XVIII)结构的氨基酸(XVIII)，其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage78</formula>，其中(a)表示与A基团键结且(b)表示与个别羰基键结，R3和R4独立地选自H、卤素、垸基、经取代垸基、环烷基或经取代环烷基，或者R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环垸基或杂环烷基；R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；丁3为键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、垸基、经取代垸基、环垸基或经取代环烷基；Ri为可选的且当存在时，其为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且R2为可选的且当存在时，其为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；各Ra独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R')2、-C(0)kR'(其中k为1、2或3)、-C(0)N(R')2、-OR'和-S(O)kR'组成的群组，其中各R'独立地为H、垸基或经取代垸基。此外，包括具有式(XIX)结构的氨基酸其中R为H、卤素、垸基、经取代烷基、环烷基或经取代环垸基；且T3为O或S。此外，包括具有式(XX)结构的氨基酸O(XX),其中-R为H、卤素、垸基、经取代垸基、环垸基或经取代环垸基。此外，包括具有式(XXI)结构的以下氨基酸对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人,.Biochemistry42:6735-6746(2003)中，其以引用的方式并入。所属领域技术人员可类似地制备其它含有羰基或二羰基的氨基酸。参看美国专利第7,083,970号的图4、24-34和36-39，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，对包含非天然氨基酸的多肽进行化学修饰以产生反应性羰基或二羰基官能团。举例来说，可用于连结反应的醛官能团可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生。当生物活性分子为多肽时，例如可使用N末端丝氨酸或苏氨酸(其通常存在或者可经由化学或酶促消化暴露)以在温和氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参看Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3:262-268(1992);Geoghegan,K.&Stroh，J.，Bioconjug.Chem.3:138-146(1992);Gaertner等人，J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而，所属领域已知的方法局限于肽或蛋白质N末端处的氨基酸。在本发明中，可将具有相邻羟基和氨基的非天然氨基酸以"经遮蔽"醛官能团的形式并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸具有与s胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下加入摩尔过量的偏高碘酸钠以避免多肽内其它位点处的氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型的反应涉及将约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠加入多肽缓冲溶液中，随后在暗处培育约IO分钟。例如参看美国专利第6,423,685号。羰基或二羰基官能团可与含羟胺的试剂在温和条件下于水溶液中选择性反应以形成在生理条件下稳定的相应躬键。例如参看Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959);Shao,J.和Tam,J.P.，J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基或二羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。例如参看Comish,V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996);Geoghegan，K.F.&Stroh,J.G.，Bioconjug.Chem.3:138-146(1992);Mahal,L.K.等人,Science276:1125-1128(1997)。非天然氨基酸的结构和合成含羟胺氨基酸美国临时专利申请案第60/638,418号是以全文引用的方式并入本文中。因此，美国临时专利申请案第60/638,418号中第V节(名为"Non-naturalAminoAcids")第B部分(名为"StructureandSynthesisofNon-NaturalAminoAcids:Hydroxylamine-ContainingAminoAcids")中所提供的揭示内容完全适用于制备、纯化、表征和使用本文所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰非天然氨基酸多肽的方法、组合物(包括式I-XXXV)、技术和策略，其程度就如同所述揭示内容完全提供于本文中一般。非天然氨基酸的化学合成适用于本发明中的许多非天然氨基酸例如可从Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee,WI,USA)购得。视情况根据本文所提供或根据各种公开案所提供或者使用所属领域技术人员已知的标准方法合成非市售的非天然氨基酸。有关有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon的OrganicChemistry(1982，第2版,WillardGrantPress,BostonMass.);March的AdvancedOrganicChemistry(第3版,1985,WileyandSons,NewYork);以及Carey和Sundberg的AdvancedOrganicChemistry(第3版，第A部分和第B部分，1990,PlenumPress,NewYork)。描述非天然氨基酸的合成的其它公开案例如包括名为"InvivoincorporationofUnnaturalAminoAcids"的WO2002/085923;Matsoukas等人，(1995)J.Med.Chem.,38,4660-4669;King,F.E.&Kidd,D.A.A.(1949)乂Wewo/G/w^wm>2eo/y層Z)z》epnWeso/G/w^wwic爿czW々ow尸/^/^/flfe(i/wferwecf/aMs.J.Chem.Soc.3315-3319;Friedman,01&Chatterrji，R.(1959)5>wtefso/Dm'va"veso/G/i^fl附/weawJWbc/e/5^6j/n^es/orJw//-7i/mor爿gew^s.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752;Craig,J.C.等人(1988)乂&soh^eCo"力gwna"'owo/五wawO'owe;yo/7-C7z/oro-4//^-(^//e^z_y/aw/wo/)-/-we^ziy/Z>w/y/_/a7m'"o7《wz>2o//wefC7j/oro《w/we/J.Org.Chem.53，1167-1170;Azoulay，M.，Vilmont,M.&Frappier,F.(1991)G7w/歸/wecma/ogwesayPWe油'fl/爿""'/wa/ar/我Eur.J.Med.Chem.26,201-5;Koskinen,A.M.P.&Rapoport，H.(1989)5[y"^ze57^so/4-SwZw/7Yi^edPnZ/wes<xyCo"/orma"owa//_yC0"5fn3/wec/爿w/woJczW爿"a/ogw仏J.Org.Chem.54,1859-1866;Christie,B.D.&Rapoport,H.(1985)0/Pprica/Z少PwreP^eco/flto/rowZ-A戸rag/"e.4PP//cWowto7bfa/5ywAe57\y0/r+j-Jpov/wcaTK/we^zrowg7z乂w/woJczV/Z)eco7"6owy/a"owafwd/w/w/w附/owC_yc//za"ow.J.Org.Chem.50:1239-1246;Barton等人，(1987)0/iVovWa/;;w-^m/"o-v4c/必awdi-a//7ha-awiwo/7/we/icJcidaweJ/^pro/^/flfe[7"sa/wra^edDer/vrtZ/ves.Tetrahedron43:4297-4308;禾口Subasinghe等人,(1992)jgw/wwaZ/cac/dawa/ogww，//2es7'so/6e/a-h"eroc>>c/z'c2-譜iwopro/7朋o/cac/ddm'va"'vesamiAez'ra"/w7^aawove/《w'5^Ma/a^e-MW57'"zef/s"e.J.Med.Chem.35:4602-7。还参看名为"ProteinArrays，，的美国专利公开案第US2004/0198637号，其以引用的方式并入本文中。A.羰基反应性基团具有羰基反应性基团的氨基酸允许尤其经由亲核加成或醛醇縮合反应键联分子(包括(但不限于)PEG或其它水溶性分子)的多种反应。例示性含羰基氨基酸可如下所示其中n为0-10;Ri为烷基、芳基、经取代垸基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为l，Ri为苯基且R2为简单垸基(即，甲基、乙基或丙基)并且酮部分相对于烷基侧链位于对位。在一些实施例中，n为l，Ri为苯基且R2为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)并且酮部分相对于垸基侧链位于间位。对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人，Biochemistry42:6735-6746(2003)中，其以引用的方式并入。所属领域技术人员可类似地制备其它含羰基氨基酸。在一些实施例中，对包含非天然编码的氨基酸的多肽进行化学修饰以产生反应性羰基官能团。举例来说，可用于连结反应的醛官能团可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生。当生物活性分子为多肽时，例如可使用N末端丝氨酸或苏氨酸(其通常存在或者可经由化学或酶促消化暴露)以在温和氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参看Gaertner等人，5z'o，wg.C/亂3:262-268(1992);Geoghegan,K.&Stroh,J.,5/oco">g.C&w.3:138-146(1992);Gaertner等人，说o/.C/iem.269:7224-7230(1994)。然而，所属领域已知的方法局限于肽或蛋白质N末端处的氨基酸。在本发明中，可将具有相邻羟基和氨基的非天然编码的氨基酸以"经遮蔽"醛官能团的形式并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸具有与e胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下加入摩尔过量的偏高碘酸钠以避免多肽内其它位点处的氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型的反应涉及将约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠加入多肽缓冲溶液中，随后在暗处培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号，其以引用的方式并入本文中。羰基官能团可与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂在温和条件下于水溶液中选择性反应以分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或縮氨基脲键。例如参看Jencks,W.P.，/4m.C/ze肌Soc.81,475-481(1959);Shao,J.和Tarn,J.P.,丄乂m.Che附.Soc.117:3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。伊J如参看Cornish,V.W.等人,爿m.C/e附.Soc.118:8150-8151(1996);Geoghegan,K.F.&Stroh,J.G"说oco"y"g.C/ze附.3:138-146(1992);Mahal,L.K.等人，Sc/ewce276:1125-1128(1997)。B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团含有亲核基团(诸如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码的氨基酸允许与各种亲电基团反应以形成连结物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物的连结物)。例示性含肼、酰肼或氨基脲氨基酸可如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>(CH2)nRfX-C(0)-NH-HN2其中n为0-10;Ri为垸基、芳基、经取代垸基或经取代芳基或不存在；X为0、N、S或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为4，Ri不存在且X为N。在一些实施例中，n为2，&不存在且X不存在。在一些实施例中，n为l，R!为苯基，X为O且氧原子位于芳环上脂肪族基团的对位。含酰肼、肼和氨基脲的氨基酸可从商业来源购得。举例来说，L-谷氨酸-Y-酰肼可购自SigmaChemical(St.Louis，MO)。其它非市售氨基酸可由所属领域技术人员制备。例如参看美国专利第6,281,211号，其以引用的方式并入本文中。含有具有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码的氨基酸的多肽可有效且选择性地与含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的多种分子反应。例如参看Shao,J.和Tam:J.,J!乂m.C/ie肌Soc.117:3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括(但不限于)丝氨酸或苏氨酸的羟基，或赖氨酸和N末端氨基)相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其能够对醛、酮和其它亲电基团明显更具反应性。C.含氨氧基氨基酸含有氨氧基(也称为羟胺)的非天然编码的氨基酸允许与各种亲电基团反应以形成连结物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物的连结物)。与肼、酰肼和氨基脲类似，增强氨氧基的亲核性使其能够有效且选择性地与含有醛或其它具有类似化学反应性的官能团的多种分子反应。例如参看Shao,J.和Tam，J.，/j附.C/ze加.Soc.117:3893-3899(1995);H.Hang和C.Bertozzi，C/zew.i仏34:727-736(2001)。与肼基的反应结果为相应腙，而肟通常是由氨氧基与含羰基基团(诸如酮)反应得到。例示性含氨氧基氨基酸可如下所示.-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>其中n为0-10;A为垸基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10;Y为K:(O)或不存在；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为l，Rj为苯基，X为O，m为l且Y存在。在一些实施例中，n为2，Ri和X不存在，m为0且Y不存在。含氨氧基氨基酸可由容易得到的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸和苏氨酸)制备。例如参看M.Carrasco和R.Brown,Og.C/ze附.68:8853-8858(2003)。己从天然来源中分离出某些含氨氧基氨基酸，诸如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸(Rosenthal,G，LifeSci.60:1635-1641(1997))。所属领域技术人员可制备其它含氨氧基氨基酸。D.叠氮基和炔反应性基团叠氮基和炔官能团的独特反应性使其对选择性修饰多肽和其它生物分子特别有用。有机叠氮化物(尤其脂肪族叠氮化物)和炔通常对常用的化学反应条件稳定。具体说来，叠氮基和炔官能团对天然存在的多肽中所见的20种常见氨基酸的侧链(即，R基)呈惰性。然而，当极其接近时，呈现叠氮基和炔基的"弹簧负荷(spring-loaded)"特性且其经由Huisgen[3+2]环加成反应选择性且有效地反应以产生相应三唑。例如参看ChinJ.等人，301:964-7(2003);Wang,Q.等人，/j附.C7组Soc.125,3192-3193(2003);Chin，J.W.等人，j:爿m.C/e肌Soc.124:9026-9027(2002)。由于Huisgen环加成反应涉及选择性环加成反应(例如参看Padwa，A.，COMPREHENSIVEORGANICSYNTHESIS,第4巻，(Trost,B.M.编，1991),第1069-1109页；Huisgen,R.1,3-DipolarCycloadditionChemistry,(Padwa,A.编，1984),第1-176页)而非亲核取代，因此并入具有含叠氮基和炔侧链的非天然编码的氨基酸允许在非天然编码的氨基酸位置处对所得多肽进行选择性修饰。可在室温下于水性条件下，通过在存在将Cu(II)还原成Cu(I)的还原剂的情况下，加入催化量的Cu(II)(包括(但不限于)催化量CuS04的形式)于原位进行涉及含叠氮基或炔的多肽的环加成反应。例如参看Wang,Q.等人，乂Xm.C&附.Soc.125,3192-3193(2003);Tornoe,C.W.等人，Og.C/zew.67:3057-3064(2002);Rostovtsev等人，C/ze肌/"A五d41:2596-2599(2002)。例示性还原剂包括(包括(但不限于))抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、(:02+和所施加的电势。在一些情况下，在需要叠氮基与炔之间的Huisgen[3+2]环加成反应的情况下，多肽包含包括炔部分的非天然编码的氨基酸，且将与所述氨基酸连接的水溶性聚合物包含叠氮基部分。或者，还可进行相反反应(即，氨基酸上的叠氮基部分与存在于水溶性聚合物上的炔部分)。叠氮基官能团还可与含有芳基酯的水溶性聚合物选择性反应且经芳基膦部分适当官能化从而产生酰胺键。芳基膦基于原位还原叠氮基，且随后所得胺与邻近酯键有效反应以产生相应酰胺。例如参看E.Saxon和C.Bertozzi，Sc/ewce287,2007-2010(2000)。含叠氮基氨基酸可为垸基叠氮化物(包括(但不限于)2-氨基-6-叠氮基-l-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基苯丙氨酸)。含有芳基酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下所示其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，.W为水溶性聚合物，且R可为H、垸基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、陽NR'R"、-SR'、-卣素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、.CN和-N02。R'、R"、R"'和R""各自独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)经l-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的垸基、烷氧基或硫垸氧基或芳基垸基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R"、R"'和R""基团一样独立地选择。当R'与R"连接到同一氮原子时，其可与氮原子组合形成5、6或7元环。举例来说，-NR'R"意欲包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据上述有关取代基的论述，所属领域技术人员将了解，术语"垸基"意欲包括包含与除氢基外的基团结合的碳原子的基团，诸如卣垸基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(0)CH3、-C(0)CF3、-C(0)CH20CH3等)。叠氮基官能团还可与含有硫酯的水溶性聚合物选择性反应且经芳基膦部分适当官能化从而产生酰胺键。芳基膦基于原位还原叠氮基，且随后所得胺与硫酯键有效反应以产生相应酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage85</formula>、其中n为l-10;X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。例示性含炔氨基酸可如下所示其中n为0-10;R!为垸基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为0、N、S或不存在；m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，Ri为苯基，X不存在，m为O且乙炔部分相对于烷基侧链位于对位。在一些实施例中，n为1，Rt为苯基，X为O，m为1且炔丙基氧基相对于院基侧链位于对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n为l,R,和X不存在，且m为0(即，炔丙基甘氨酸)。含炔氨基酸在市面上有售。举例来说，炔丙基甘氨酸可购自Peptech(Burlington,MA)。或者，可根据标准方法制备含炔氨基酸。举例来说，可例如根据Deiters,A.等人,,Jm.C&附.Soc.125:11782-11783(2003)中所述合成对炔丙基氧基苯丙氨酸，并且可根据Kayser,B.等人，re&a/je&o"53(7):2475-2484(1997)中所述合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域技术人员可制备其它含炔氨基酸。例示性含叠氮基氨基酸可如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage86</formula>其中n为0-10;Ri为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，Ri为苯基，X不存在，m为0且叠氮基部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为0-4且&和X不存在，且mK)。在一些实施例中，n为l，Ri为苯基，X为O，m为2且卜叠氮基乙氧基部分相对于烷基侧链位于对位。含叠氮基氨基酸可从商业来源购得。举例来说，4-叠氮基苯丙氨酸可从Chem-ImpexInternational,Inc.(WoodDale,IL)获得。对于非市售的含叠氮基氨基酸来说，可使用所属领域技术人员己知的标准方法(包括(但不限于)经由置换适当离去基团(包括(但不限于)卤基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基)或经由使经适当保护的内酯开环)相对容易地制备叠氮基。例如参看March的AdvancedOrganicChemistry(第3版，1985，WileyandSons,NewYork)。E.氨基硫醇反应性基团(3取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使其对经由形成噻唑烷选择性修饰含有醛基的多肽和其它生物分子特别有用。例如参看J.Shao和J.Tam，/j/n.CAe/w.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施例中，可将P取代的氨基硫醇氨基酸并入多肽中且随后与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，可经由形成噻唑烷将水溶性聚合物、药物连结物或其它有效负荷与包含P取代的氨基硫醇氨基酸的多肽偶合。非天然氨基酸的细胞摄取细胞对非天然氨基酸的摄取是在设计和选择(包括(但不限于))并入蛋白质中的非天然氨基酸时通常考虑的一个问题。举例来说，a-氨基酸的高电荷密度表明这些化合物可能无法渗透细胞。天然氨基酸是经由一系列基于蛋白质的转运系统吸收到真核细胞中。可进行快速筛选以评定哪些非天然氨基酸(如果存在)被细胞吸收。例如参看，例如名为"ProteinArrays"的美国专利公开案第US2004/0198637号(其以引用的方式并入本文中)以及Liu,D.R.&Schultz,P.G.(1999)iVogmwfow"Wevo/w"o"o/a"orgam'^wz7/z朋e，w<^gew"z'cco血PNASUnitedStates96:4780-4785中的毒性检定。尽管易于利用各种检定分析摄取，但设计适用于细胞摄取路径的非天然氨基酸的替代方法是提供生物合成路径以在活体内产生氨基酸。非天然氨基酸的生物合成许多生物合成路径已存在于细胞中以供产生氯基酸和其它化合物。特定非天然氨基酸的生物合成方法可能不存在于自然界(包括(但不限于)细胞)中，而本发明提供所述方法。举例来说，视情况在宿主细胞中通过加入新颖酶或改变现存的宿主细胞路径来产生非天然氨基酸的生物合成路径。其它新颖酶视情况为天然存在的酶或人工开发的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如名为"Invivoincorporationofunnaturalaminoacids"的WO2002/085923中的实例所提供)依赖于加入来自其它有机体的已知酶的组合。可通过用包含这些酶的基因的质粒转化细胞来将所述基因引入真核细胞中。当在细胞中表达时，这些基因提供合成所需化合物的酶促路径。视情况加入的酶类型的实例提供于以下实例中。其它酶序列见于例如Genbank中。也视情况以相同方式将人工开发的酶加入细胞中。以此方式，操作细胞机器和细胞资源以产生非天然氨基酸。多种方法可用于产生用于生物合成路径或发展现存路径的新颖酶。举例来说，视情况将(包括(但不限于))如Maxygen,Inc.所开发的递归重组(recursiverecombination)(可在万维网www.maxygen.com上获得)用于开发新颖酶和路径。例如参看Stemmer(1994),ia/zWevo/Wowo/a/raW"vzYroZWJ57m萝wg,Nature370(4):389-391;禾口Stemmer,(1994),ZWJs/m,wgnawcfow女agwew加/owawdreawe附6(y:/"v/加recow6/wa"ow/or/wo/ecM/arevo/w"'ow,Proc.Natl.Acad.Sci.USA..91:10747-10751。类似地，视情况将Genencor(可在万维网genencor.com上获得)开发的DesignPathTM用于代谢路径工程改造，包括(但不限于)工程改造路径以在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸。这项技术使用新基因(包括(但不限于)通过功能基因组学以及分子进化和设计所鉴别的基因)的组合在宿主有机体中重建现存路径。Diversa公司(可在万维网diversa.com上获得)也提供有关迅速筛选基因文库和基因路径(包括(但不限于)建立新路径)的技术。通常，利用本发明的经工程改造的生物合成路径产生的非天然氨基酸是以足以有效蛋白质生物合成(包括(但不限于)天然细胞量)但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度来产生。在活体内以此方式产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。在用包含用于产生特定路径所需的酶的基因的质粒转化细胞并且产生非天然氨基酸后，视情况使用活体内选择以针对核糖体蛋白质合成和细胞生长进一步优化非天然氨基酸产生。具有非天然氨基酸的多肽可并入非天然氨基酸达成多个目的，包括(但不限于)定制蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键、疏水性、蛋白酶靶位点的可接近性；靶向部分(包括(但不限于)对于蛋白质阵列来说)；加入生物活性分子；连接聚合物；连接放射性核素；调节血清半衰期；调节组织渗透(例如肿瘤)；调节活性输送；调节组织、细胞或器官特异性或分布；调节免疫原性；调节蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有增强的或甚至全新的催化或生物物理特性。举例来说，视情况通过将非天然氨基酸包涵入蛋白质内来改变以下特性毒性、生物分布、结构特性、光谱特性、化学和/或光化学特性、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应(包括(但不限于)共价或非共价)的能力等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物可用于(包括(但不限于))新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白质(包括(但不限于)抗体)以及(包括(但不限于))蛋白质结构和功能研究。例如参看Dougherty,(2000)C/nwa^/ra/j/w/woos1iVo6esPra^/w5^w"wreawdFw""/o",CurrentOpinioninChemicalBiology.4:645-652。在本发明一方面中，组合物包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或更多)非天然氨基酸的蛋白质。非天然氨基酸可相同或不同，包括(但不限于)蛋白质中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同位点可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同非天然氨基酸。另一方面，组合物包括蛋白质中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上非天然氨基酸的指定蛋白质来说，非天然氨基酸可相同或不同(包括(但不限于)所述蛋白质可包括两个或两个以上不同类型的非天然氨基酸，或可包括相同非天然氨基酸中的两个)。对于具有两个以上非天然氨基酸的指定蛋白质来说，非天然氨基酸可相同、不同或为多个相同种类的非天然氨基酸与至少一个不同非天然氨基酸的组合。具有至少一个非天然氨基酸的所关注的蛋白质或多肽为本发明的特征。本发明还包括使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包括(但不限于)医药学上可接受的赋形剂)也可与蛋白质一起存在。通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的所关注蛋白质或多肽，蛋白质或多肽通常将包括真核翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在活体内所作的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰不是由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰包括(包括(但不限于))糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等。一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键连接寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))与天冬酰胺。参看表l，其列出真核蛋白质的N键联寡糖的一些实例(也可存在其它未展示的残基)。另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键或者GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键将寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接在一起。表l:通过GlcNAc-键连接的寡糖的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>木糖德na1-6、、Man卩1"4GlcNA邻1"4GlcNAcp1-AsnXylp1-2-—另一方面，翻译后修饰包括前体(包括(但不限于)降钙素前体、降钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解处理；组装成多亚单元蛋白质或大分子组装物；在细胞中另一位点(包括(但不限于)细胞器，诸如内质网、高尔基体(golgiapparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等，或通过分泌途径)处翻译。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、表位标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。美国专利第4,963,495号和第6,436,674号(以引用的方式并入本文中)详述经设计以改进GH(例如hGH)多肽的分泌的构筑体。非天然氨基酸的一个优势在于，其提供可用于添加额外分子的额外化学部分。这些修饰可在真核或非真核细胞活体内进行或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电反应进行。当前用于选择性修饰蛋白质的大部分反应涉及亲核与亲电反应搭配物之间共价键的形成，包括(但不限于)a-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况中，选择性是由蛋白质中亲核残基的数量和可接近性决定。在本发明的蛋白质中，可在活体外或活体内使用其它更具选择性的反应，诸如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。例如参看Cornish等人，(1996)J.Am.Chem.Soc.,118:8150-8151;Mahal等人，(1997)Science,276:1125-1128;Wang等人，(2001)Science292:498-500;Chin等人，(2002)LAm-Chem.Soc.124:9026-9027;Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,99:11020-11024;Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci,100:56-61;Zhang等人，(2003)Biochemistry.42:6735-6746;和Chin等人，(2003)Science.301:964-7，所有所述文献都以引用的方式并入本文中。这使得能够用包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子的多种试剂选择性标记几乎任何蛋白质。还参看名为"Glycoproteinsynthesis"的美国专利第6,927,042号，其以引用的方式并入本文中。翻译后修饰(包括(但不限于)通过叠氮基氨基酸)也可通过施陶丁格接合(Staudingerligation)(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。例如参看Kiick等人,(2002)/"coA7om"'owo/azz'^sz'wforeco附6/wawfp,o/"e//w/orc/ze/wose/e"/ve歸d(/ca"'ow//ze//g她'o"'PNAS99:19-24。本发明提供另一种选择性修饰蛋白质的极为有效的方法，其涉及响应选择密码子将(包括(但不限于))含叠氮基或炔基部分的非天然氨基酸遗传并入蛋白质中。随后通过(包括(但不限于))Huisgen[3+2]环加成反应(例如参看Padwa,A.ComprehensiveOrganicSynthesis,第4巻.(1991)Trost，B.M.编，Pergamon,Oxford,第1069-1109页；和Huisgen:R.1,3-DipolarCvcloadditionChemistry.(1984)Padwa,A.编，Wiley,NewYork,第1-176页)分别用(包括(但不限于))炔基或叠氮基衍生物来修饰这些氨基酸侧链。由于此方法涉及环加成而非亲核取代反应，故可以极高的选择性修饰蛋白质。可在室温下于水性条件中通过将催化量的Cu(I)盐加到反应混合物中而以优良的区位选择性(1,4>1,5)进行所述反应。例如参看Tornoe等人，(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064:和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。可使用的另一方法是具有四半胱氨酸基元的双砷化合物的配体交换，例如参看Griffin等人，(1998、Science281:269-272。可通过[3+2]环加成反应加到本发明的蛋白质中的分子包括几乎任何具有叠氮基或炔基衍生物的分子。分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇衍生物)、光交联剂、细胞毒性化合物、亲和标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、聚核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。可将这些分子分别加到具有炔基(包括(但不限于)对炔丙基氧基苯丙氨酸)或叠氮基(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)的非天然氨基酸中。V.活体内产生包含非基因编码的氨基酸的多肽可使用经修饰tRNA和tRNA合成酶在活体内产生本发明的多肽以加入或取代天然存在的系统中不编码的氨基酸。使用天然存在的系统中不编码的氨基酸产生tRNA和tRNA合成酶的方法描述于例如美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中，其以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于对于翻译系统为内源性的合成酶和tRNA起作用(且因此有时称为"正交")的翻译机器。通常，翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS优先使翻译系统中具有至少一个非天然存在的氨基酸的O-tRNA氨酰基化，并且O-tRNA识别至少一个不被所述系统中的其它tRNA所识别的选择密码子。因此，翻译系统响应所编码的选择密码子将非天然编码的氨基酸插入所述系统中产生的蛋白质中，从而将氨基酸"取代"入所编码多肽的一定位置中。所属领域中已描述用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，并且其通常遗用于本发明中。举例来说，酮基特异性0-tRNA/氨酰基tRNA合成酶描述于Wang,L等人，iVoc.A^/.^cad100:56-61(2003)和Zhang,Z.等人,5/oc&附.42(22):6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由聚核苷酸序列编码并且包括美国专利第7，045，337号和第7,083,970号(各自以引用的方式并入本文)中所揭示的氨基酸序列。与O-RS—起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中，其以引用的方式并入本文中。叠氮基特异性0-tRNA/氨酰基tRNA合成酶系統的实例描述于Chin,J.W.等人，《/.C/zew.124:9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的例示性O-RS序列包括(但不限于)如美国专利第7,083,970号(其以引用的方式并入本文中)中所揭示的核苷酸序列SEQIDNO:14-16和29-32以及氨基酸序列SEQIDNO:46-48和61-64。适用于本发明中的例示性O-tRNA序列包括(但不限于)如美国专利第7,083,970号中所揭示的核苷酸序列SEQIDNO:1-3，所述专利以引用的方式并入本文中。对特定非天然编码的氨基酸具特异性的O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶对的其它实例描述于美国专利第7,045,337号中，其以引用的方式并入本文中。在酿酒酵母中并入含酮基氮基酸与含叠氮基氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin,J.W.等人，Sc/e"ce301:964-967(2003)中。已报导若干种其它正交对。已针对大肠杆菌中非天然氨基酸的可能并入描述自酿酒酵母tRNA和合成酶获得的谷氨酰基(例如参看Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:4780-4785)、天冬氨酰基(例如参看Pastrnak,M.等人，(2000)Helv.Chim.Acta83:2277-2286)和酪氨酰基(例如参看Ohno,S.等人，(1998)J.Biochem.(Tokyo,Jpn.)124:1065-1068;和Kowal,A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273)系统。也已描述自大肠杆菌谷氨酰基(例如参看Kowal,A.K.等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-227)和酪氨酰基(例如参看Edwards,H.和Schimmel,P.(1990)Mol.Cell.Biol.10:1633-1641)合成酶获得的系统以用于酿酒酵母中。已使用大肠杆菌酪氨酰基系统在活体内将3-碘-L-酪氨酸并入哺乳动物细胞中。参看Sakamoto,K.等人，(2002)NucleicAcidsRes.30:4692-4699。使用O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶涉及选择编码非天然编码的氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子，但一般需要选择很少或从未用于表达O-tRNA/氨酰基tRNA合成酶的细胞中的密码子。举例来说，例示性密码子包括无义密码子，诸如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石)；四个或四个以上碱基的密码子；和稀有或未经使用的其它天然的三碱基密码子。可使用所属领域中己知的诱变方法(包括(但不限于)位点特异性诱变、盒式诱变、限制性选择诱变等)将特定的选择性密码子引入聚核苷酸编码序列的适当位置中。用于产生可用于并入非天然编码的氨基酸的蛋白质生物合成机器组件(诸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于Wang,L.等人，Scfe"ce292:498-500等人，」附.C/ze附.Soc.124:卯26-9027(2002);Zhang,Z等人,Bioc^脂'Wry42:6735-6746(2003)中。用于活体内并入非天然编码的氨基酸的方法和组合物描述于美国专利第7,045,337号中，其以引用的方式并入本文中。用于选择在有机体活体内翻译系统中使用的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中，所述专利以引用的方式并入本文中。名为"SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins"的PCT公开案第WO04/035743号(其以全文引用的方式并入本文中)描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。名为"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公开案第WO04/094593号(其以全文引用的方式并入本文中)描述用于将非天然编码的氨基酸并入真核宿主细胞中的正交RS和tRNA对。产生至少一种重组正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的方法包含(a)由第一有机体产生来源于至少一种氨酰基tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS文库，所述第一有机体包括(但不限于)原核有机体(诸如詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲垸杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌或极端嗜热细菌等)或真核有机体；(b)在RS(视情况突变RS)文库中选择(和/或筛选)在存在非天然编码的氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS的集合；和/或(c)在所述集合中选择(视情况通过阴性选择)在不存在非天然编码的氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(包括(但不限于)突变RS)，从而提供所述至少一种重组O-RS;其中所述至少一种重组O-RS优先使具有非天然编码的氨基酸的O-tRNA氨酰基化。在一个实施例中，RS为无活性RS。可通过使活性RS突变产生无活性RS。举例来说，可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或更多个氨基酸突变成不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生无活性RS。可使用所属领域已知的各种技术产生突变RS文库，所述技术包括(但不限于)基于蛋白质三维RS结构的合理设计，或在随机或合理设计技术中RS核苷酸的诱变。举例来说，可通过位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构筑体、合理设计和本文所述或所属领域已知的其它方法产生突变RS。在一个实施例中，在RS(视情况突变RS)的文库中选择(和/或筛选)(包括(但不限于))在存在非天然编码的氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的活性成员包括将阳性选择或筛选标记(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(视情况突变)RS的文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石密码子)；使所述多个细胞在存在选择剂的情况下生长；通过抑制阳性选择或筛选标记中的所述至少一个选择密码子来鉴别在存在选择剂和/或筛选剂的情况下存活(或显示特异性反应)的细胞，从而提供含有活性(视情况突变)RS的集合的经阳性选择细胞的子集。视情况可改变选择剂和/或筛选剂浓度。一方面，阳性选择标记为氯霉素(chloramphenicol)乙酰基转移酶(CAT)基因且在CAT基因中选择密码子为琥珀终止密码子。视情况，阳性选择标记为P-内酰胺酶基因且在l3-内酰胺酶基因中选择密码子为琥珀终止密码子。另一方面，阳性筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记(包括(但不限于)细胞表面标记)。在一个实施例中，在集合中阴性选择或筛选在不存在非天然编码的氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(视情况突变)包括将阴性选择或筛选标记与来自阳性选择或筛选的活性(视情况突变)RS的集合引入第二有机体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，其包括(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；以及鉴别在补充有非天然编码的氨基酸和筛选剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应，但在未补充非天然编码的氨基酸和选择剂或筛选剂的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞，从而提供具有所述至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞。举例来说，CAT鉴别方案在测定适当0-RS重组体时视情况充当阳性选择和/或阴性筛选。举例来说，视情况在存在或不存在一个或一个以上非天然编码的氨基酸的情况下于含有CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆集合。因此认为仅在含有非天然编码的氨基酸的平板上生长的菌落含有重组O-RS。一方面，改变选择(和/或筛选)剂的浓度。在一些方面中，第一与第二有机体不同。因此，第一和/或第二有机体视情况包含原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记。在另一个实施例中，在集合中筛选或选择(包括(但不限于)阴性选择)活性(视情况突变)RS包括自阳性选择步骤(b)分离活性突变RS的集合；将阴性选择或筛选标记和活性(视情况突变)RS的集合引入第二有机体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)包含至少一个选择密码子的毒性标记基因，其包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因)；以及鉴别在未补充非天然编码的氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应，但在补充有非天然编码的氨基酸的第二培养基中不能存活或显示特异性筛选反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞，其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码的氨基酸具特异性。一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。所述实施例视情况可包括其中所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子，且其中第一与第二有机体不同(包括(但不限于)各有机体视情况为(包括(但不限于))原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)的情形。另外，一些方面包括阴性选择标记包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情形。其它方面包括筛选标记视情况包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记的情形。在本文中的实施例中，筛选和/或选择视情况包括筛选和/或选择严格度的变化。在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包含(d)分离所述至少一种重组O-RS;(e)产生来源于所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS(视情况突变)；以及(f)重复步骤(b)和(c)直到获得包含优先使O-tRNA氨酰基化的能力的突变O-RS。视情况，将步骤(d)-(f)重复(包括(但不限于))至少约两次。一方面，可通过诱变(包括(但不限于)随机诱变、位点特异性诱变、重组或其组合)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。上述方法中选择/筛选步骤(包括(但不限于)阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c))的严格度视情况包括改变选择/筛选严格度。在另一个实施例中，阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)包含使用报告基因，其中报告基因是由荧光活化细胞分选法(FACS)检测或其中报告基因是由发光检测。视情况，报告基因是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等且根据涉及非天然编码的氨基酸或类似物的亲和性或催化活性进行选择。在一个实施例中，突变合成酶是展示于细胞表面上、噬菌体展示上等。用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括(a)由第一有机体产生来源于至少一种tRNA(包括(但不限于)抑制tRNA)的突变tRNA文库；(b)在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选在不存在来自第一有机体的RS的情况下由来自第二有机体的氨酰基tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变)tRNA，从而提供tRNA(视情况突变)的集合；以及(c)在所述tRNA(视情况突变)集合中选择或筛选由经引入正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA;其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二有机体的RS有效识别且由O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA为抑制tRNA和/或包含具有天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解在一些实施例中，O-tRNA无需修饰而视情况从第二有机体引入第一有机体中。在各种实施例中，第一与第二有机体相同或不同且视情况选自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲垸杆菌、大肠杆菌、嗜盐菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA是由非天然编码的氨基酸视情况氨酰基化，其中非天然编码的氨基酸是在活体内天然生物合成或通过基因操纵生物合成。视情况将非天然编码的氨基酸加到至少第一或第二有机体的生长培养基中。一方面，在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选由氨酰基-tRNA合成酶氨酰基化的(视情况突变)tRNA(步骤(b))包括将毒性标记基因和(视情况突变)tRNA文库引入来自第二有机体的多个细胞中，其中毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(staticagent)的基因或有机体必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子)；和选择存活细胞，其中存活细胞含有包含至少一个正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况突变)tRNA的集合。举例来说，可通过使用比较比率细胞密度检定来选择存活细胞。另一方面，毒性标记基因可包括两个或两个以上选择密码子。在所述方法的另一个实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶bamase基因视情况可包括两个或两个以上琥珀密码子。在一个实施例中，在(视情况突变)tRNA的集合中选择或筛选由经引入正交RS(O-RS)氨酰基化的成员可包括将阳性选择或筛选标记基因以及O-RS和(视情况突变)tRNA的集合引入来自第二有机体的多个细胞中，其中阳性标记基因包含药物抗性基因(其包括(但不限于)(3-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，诸如至少一个琥珀终止密码子)或有机体必需的基因或使得毒性剂解毒的基因；和鉴别在存在选择剂或筛选剂(包括(但不限于)抗生素)的情况下生长的存活或筛选细胞，从而提供具有所述至少一种重组tRNA的细胞的集合，其中所述至少一种重组tRNA是由O-RS氨酰基化且响应所述至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，改变选择剂和/或筛选剂的浓度。提供用于产生特异性0-tRNA/0-RS对的方法。方法包括(a)由第一有机体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中阴性选择或筛选在不存在来自第一有机体的RS的情况下由来自第二有机体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变)tRNA，从而提供(视情况突变)tRNA的集合；(c)在(视情况突变)tRNA的集合中选择或筛选由经引入正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二有机体的RS有效识别且由O-RS优先氨酰基化。所述方法还包括(d)由第三有机体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库；(e)在突变RS文库中选择或筛选在存在非天然编码的氨基酸和天然氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的成员，从而提供活性(视情况突变)RS的集合；和(f)在所述集合中阴性选择或筛选在不存在非天然编码的氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的活性(视情况突变)RS，从而提供所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然编码的氨基酸具特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS对，诸如mutRNATyr-SS12TyrRS对、mutRNALeu陽mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等。另外，所述方法包括第一与第三有机体相同(包括(但不限于)詹氏甲垸球菌)的情形。本发明中还包括用于选择用于第二有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-氨酰基tRNA合成酶对的方法。所述方法包括将标记基因、tRNA和从第一有机体分离或获得的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二有机体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二有机体的复制细胞组中；和选择在复制细胞组中不能存活的第一组中的存活细胞或筛选显示特异性筛选反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞，其中第一组与复制细胞组是在存在选择剂或筛选剂的情况下生长，其中存活或筛选细胞包含用于第二有机体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括活体内互补检定。可改变选择剂或筛选剂的浓度。本发明的有机体包含多种有机体和多种组合。举例来说，本发明的方法的第一与第二有机体可相同或不同。在一个实施例中，有机体视情况为原核有机体，其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者，有机体视情况包含真核有机体，其包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物，诸如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。在另一个实施例中，第二有机体为原核有机体，其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、嗜盐菌、强烈嗜热球菌、堀越火球菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者，第二有机体可为真核有机体，包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、菌类、哺乳动物细胞等。在各个实施例中，第一与第二有机体不同。VI.多肽中非天然存在的氨基酸的位置本发明涵盖将一个或一个以上非天然存在的氨基酸并入多肽中。可将一个或一个以上非天然存在的氨基酸并入不破坏多肽活性的特定位置处。这可以通过进行"保守"取代实现，包括(但不限于)用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸；用庞大氨基酸取代庞大氨基酸；用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸；和/或将非天然存在的氨基酸插入活性不需要的位置中。举例来说，GH(例如hGH)区域可说明如下，其中hGH中的氨基酸位置在中间行中指示(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2，其以全文引用的方式并入本文中)螺旋A螺旋B螺旋C螺旋D-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]N末端A-B环B-C环C-D环C末端可使用多种生物化学和结构方法来选择多肽内供非天然编码的氨基酸取代的所需位点。所属领域技术人员易于了解，多肽链的任何位置都适合于选择以并入非天然编码的氨基酸，并且选择可建立在合理设计的基础上或者通过随机选择以实现任何或并非特别需要的目的。所需位点的选择可用于产生具有任何所需特性或活性的分子，包括(但不限于)激动剂、超级激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、与结合搭配物结合的调节剂、结合搭配物活性调节剂、结合搭配物构象调节剂；二聚体或多聚体形成；与天然分子相比活性或特性无改变；或者利用多肽的任何物理或化学特性，诸如溶解性、聚集、免疫原性或稳定性。举例来说，可使用所属领域已知的点突变分析、丙氨酸扫描或同系物扫描方法鉴别多肽中为多肽生物活性所需的位置。例如参看Cunningham,B.和Wells，J.，Sdence,244:1081-1085(1989)(鉴别对于GH(例如hGH)的生物活性至关重要的14个残基)和Cunningham,B.等人243:1330-1336(1989)(使用同系物扫描诱变鉴别抗体和受体表位)。美国专利第5,580,723号、第5,834,250号、第6,013,478号、第6,428,954号和第6,451,561号(其以引用的方式并入本文中)描述通过鉴别影响具有耙物质的多肽活性的活性区域系统性分析多肽(诸如hGH)结构和功能的方法。除通过丙氨酸或同系物扫描诱变鉴别为对生物活性至关重要的残基外的残基可视对于多肽所寻求的所需活性而为供非天然编码的氨基酸取代的良好候选物。或者，经鉴别为对生物活性至关重要的位点也可视对于多肽所寻求的所需活性而为供非天然编码的氨基酸取代的良好候选物。另一替代方法将为在多肽链上的各位置中利用非天然编码的氨基酸简单地进行连续取代并且观察对多肽活性的影响。所属领域技术人员易于了解，选择用于将非天然氨基酸取代入任何多肽中的位置的任何方式、技术或方法都适用于本发明中。也可检查多肽的含有缺失的天然存在突变体的结构和活性以确定很可能耐受非天然编码的氨基酸的取代的蛋白质区域。有关hGH，例如参看Kostyo等人，说op/yAy.925:314(1987);Lewis,U.等人，《/Ao/.CAe/n,,253:2679-2687(1978)。以类似方式，可使用蛋白酶消化和单克隆抗体来鉴别负责结合受体的多肽(诸如hGH)区域。例如参看Cunningham,B.等人Sc/e"ce243:1330-1336(1989);Mills,J.等人,五wdocW"o/ogM107:391-399(1980);Li,C,Mo/.Ce〃.所ocAew.,46:31-41(1982)(表明可缺失残基134-149之间的氨基酸而不损失活性)。在去除可能无法耐受非天然编码的氨基酸的取代的残基后，可由多肽和其结合蛋白的三维晶体结构检査所推荐的取代在各剩余位置处的影响。有关hGH参看deVos，A.等人，S"'ewce,255:306-312(1992);hGH的所有晶体结构可从蛋白质数据库(ProteinDataBank)(包括3HHR、1AXI和1HWG)(PDB，可于万维网rcsb.org获得)得到，其为含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的中央数据库。如果无法得到三维结构数据，那么可建立研究多肽二级结构和三级结构的模型。因此，所属领域技术人员可容易地鉴别可经非天然编码的氨基酸取代的氨基酸位置。在一些实施例中，本发明的多肽包含一个或一个以上位于不破坏多肽的螺旋或卩折叠二级结构的蛋白质区域中的非天然存在的氮基酸。并入非天然编码的氨基酸的例示性残基可为除潜在受体结合区或与结合搭配物结合的区域(包括(但不限于)对于hGH来说为位点I和位点II)外的残基；可完全或部分溶剂暴露的残基；与邻近残基具有最小或无氢键相互作用的残基；可最小程度地暴露于邻近反应性残基的残基；和如通过与受体结合或未结合或者与另一多肽或其它生物活性分子偶合或未偶合的多肽的三维、晶体、二级、三级或四级结构所预测，可高度弯曲(包括(但不限于)对于hGH来说为C-D环)或结构呈刚性(包括(但不限于)对于hGH来说为B螺旋)的区域中的残基。并入非天然编码的氨基酸且视情况与诸如PEG等分子连结的残基包括(但不限于)调节聚集体形成或溶解性、改进纯化、防止蛋白质氧化、修饰蛋白质的表位结构和防止去酰胺化的残基。美国专利公开案第US2005/0170404号(其以引用的方式并入本文中)描述将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入hGH中的多个位点以及可将非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物键联的位点。在一些实施例中，并入多肽中的非天然编码的氨基酸中至少一个含有羰基，例如酮基。在某些实施例中，并入多肽中的非天然编码的氨基酸中至少一个为对乙酰基苯丙氨酸。在多肽含有多个非天然编码的氨基酸的一些实施例中，并入多肽中的非天然编码的氨基酸中不止一个为对乙酰基苯丙氨酸。在多肽含有多个非天然编码的氨基酸的一些实施例中，实质上所有并入多肽中的非天然编码的氨基酸都为对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施例中，与多肽键联的水溶性聚合物包括一个或一个以上聚乙二醇分子(PEG)。聚合物(例如PEG)可为线性或分枝。通常，本发明中所使用的线性聚合物(例如PEG)可具有约0.1到约100kDa或约1到约60kDa或约20到约40kDa或为约30kDa的MW。通常，本发明中所使用的分枝聚合物(例如PEG)可具有约1到约100kDa或约30到约50kDa或为约40kDa的MW。诸如PEG等聚合物将于本文中进一步描述。在某些实施例中，多肽与水溶性聚合物(例如，PEG)之间的键为肟键。本发明的某些实施例涵盖包括通过共价键与至少一个水溶性聚合物键联的多肽的组合物，其中所述共价键为肟键。在一些实施例中，水溶性聚合物为PEG，例如线性PEG。在涵盖至少一个通过肟键与多肽键联的线性PEG的一些实施例中，PEG可具有约0.1到约100kDa或约1到约60kDa或约20到约40kDa或为约30kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的线性PEG的某些实施例中，PEG具有约30kDa的MW。在涵盖至少一个通过肟键与多肽键联的分枝PEG的一些实施例中，PEG可具有约1到约100kDa或约30到约50kDa或为约40kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的分枝PEG的某些实施例中，PEG具有约40kDa的MW。在一些实施例中，多肽为GH(例如hGH)，且在某些所述实施例中，GH(例如hGH)具有与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2至少约80Q/。一致的序列；在一些实施例中，所述多肽具有为美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的序列的序列。在一些实施例中，多肽含有至少一个非天然编码的氨基酸；在一些所述实施例中，至少一个肟键介于非天然编码的氨基酸与至少一个水溶性聚合物之间。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸含有羰基，诸如酮基；在一些实施例中，非天然编码的氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施例中，对乙酰基苯丙氨酸可在与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的第35位对应的位置处取代。因此，在一些实施例中，本发明提供一种通过共价键与至少一个水溶性聚合物(例如PEG)键联的多肽，其中所述共价键为后键。在某些实施例中，水溶性聚合物为PEG且PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG具有约0.1到约100kDa或约1到约60kDa或约20到约40kDa或为约30kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的线性PEG的某些实施例中，PEG具有约30kDa的MW。在某些实施例中，水溶性聚合物为PEG且PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG具有约1到约100kDa或约30到约50kDa或为约40kDa的MW。在涵盖通过后键与多肽键联的分枝PEG的某些实施例中，PEG具有约40kDa的MW。在一些实施例中，本发明提供一种多肽，其中所述多肽含有非天然编码的氨基酸，其中所述多肽通过共价键与至少一个水溶性聚合物(例如PEG)键联，且其中所述共价键为介于非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物(例如PEG)之间的肟键。在一些实施例中，将非天然编码的氨基酸并入多肽(例如hGH)中与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的第35位对应的位置处。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG具有约0.1到约100kDa或约1到约60kDa或约20到约40kDa或为约30kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的线性PEG的某些实施例中，PEG具有约30kDa的MW。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG具有约1到约100kDa或约30到约50kDa或为约40kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的分枝PEG的某些实施例中，PEG具有约40kDa的MW。在一些实施例中，本发明提供一种多肽，其中所述多肽含有非天然编码的氨基酸，所述氨基酸为含羰基的非天然编码的氨基酸，其中所述多肽通过共价键与至少一个水溶性聚合物(例如PEG)键联，且其中所述共价键为介于非天然编码的含羰基氨基酸与水溶性聚合物(例如PEG)之间的肟键。在一些实施例中，将非天然编码的含羰基氨基酸并入GH(例如hGH)中与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的第35位对应的位置处。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG具有约0.1到约100kDa或约1到约60kDa或约20到约40kDa或为约30kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的线性PEG的某些实施例中，PEG具有约30kDa的MW。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG具有约1到约100kDa或约30到约50kDa或为约40kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的分枝PEG的某些实施例中，PEG具有约40kDa的MW。在一些实施例中，本发明提供一种多肽，其含有包括酮基的非天然编码的氨基酸，其中所述多肽通过共价键与至少一个水溶性聚合物(例如PEG)键联，且其中所述共价键为介于非天然编码的含酮基氨基酸与水溶性聚合物(例如PEG)之间的肟键。在一些实施例中，将非天然编码的含酮基氨基酸并入GH(例如hGH)中与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的第35位对应的位置处。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG具有约0.1到约100kDa或约1到约60kDa或约20到约40kDa或为约30kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的线性PEG的某些实施例中，PEG具有约30kDa的MW。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG具有约1到约100kDa或约30到约50kDa或为约40kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的分枝PEG的某些实施例中，PEG具有约40kDa的MW。在一些实施例中，本发明提供一种多肽，其含有非天然编码的氨基酸，所述氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸，其中GH通过共价键与至少一个水溶性聚合物(例如PEG)键联，且其中所述共价键为介于对乙酰基苯丙氨酸与水溶性聚合物(例如PEG)之间的肟键。在一些实施例中，将对乙酰基苯丙氨酸并入GH(例如hGH)中与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的第35位对应的位置处。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，PEG为线性PEG。在这些实施例中，线性PEG具有约0.1到约100kDa或约1到约60kDa或约20到约40kDa或为约30kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的线性PEG的某些实施例中，PEG具有约30kDa的MW。在水溶性聚合物为PEG的某些实施例中，PEG为分枝PEG。在这些实施例中，分枝PEG具有约1到约100kDa或约30到约50kDa或为约40kDa的MW。在涵盖通过肟键与多肽键联的分枝PEG的某些实施例中，PEG具有约40kDa的MW。在某些实施例中，本发明提供一种GH(例如hGH)，其包括美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2，且其中所述GH(例如，hGH)在与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的第35位对应的位置处经对乙酰基苯丙氨酸取代，所述对乙酰基苯丙氨酸通过肟键与MW为约30kDa的线性PEG键联。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH)，其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置第l位前(即，N末端处)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，蛋白质的羧基末端)(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH),其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置30、35、74、92、103、143、145(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH)，其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置35、92、143、145(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH)，其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35、92、131、134、143、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个peg(例如线性peg)键联的gh(例如hGH)，其中gh(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQID103no:2或seqidn0:1或3的相应氨基酸的30、35、74、92、103、145位或其任何组合，所述专利以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH),其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35、92、143、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个peg(例如线性peg)键联的gh(例如hGH)，其中gh(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述位置包括(但不限于)与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相应氨基酸的第35位对应的位置。在PEG为线性PEG的实施例中，PEG可具有约0.1到约100kDa或约1到约60kDa或约20到约40kDa或为约30kDa的MW。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH)，其中GH(例如hGH)包括美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸，且所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置第l位前(即，N末端处)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、l卯、191、192(即，蛋白质的羧基末端)(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH)，其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸，且所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置30、35、74、92、103、143、145(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH)，其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸，且所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置35、92、143、145(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH)，其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸，且所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35、92、131、134、143、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH)，其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸，且所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的32、35、74、92、103、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH)，其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸，且所述位置包括(但不限于)与以下对应的位置美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的35、92、143、145位或其任何组合。在一些实施例中，本发明提供一种激素组合物，其包括经由肟键与至少一个PEG(例如线性PEG)键联的GH(例如hGH),其中GH(例如hGH)包含美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的氨基酸序列，且其中GH(例如hGH)含有至少一个在一个或一个以上位置处取代的非天然编码的氨基酸，所述氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸，所述位置包括(但不限于)与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸的第35位对应的位置。在PEG为线性PEG的实施例中，PEG可具有约0.1到约100kDa或约1到约60kDa或约20到约40kDa或为约30kDa的MW。在一些实施例中，本发明提供一种多肽，其中所述多肽含有至少一个非天然编码的氨基酸，其中所述多肽通过共价键与多个水溶性聚合物(例如多个PEG)键联，其中一个或一个以上共价键为介于至少一个非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物(例如PEG)之间的肟键。多肽可键联到约2-100个水溶性聚合物(例如PEG)，或约2-50个水溶性聚合物(例如PEG),或约2-25个水溶性聚合物(例如PEG),或约2-10个水溶性聚合物(例如PEG),或约2-5个水溶性聚合物(例如PEG)，或约5-100个水溶性聚合物(例如PEG)，或约5-50个水溶性聚合物(例如PEG)，或约5-25个水溶性聚合物(例如PEG)，或约5-10个水溶性聚合物(例如PEG)，或约10-100个水溶性聚合物(例如PEG)，或约10-50个水溶性聚合物(例如PEG)，或约10-20个水溶性聚合物(例如PEG)，或约20-100个水溶性聚合物(例如PEG)，或约20-50个水溶性聚合物(例如PEG),或约50-100个水溶性聚合物(例如PEG)。可将所述一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入多肽中本文所述的任何位置处。在一些实施例中，将至少一个非天然编码的氨基酸并入GH(例如hGH)中与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的第35位对应的位置处。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸包括至少一个为含羰基非天然编码的氨基酸的非天然编码的氨基酸，例如含酮非天然编码的氨基酸，诸如对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施例中，所述多肽包括对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施例中，将对乙酰基苯丙氨酸并入GH(例如hGH)中与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2的第35位对应的位置处，其中所述对乙酰基苯丙氨酸通过肟键与所述聚合物中的一个(例如所述PEG中的一个)键联。在一些实施例中，至少一个水溶性聚合物(例如PEG)通过共价键与多肽的至少一个非天然编码的氨基酸键联。在一些实施例中，所述共价键为肟键。在一些实施例中，多个水溶性聚合物(例如PEG)通过共价键与多肽的多个非天然编码的氨基酸键联。在一些实施例中，至少一个共价键为肟键；在一些实施例中，多个共价键为肟键；在一些实施例中，实质上所有键都为肟键。多个水溶性聚合物(例如PEG)可为线性、分枝或其任何组合。在并入一个或一个以上线性PEG的实施例中，线性PEG具有约0.1到约100kDa或约1到约60kDa或约20到约40kDa或为约30kDa的MW。在并入一个或一个以上分枝PEG的实施例中，分枝PEG具有约1到约100kDa或约30到约50kDa或为约40kDa的MW。应了解，使用多个水溶性聚合物(例如PEG)的实施例一般将比使用单一PEG的实施例使用较小MW的所述聚合物。因此，在一些实施例中，多个PEG的总MW为约0.1-500kDa，或约0.1-200kDa，或约0.1-100kDa，或约1-1000kDa，或约1-500kDa，或约1-200kDa，或约1-100kDa，或约10-1000kDa，或约10-500kDa，或约10-200kDa，或约10-100kDa,或约10-50kDa，或约20-1000kDa,或约20-500kDa,或约20-200kDa，或约20-100kDa，或约20-80kDa，或约20-60kDa，或约5-100kDa,或约5-50kDa，或约5-20kDa。人类GH拮抗剂包括(但不限于)在以下位置处具有取代1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123和127;或在第l位(即，N末端)具有添加；或其任何组合(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDN0:2，或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸或者任何其它GH序列)的拮抗剂。多种非天然编码的氨基酸可在多肽的特定位置取代或并入多肽的特定位置中。总的说来，选择特定非天然编码的氨基酸以供基于多肽与其受体的三维晶体结构的检查的并入，优先用于保守性取代(即，取代Phe、Tyr或Trp的含芳基非天然编码的氨基酸，诸如对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸)和需要引入多肽中的特定连结化学(例如，当需要实现与具有炔部分的水溶性聚合物的Huisgen[3+2]环加成或与具有芳基酯的水溶性聚合物形成酰胺键随后并入膦部分时，引入4-叠氮基苯丙氨酸)。在一实施例中，所述方法另外包括将非天然氨基酸并入蛋白质中，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；和使所述蛋白质与包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、糖、水溶性树突状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射可激发部分、光致异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、延长的侧链、碳键联糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、经同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米递质、放射性核苷酸、放射性递质、中子捕获剂或上述物质的任何组合或任何其它所需化合物或物质)接触。第一反应性基团与第二反应性基团反应以通过[3+2]环加成将所述分子与非天然氨基酸连接。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮基部分且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中)且第二反应性基团为叠氮基部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)且第二反应性基团为炔基部分。在一些情况下，将非天然编码的氨基酸取代与多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响多肽的其它生物特性。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加多肽的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解降解的抗性)或增加多肽对其受体的亲和力。在一些实施例中，GH(例如hGH)多肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸取代美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2中的F10A、F10H、FIOI、M14W、M14Q、M14G、H18D、H21N、G120A、R167N、D171S、E174S、F176Y、I179T或其任何组合。hGH的其它取代描述于美国专利公开案第US2005/0170404号中，其以全文引用的方式并入本文中。在一些情况下，所述其它添加、取代或缺失可增加多肽的溶解性(包括(但不限于)当在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，添加、取代或缺失可在于大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后增加多肽的溶解性。在一些实施例中，在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后，选择除并入导致多肽溶解性增加的非天然氨基酸的另一位点外的位点以供天然编码或非天然氨基酸取代。在一些实施例中，多肽包含调节对多肽受体、结合蛋白、缔合配体的亲和力；调节(包括(但不限于)增加或降低)受体二聚化；使受体二聚体稳定；调节循环半衰期；调节释放或生物可用性；便利纯化；或者改进或改变特定投药途径的另一添加、取代或缺失。举例来说，除引入如本文所述的一个或一个以上非天然编码的氨基酸外，还引入一个或一个以上以下取代F10A、F10H或F10I;M14W、M14Q或M14G;H18D;H21N;R167N;D171S;E174S;F176Y和I179T，以增加GH(例如hGH)变体对其受体的亲和力。类似地，多肽可包含改进检测(包括(但不限于)GFP)、纯化、通过组织或细胞膜的转运、前药释放或活化、多肽尺寸减小或其它多肽特性的化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或聚组氨酸)或其它基于亲和力的序列(包括(但不限于)FLAG、聚组氨酸、GST等)或键联分子(包括(但不限于)生物素)。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸的取代产生多肽拮抗剂。并入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的例示性位点子集包括1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123、127或在1位前的添加(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2，或SEQIDNO:1、3的相应氨基酸或任何其它GH序列)。在一些实施例中，GH(例如hGH)拮抗剂在区域1-5(N末端)、6-33(A螺旋)、34-74(介于A螺旋与B螺旋之间的区域，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(介于B螺旋与C螺旋之间的区域，B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(介于C螺旋与D螺旋之间的区域，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C末端)中包含至少一个使GH充当拮抗剂的取代。在其它实施例中，并入非天然编码的氨基酸的例示性位点包括在A螺旋的氨基末端区域和一部分C螺旋内的残基。在另一实施例中，用诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸等非天然编码的氨基酸取代G120。在其它实施例中，将上文所列的取代与使GH(例如hGH)多肽成为GH(例如hGH)拮抗剂的其它取代组合。举例来说，在本文所鉴别的一个位置处取代非天然编码的氨基酸且同时在G120处引入取代(例如，G120R、G120K、G120W、G120Y、G120F或G120E)。在一些实施例中，GH(例如hGH)拮抗剂包含与水溶性聚合物键联的非天然编码的氨基酸，其存在于GH(例如hGH)分子的受体结合区内。在一些情况下，用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多个氨基酸。在一些情况下，多肽另外包括一个或一个以上非天然编码的氨基酸对天然存在的氨基酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个取代。举例来说，在一些实施例中，GH(例如hGH)的以下区域中的一个或一个以上残基经一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代1-5(N末端)、32-46(A-B环的N末端)、97-105(B-C环)、132-149(C-D环)和184-191(C末端)。在一些实施例中，GH(例如hGH)的以下区域中的一个或一个以上残基经一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代1-5(N末端)、6-33(A螺旋)、34-74(介于A螺旋与B螺旋之间的区域，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(介于B螺旋与C螺旋之间的区域，B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(介于C螺旋与D螺旋之间的区域，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C末端)。在一些情况下，将所述一个或一个以上非天然编码的残基与一个或一个以上较低分子量的线性或分枝PEG(质量为约5-20kDa或更低)键联，借此相对于与单一较高分子量的PEG连接的物质增强结合亲和力和相当的血清半衰期。VII.非真核生物和真核生物中的表达为获得克隆聚核苷酸的高水平表达，通常将编码本发明的多肽的聚核苷酸亚克隆到含有引导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(对于编码蛋白质的核酸来说)用于翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。所属领域技术人员已知适当细菌启动子且其例如描述于Sambrook等人和Ausubel等人中。用于表达本发明的多肽的细菌表达系统可从(包括(但不限于))大肠杆菌、芽孢杆菌(^cz7/^印.)、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌(Sa/mo"e〃a)获得(Palva等人，Ge"e22:229-235(1983);Mosbach等人，Atow302:543-545(1983))。这些表达系统的试剂盒在市面上有售。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统已为所属领域技术人员所己知且在市面也有售。在将正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(上文所述)用于表达本发明的多肽的情况中，供表达的宿主细胞是根据其使用正交组件的能力加以选择。例示性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(包括(但不限于)短小芽孢杆菌(及6revh)、枯草杆菌(及w^/to)或链霉菌(&re;^ow;;ce;y))和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌)，以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述可使用包含O-tRNA/0-RS对的细胞。本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成较大有用量的包含非天然氨基酸的蛋白质的能力。一方面，组合物视情况包括(包括(但不限于))至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或更多包含非天然氨基酸的蛋白质，或可利用活体内多肽制备方法达到的量(关于重组蛋白制备和纯化的细节提供于本文中)。另一方面，蛋白质视情况是以于(包括(但不限于))细胞溶解产物、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括(但不限于)体积(包括(但不限于))在任何地方都在约lnl到约100L或更多)中的(包括(但不限于))每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质、或每升至少10毫克蛋白质或更高的浓度存在于组合物中。在包括至少一个非天然氨基酸的真核细胞中产生大量(包括(但不限于)大于用其它方法(包括(但不限于)活体外翻译)通常可能获得的量)蛋白质是本发明的特征。本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成较大有用量的包含非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，可产生于细胞提取物、细胞溶解产物、培养基、缓冲液等中的(包括(但不限于))至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、卯0毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或更高蛋白质浓度的包含非天然氨基酸的蛋白质。I.表达系统、培养和分离多肽可在许多适当表达系统(例如包括酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌)中表达。例示性表达系统的描述提供于下文中。酵母如本文中所用，术语"酵母"包括能够表达编码多肽的基因的各种酵母中的任一种。这些酵母包括(但不限于)产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(五"f/o/w戸^i/es))、担孢子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口属于半知菌(Fungiimperfecti)(芽孢纲(祝aWow少ce/w))类的酵母。产子囊酵母分为两个科蚀精霉科(5^erw2o;/zf/wmceae)和酵母菌科(Sacc/mrowycWaceae)。后者由四个亚科组成，Sc/^myflcc/zflroff^cozWeag(例如,裂殖酵母属(Sc/2/zcwflcc/zflrawj戸51))、拿逊酵母亚禾斗(7Vflcfeom'o/cfefle)、丄(powyco/Jeae禾口Sflcc/2aro附ycwWeae(例如，毕赤酵母属(尸z'c/zz'a)、克鲁维酵母属(《/炒verowy;c")和酵母属(&cc/wro/^CM))。担孢子酵母包括白冬孢酵母属(丄ewco印o〃W/ww)、红冬孢酵母属(及/oc/o5ponW/wm)、锁掷酵母属(5^on^o6o/w)、线黑粉酵母属(Fz'/o6"wWhm2)和香灰拟锁担菌属(Fz7o6"wW/e//a)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科掷孢酵母科(S;wo6o/o/n少ce/aceae)(例如，掷孢酵母属(印ora/w/o附yc^)和布勒掷孢酵母属(5w〃em))和隐球酵母科(Oyp/ococcaceae)(例如，假丝酵母属(Ca"AWa))。本发明使用的特别值得关注的为毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属(iSflcc/wrow戸50、裂殖酵母属(Sc/2z'msacctoram戸s)、汉逊酵母属(i/o7weww/a)、球拟酵母属(7bnJo;w!'s)和假丝酵母属内的物种，其包括(但不限于)巴斯德毕赤酵母(尸.;kw/oa1s)、谷勒氏酵母(Pgwz'〃en'附o"A7)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.cw/We^eTwh)、糖化酵母(S.Aaw加'a^)、道格拉斯酵母(S.dowg/"W)、克鲁维酵母(S.yW矽ven')、诺本酵母(S.wo^e";^)、卵形酵母(S.ovz/oAvm^)、乳酸克鲁维酵母(夂./ac&)、脆壁克鲁维酵母(〖./Mg/fe)、白色念珠菌(C.a/6/ca";y)、麦芽糖假丝酵母(C.m"/^wfl)和汉森酵母po/，o一a)。选择表达多肽的适合酵母是在所属领域技术人员的技术范围内。在选择用于表达的酵母宿主时，适合宿主可包括显示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好可溶性蛋白质产生和总体稳固性的酵母宿主。酵母通常可自多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(加州伯克禾!j)(YeastGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA))和美国典型菌种保藏中心("ATCC")(北弗吉尼亚马纳萨斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。术语"酵母宿主"或"酵母宿主细胞"包括可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的酵母。所述术语包括已接收重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与以相关特性(诸如存在编码多肽的核苷酸序列)为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在此定义所指的后代中。已研发包括染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体以用于转化入许多酵母宿主中。举例来说，已研发用于以下各有机体的表达载体酿酒酵母(Sikorski等人，GENETICS(1989)122:19;Ito等人，J.BACTERIOL.(1983)153:163;Hinnen等人，PROC.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929);白色念珠菌(Kurtz等人，MOL.CELL.Biol.(1986)6:142);麦芽糖假丝酵母(Kunze等人，J.BasicMicrobiol.(1985)25:141);汉森酵母(Gleeson等人，J.GEN.MICROBIOL.(1986)132:3459;Roggenkamp等人，Mol.GENETICSANDGENOMICS.(1986)202:302);脆壁克鲁维酵母(Das等人，J.BACTERIOL.(1984)158:1165);乳酸克鲁维酵母(DeLouvencourt等人，J.BACTERIOL.(1983)154:737;VandenBerg等人，BIOTECHNOLOGY(NY)(19卯)8:135);谷勒氏酵母(Kunze等人，J.BASICMICROBIOL.(1985)25:141);巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324,639号；第4,929,555号；和第4,837,148号；Cregg等人，MOL.CELL.BIOL.(1985)5:3376);粟酒裂殖酵母(Sc/^o^cc/zaroT^ce;;ow6e)(Beach等人，NATURE(1982)300:706);和解脂耶氏酵母争一ca);构巢曲霉mWw/顯)(Ballance等人，BIOCHEM.Biophys.Res.COMMUN.(1983)112:284-89;Tilbum等人，GENE(1983)26:205-221;和Yelton等人，PROC.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:1470-74);黑曲霉(A(Kelly和Hynes,EMBOJ.(1982)4:475-479);里氏木霉(7:證z力)(EP0244234);和诸如脉孢菌(A^wro;y/7ora)、青霉菌(户ew'c/仍wm)、弯颈霉(Tb/ypoc/a&ww)(WO91/00357)等丝状真菌，各文献以引用的方式并入本文中。所属领域技术人员已知用于酵母载体的控制序列且其包括(但不限于)来自诸如以下基因的启动子区域醇脱氢酶(ADH)(EP0284044);烯醇化酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH);己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP0329203)。编码酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可提供有用的启动子序列(Miyanohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:1)。用于酵母宿主的其它适合启动子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BIOL.CHEM.(1980)255:12073)和其它糖解酶(诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)17:4900;Hess等人，J.ADV.ENZYMEREG(1969)7:149))的启动子。具有由生长条件控制的转录的其它优点的可诱发酵母启动子可包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达中的适合载体和启动子进一步描述于EP0073657中。酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游活化序列(UAS)可与另一酵母启动子的转录活化区连接，产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区连接的ADH调控序列。参看美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PH05基因的调控序列与糖解酶基因(诸如GAP或PyK)的转录活化区组成的启动子。参看EP0164556。此外，酵母启动子可包括具有与酵母RNA聚合酶结合且起始转录的能力的非酵母来源的天然存在的启动子。可构成酵母表达载体的部分的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(Holland等人，J.BIOL.CHEM.(1981)256:1385)。另外，来自2p质粒来源的复制起点适用于酵母。用于酵母中的适当选择基因为酵母质粒中所存在的t^7基因。参看Tschumper等人，GENE(1980)10:157;Kingsman等人，GENE(1979)7:141。基因对缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株提供选择标记。类似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)是由带有丄ew2基因的已知质粒补充。所属领域技术人员已知将外源DNA引入酵母宿主中的方法，且其通常包括(但不限于)转化原生质球状体或转化经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，可根据Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76:3829和VanSolingen等人，J.Bact.(1977)130:946中所述的方法来进行酵母的转化。然而，也可如Sambrook等人，MolecularCloning:ALab.Manual(2001)中通常所述使用将DNA引入细胞中的其它方法，诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合。随后可使用所属领域技术人员己知的标准技术来培养酵母宿主细胞。所属领域技术人员已知在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法。通常参看美国专利公开案第20020055169号；美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号；和第5,089,398号；美国复审专利第RE37,343号和第RE35/749号；PCT公开专利申请案WO99/07862;WO98/37208;和WO98/26080;欧洲专利申请案EP0946736;EP0732403;EP0480480;WO90/10277;EP0340986;EP0329203;EP0324274;和EP0164556。也参看Gellissen等人，ANTONIEVanLEEUWENHOEK(1992)62(1-2):79-93;Romanos等人，YEAST(1992)8(6):423-488;Goeddel，METHODSINENZYMOLOOY(1990)185:3-7，其各自是以引用的方式并入本文中。在使用所属领域技术人员已知的标准进料分批发酵方法的扩增阶段期间，酵母宿主菌株可在发酵罐中生长。发酵方法可用于解释特定酵母宿主的碳利用路径或表达控制模式的差异。举例来说，酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复合氮源(例如，酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相比之下，甲醇营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物进料，但仅需要简单铵(氮)盐以进行最佳生长和表达。例如参看美国专利第5,324,639号；Elliott等人，J.ProteinChem.(1990)9:95;和Fieschko等人，Biotech.Bioeng.(1987)29:1113，其是以引用的方式并入本文中。然而，这些发酵方法可具有与所用酵母宿主菌株无关的某些常见特征。举例来说，在扩增阶段期间，可将限制生长的养分(通常为碳)加到发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵方法通常使用经设计成含有足量碳、氮、基本盐、磷和其它微量养分(维生素、痕量矿物和盐等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其以引用的方式并入本文中。感染杆状病毒的昆虫细胞术语"昆虫宿主"或"昆虫宿主细胞"是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的昆虫。所述术语包括已经转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与以相关特性(诸如存在编码多肽的核苷酸序列)为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在此定义所指的后代中。所属领域技术人员已知用于表达多肽的合适昆虫细胞的选择。若干种昆虫物种在所属领域中得以充分描述且在市面上有售，其包括埃及伊蚊""^^gy^O、桑蚕(5ow6;a膨n')、黑腹果虫虽(Dmyop/n7a附e/fl"ogaWer)、草地贪夜蛾(5^0(io,m^/h/妳m^)和粉纹夜蛾(7Hc/z叩/"Wam')。在选择用于表达的昆虫宿主时，合适宿主可包括显示尤其具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。昆虫通常可自多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(加州伯克禾U)(InsectGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA));和美国典型菌种保藏中心("ATCC")(北弗吉尼亚马纳萨斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。通常，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包括转移载体(通常为细菌质粒)，其含有杆状病毒基因组的片段和用于插入欲表达的异源基因的便利限制位点；具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列的野生型杆状病毒(此允许异源基因同源重组到杆状病毒基因组中)；以及适当昆虫宿主细胞和生长培养基。所属领域中己知用于构建载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术且可使用描述这些技术的手册。在将异源基因插入转移载体中后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，其中载体与病毒基因组重组。表达经包装重组病毒并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA)。所属领域技术人员通常已知这些技术且其充分描述于Summers和Smith,TexasAgriculturalExperimentStationBulletin第1555期(1987)中，其是以引用的方式并入本文中。还参看Richardson,:39MethodsinMolecularBiology:BaculovirusExpressionProtocols(1995);Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology16.9-16.11(1994);King禾口Possee,TheBaculovirusSystem:ALaboratoryGuide(1992);和O'Reilly等人，BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual(1992)。事实上，所属领域技术人员已知使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来制备各种异源蛋白质。例如参看，美国专利第6,368,825号；第6,342,216号；第6,338,846号;第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号号；第6,096,304号；第6,013,433号号；第5,871,986号；第5,861,279号号；第5,753,220号；第5,605,827号第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO02/06305;WO01/90390;WO01/27301;WO01/05956;WO00/55345;WO00/20032;WO99/51721;WO99/45130;WO99/31257;WO99/10515;WO99/09193;WO97/26332;WO96/29400;WO96/25496;WO96/06161;WO95/20672;WO93/03173;WO92/16619;WO92/02628;WO92/01801;WO90/14428;WO90/10078;WO90/02566;WO卯/02186;WO90/01556;WO89/01038;WO89/01037;WO88/07082，其以引用的方式并入本文中。所属领域中已知可用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体且其包括例如从杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(^^ogr印/wca/z/or"/ca)核型多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达和转移载体，其为不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。从此系统得到的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子以驱动异源基因的表达。通常参看O'Reilly等人,BACULOVIRUSEXPRESSIONVECTORS:ALABORATORYMANUAL(1992)在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包含启动子、前导序列(必要时)、所关注的编码序列和转录终止序列的上述组分组装到中间错位构筑体(intermediatetransplacementconstruct)(转移载体)中。中间错位构筑体通常保持在能够稳定保持在宿主(诸如细菌)中的复制子(诸如染色体外元件(例如，质粒))中。复制子将具有复制系统，因此允许其保持在供克隆和扩增用的合适宿主中。更具体来说，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller，A丽.Rev.Microbiol.(1988)42:177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核抗氨比西林(ampicillin)(a琴)基因和复制起点。一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。也已经对所属领域技术人员已知的许多其它载体进行设计，包括例如pVL985，其将多角体蛋白起始密码子由ATG变为ATT,且其将BamHI克隆位点引入ATT下游32个碱基对处。参看Luckow和Summers,VIROLOGY170:31(1989)。其它市售载体包括例如PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)。在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。所属领域中已知将异源DNA引入杆状病毒的所需位点中的方法。参看SUMMERS和SMITH,TEXASAGRICULTURALEXPERIMENTSTATIONBULLETIN第1555期(1987);Smith等人，Mol.Cell.BIOL.(1983)3:2156;Luckow和Summers,VIROLOGY(1989)170:31中。举例来说，可通过同源双交叉重组插入诸如多角体蛋白基因等基因中；也可插入所需杆状病毒基因中经工程改造的限制酶位点中。参看Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4):91。可通过电穿孔来实现转染。参看Trotter和Wood,39METHODSINMolecularBiology(1995);Mann和King,J.Gen.Virol.(1989)70:3501。或者，脂质体可用于以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如参看，Liebman等人，BIOTECHNIQUES(1999)26(1):36;Graves等人，BIOCHEMISTRY(1998)37:6050;Nomura等人，J.BIOL.CHEM.(1998)273(22):13570;Schmidt等人，PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION(1998)12:323;Siffert等人，NatureGenetics(1998)18:45;Tilkins等人，CellBiology:ALaboratoryHandbook145-154(1998);Cai等人，ProteinExpressionandPurification(1997)10:263;Dolphin等人，NatureGenetics(1997)17:491;Kost等人，GENE(1997)190:139;Jakobsson等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271:22203;Rowles等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(37):22376;Reverey等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(39):23607-10;Stanley等人，J.BIOL.CHEM.(1995)270:4121;Sisk等人，J.ViROL.(1994)68(2):766;和Peng等人，BIOTECHNIQUES(1993)14(2):274。市售脂质体包括例如Cellfectin⑧和Lipofectin(Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA)。另外，也可使用磷酸钙转染。参看Trotter和Wood,39METHODSINMolecularBiology(1995);Kitts,NAR(1990)18(19):5667;以及Mann和King,J.Gen.Virol.(1989)70:3501。杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够与杆状病毒RNA聚合酶结合且起始编码序列(例如，结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有称作增强子的第二区域，当存在时，其通常在结构基因的末梢。此外，表达可经调控或为组成性。在感染周期末期大量转录的结构基因提供特别有用的启动子序列。实例包括源自编码病毒多面体蛋白的基因(FRIESEN等人，77zeiegw/a//o"o/5acw/ov/n^Gewe_&c/7my57'o",THEMOLECULARBIOLOGYOFBACULOVIRUSES(1986);EP0127839和0155476)和编码pl0蛋白的基因(Vlak等人，J.GEN.VIROL.(1988)69:765)的序列。将新近形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中且随后可通过所属领域技术人员己知的技术来纯化所生长的斑块。参看Miller等人，BIOESSAYS(1989)11(4):91;SUMMERS和Smith,TexasAgriculturalExperimentStationBulletin第1555期(1987)。已开发用于感染到若干种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，已开发尤其用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参看Wright,Nature(1986)321:718;Carbonell等人，J.Virol.(1985)56:153;Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)3:2156。通常参看Fraser等人，/wP7raoCell.Dev.Biol.(1989)25:225。更具体来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(InvitrogenCorp.，目录号11497-013(Carlsbad,CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveBTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。杆状病毒表达载体中异源多肽的直接表达和融合表达可用的细胞和培养基在市面上有售，且所属领域技术人员通常已知细胞培养技术。大肠杆菌、假单胞菌和其它原核生物所属领域技术人员已知细菌表达技术。多种载体可用于细菌宿主中。载体可为单拷贝或者低或高多拷贞载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于存在关于载体的丰富文献、许多载体的商业可用性以及甚至描述载体和其限制酶图谱和特征的手册，无需在本文中广泛讨论。众所周知，载体通常涉及允许选择的标记，这些标记可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多个标记，其提供不同特征。细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶且起始编码序列(例如结构基因)下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5'端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有称作操纵子的第二区域，其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵子允许负调控(可诱导)转录，这是因为基因抑制蛋白可结合操纵子且由此抑制特定基因的转录。在不存在负调控元件(诸如操纵子)的情况下可发生组成性表达。另外，通过基因活化蛋白结合序列可实现正调控，当存在时，所述序列通常最接近RNA聚合酶结合序列的(5')。基因活化蛋白的实例为代谢物活化蛋白(CAP)，其有助于起始大肠杆菌(E.coli)中lac操纵子的转录[Raibaud等人，A丽u.Rev.Genet.(1984)18:173]。因此，调控表达可为正向或负向，由此增强或减弱转录。编码代谢路径酶的序列提供特别有用的启动子序列。实例包括来源于糖代谢酶(诸如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，Nature(1977)198:1056]和麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括来源于生物合成酶(诸如色氨酸(trp))的启动子序列[Goeddd等人，NUC.AcidsRes.(1980)8:4057;Yelverton等人，Nucl.AcidsRes.(1981)9:731;美国专利第4,738,921号；欧洲公开案第036776号和第121775号，其以引用的方式并入本文中]。(3-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)"Thecloningofinterferonandothermistakes."Interferon3(I.Gresser编)]、噬菌体XPL[Shimatake等人，Nature(1981)292:128]和T5[美国专利第4,689,406号，其是以引用的方式并入本文中]启动子系统也提供有用的启动子序列。本发明的优选方法利用强启动子(诸如T7启动子)来诱导高含量的多肽。所属领域技术人员已知这些载体的实例且其包括来自Novagen的pET29系列和WO99/05297(其是以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高含量的多肽，而不损害宿主细胞生存能力或生长参数。pET19(Novagen)为所属领域已知的另一载体。另外，在自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，可将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，从而产生合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号，其是以引用的方式并入本文中]。举例来说，tac启动子是由trp启动子与lac操纵子序列组成的杂合trp-lac启动子，其由lac阻遏物调控[Amann等人，Gene(1983)25:167;deBoer等人，PROC.Natl.Acad.SCI.(1983)80:21]。此外，细菌启动子可包括非细菌来源的天然存在启动子，其具有与细菌RNA聚合酶结合且起始转录的能力。也可将非细菌来源的天然存在启动子与可相容的RNA聚合酶偶合以产生一些基因在原核生物中的高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统为偶合启动子系统的实例[Studier等人，J.Mol.BIOL.(1986)189:113;Tabor等人，ProcNatl.Acad.Sci.(1985)82:1074]。另外，杂合启动子也可由噬菌体启动子和大肠杆菌操纵子区域组成(欧洲公开案第267851号)。除功能性启动子序列之外，有效核糖体结合位点还可用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称作Shine-Dalgarno(SD)序列且包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人，NATURE(1975)254:34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16SrRNA的3'端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人，"GeneticsignalsandnucleotidesequencesinmessengerRNA"，BiologicalRegulationandDevelopment:GeneExpression(R.F.Goldberger编，1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人,"ExpressionofclonedgenesinEscherichiacoli",MolecularCloning:ALaboratoryManual,1989]。术语"细菌宿主"或"细菌宿主细胞"是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的受体的细菌。所述术语包括己经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA上可能未必完全相同。与以相关特性(诸如存在编码多肽的核苷酸序列)为特征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在此定义所指的后代中。所属领域技术人员已知用于表达多肽的适当宿主细菌的选择。在选择供表达的细菌宿主时，合适宿主可包括显示尤其具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。细菌宿主通常可自多种来源获得，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(加州伯克利)(BacterialGeneticStockCenter,DepartmentofBiophysicsandMedicalPhysics,UniversityofCalifornia(Berkeley,CA))禾口美国典型菌种保藏中心("ATCC")(北弗吉尼亚马纳萨斯)(AmericanTypeCultureCollection("ATCC")(Manassas,VA))。工业/医药发酵通常使用来源于K菌株(例如W3110)的细菌或来源于B菌株(例如BL21)的细菌。这些菌株因其生长参数众所周知且稳定而特别有用。另外，这些菌株为非病原性的，出于安全性和环境原因，其在商业上相当重要。适当大肠杆菌宿主的其它实例包括(但不限于)BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本发明方法的另一个实施例中，大肠杆菌宿主为蛋白酶缺乏菌株，其包括(但不限于)OMP-和LON-。宿主细胞株为假单胞菌，包括(但不限于)荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。已知荧光假单胞菌生物型l(命名为菌株MBIOI)可用于重组制备并且可用于治疗性蛋白质的制备工艺。假单胞菌表达系统的实例包括可以宿主菌株形式自DowChemicalCompany获得的系统(Midland,MI，可通过万维网在dow.com上获得)。美国专利第4,755,465号和第4,859,600号(其是以引用的方式并入本文中)描述假单胞菌菌株作为用于GH(例如hGH)产生的宿主细胞的用途。在形成重组宿主细胞株(即，己将表达构筑体引入宿主细胞中且分离具有合适表达构筑体的宿主细胞)后，在适于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞株。所属领域技术人员将了解，培养重组宿主细胞株的方法将取决于所利用的表达构筑体的性质和宿主细胞的身份。通常使用所属领域技术人员己知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的碳源、氮源和无机盐源且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域技术人员已知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不需要的微生物和/或化合物(包括(但不限于)用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素)的生长。重组宿主细胞可以分批或连续模式培养，其中细胞采集(在多肽在细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的采集为分批或连续模式。对于在原核宿主细胞中制备来说，优选分批培养和细胞采集。本发明的多肽通常在于重组系统中表达之后纯化。可通过所属领域已知的多种方法从宿主细胞或培养基中纯化多肽。细菌宿主细胞中所产生的多肽可具有弱溶解性或不可溶(呈包涵体形式)。在本发明一个实施例中，利用本文中所揭示的方法以及所属领域已知的方法，可容易地在多肽中进行出于增加重组产生的蛋白质的溶解性的目的而选择的氨基酸取代。在不溶性蛋白质的情况下，可通过离心从宿主细胞溶解产物收集蛋白质，且其后可接着进行细胞的均质化。在具有弱溶解性的蛋白质的情况下，可加入包括(但不限于)聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱导部分可溶性蛋白质的沉淀。随后可通过离心便利地收集沉淀蛋白质。可使用所属领域技术人员已知的多种方法使重组宿主细胞破裂或均质化以释放细胞内的包涵体。可使用众所周知的技术来进行宿主细胞的破裂或均质化，这些技术包括(但不限于)酶促细胞破裂、超声波降解法、杜恩斯均质化(douncehomogenization)或高压释放破裂。在本发明方法的一个实施例中，高压释放技术可用于使大肠杆菌宿主细胞破裂以释放多肽包涵体。在处理多肽包涵体时，有利的是使均质化时间的重复最小化以便最大化包涵体产率而不会由于诸如溶解、机械剪切或蛋白质水解等因素造成损失。随后可使用所属领域已知的众多适合增溶剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀多肽。可利用脲或盐酸胍来溶解多肽。应使溶解多肽的体积最小化，从而可使用可方便操作的批量大小制备大批量。在重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业装置中，这个因素可为重要的。另外，当在大规模商业装置中制造多肽时，特别是对于人类医药用途来说，如果可能的话，那么应避免可损害机器和容器或蛋白质产物本身的苛性化学品(harshchemicals)。本发明的方法中已证实，较温和的变性剂脲可代替较苛刻的变性剂盐酸胍用于溶解多肽包涵体。脲的使用在有效溶解多肽包涵体的同时显著降低对在多肽的制造和纯化过程中所利用的不锈钢设备造成损害的风险。在可溶性蛋白质的情况下，可将多肽分泌到周质空间或培养基中。另外，可溶性多肽可存在于宿主细胞的细胞质中。可能需要在进行纯化步骤之前浓縮可溶性多肽。可使用所属领域技术人员已知的标准技术浓縮来自例如细胞溶解产物或培养基的可溶性多肽。另外，可使用所属领域技术人员已知的标准技术使宿主细胞破裂并从宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性多肽。当制备呈融合蛋白形式的多肽时，可去除融合序列。可通过酶促裂解或化学裂解实现融合序列的去除。可使用所属领域技术人员已知的方法来实现融合序列的酶促去除。如所属领域技术人员所了解，用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的身份决定，且反应条件将由酶的选择指定。可使用包括(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂的所属领域技术人员已知的试剂来实现化学裂解。可通过所属领域技术人员已知的方法从裂解的融合序列中纯化裂解多肽。如所属领域技术人员所了解，所述方法将由融合序列和多肽的身份和特性决定。供纯化的方法可包括(但不限于)尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。也可纯化多肽以从蛋白质溶液中去除DNA。可通过诸如沉淀或离子交换色谱等所属领域已知的任何适当方法去除DNA，还可通过用核酸沉淀剂(诸如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除。可使用包括(但不限于)离心或过滤的众所周知的标准方法使多肽与沉淀DNA分离。在欲将多肽用于治疗人类的情况中，宿主核酸分子的去除是重要因素，且本发明的方法将宿主细胞DNA降到医药学上可接受的含量。供小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，所述方法包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统和搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可以分批、馈料分批或连续模式过程进行。通常可使用所属领域中的标准方法来回收本发明的人类GH多肽。举例来说，可将培养基或细胞溶解产物离心或过滤以去除细胞碎片。可将上清液浓縮或稀释到所需体积或者透滤到适当缓冲液中来调节制剂以供进一步纯化。本发明多肽的进一步纯化包括从完整形式中分离出脱酰胺化和剪短形式的多肽变体。以下例示性程序中的任一种都可用于纯化本发明的多肽亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括(但不限于)DEAESEPHAROSE);硅胶色谱；高效液相色谱(HPLC);反相HPLC;凝胶过滤(使用(包括(但不限于))SEPHADEXG-75);疏水相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦)；差示溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)；SDS-PAGE;或萃取。根据所属领域技术人员已知且使用的标准程序，可将本发明的蛋白质(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的肽、针对包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等)部分或实质上纯化到均质。因此，可通过所属领域技术人员已知的众多方法中的任一种来回收和纯化本发明的多肽，这些方法包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳等。必要时，在制备正确折叠的成熟蛋白质时可使用蛋白质再折叠步骤。可将高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它适合方法用于需要高纯度的最后纯化步骤中。在一个实施例中，将针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质或肽)制成的抗体用作纯化试剂(包括(但不限于))以用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质或肽的基于亲和力的纯化。必要时，在部分纯化或达到均质后，视情况将多肽用于多种应用，包括(但不限于)作为检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或作为抗体产生的免疫原。除了本文中指出的其它参考文献之外，所属领域技术人员已知多种纯化/蛋白质折叠方法，包括(但不限于)以下文献中描述的那些R.Scopes,ProteinPurification,Springer-Verlag，N.Y.(1982);Deutscher,MethodsinEnzvmology第182巻GuidetoProteinPurification.AcademicPress,Inc.N.Y.(1990);Sandana，(1997)BioseparationofProteins.AcademicPress,Inc.;Bollag等人(1996)ProteinMethods,第2版Wiley-Liss，NY;Walker,(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ,Harris禾口Angal，(1990)ProteinPurificationApplications:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Harris禾口Angal,ProteinPurificationMethods:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,England;Scopes,(1993)ProteinPurification:PrinciplesandPractice第3版SpringerVerlag,NY;Janson禾口Ryden,(1998)ProteinPurification:Principles.HighResolutionMethodsandApplications,第2版Wilev-VCH,NY;和Walker(1998),ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress,NJ;以及其中所引用的参考文献。在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生具有非天然氨基酸的所关注的蛋白质或多肽的一个优点在于，通常所述蛋白质或多肽将以其天然构象折叠。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域技术人员将认识到在合成、表达和/或纯化之后，蛋白质或肽可具有与相关多肽的所需构象不同的构象。在本发明的一个方面中，所表达的蛋白质或多肽视情况变性且随后复性。此可利用所属领域中己知的方法来实现，所述方法包括(但不限于)通过将伴侣蛋白(chaperonin)加入所关注蛋白质或多肽中；通过将蛋白质溶解于诸如盐酸胍等离液剂中；利用蛋白质二硫化物异构酶等。一般来说，有时候需要变性和还原经表达多肽且随后使多肽再折叠成优选构象。举例来说，可将胍、脲、DTT、DTE和/或伴侣蛋白加到所关注的翻译产物中。所属领域技术人员已知还原、变性和复性蛋白质的方法(参看上述参考文献以及Debinski等人，(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070;Kreitman和Pastan(1993)Bioconiug.Chem.,4:581-585;以及Buchner等人，(1992)Anal.Biochem..205:263-270)。举例来说，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。蛋白质可在含有(包括(但不限于))氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中再折叠。再折叠试剂可流动或以其它方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或者一种或一种以上多肽或其它表达产物可流动或以其它方式移动以与再折叠试剂接触。在原核产生多肽的情况下，由此产生的多肽可能错误折叠且因而缺乏生物活性或具有降低的生物活性。可通过"再折叠"来恢复蛋白质的生物活性。一般来说，通过使用例如一种或一种以上离液剂(例如脲和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇(2-ME))溶解(其中多肽也不可溶)、展开和还原多肽链以使错误折叠的多肽再折叠。在中等浓度的离液剂下，随后加入氧化剂(例如，氧、胱氨酸或胱胺)，其允许再形成二硫键。可使用所属领域中已知的标准方法将多肽再折叠，诸如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的方法，所述专利以引用的方式并入本文中。多肽也可与其它蛋白质共折叠以形成异二聚体或异多聚体。在再折叠或共折叠之后，可进一步纯化多肽。可使用所属领域技术人员已知的多种技术来实现多肽的纯化，包括(但不限于)疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱等或其任何组合。其它纯化还可包括干燥或沉淀经纯化蛋白质的步骤。纯化后，可将多肽交换到不同缓冲液中和/或通过所属领域中已知的多种方法中的任一种浓縮，所述方法包括(但不限于)透滤和透析。作为单一纯化蛋白质提供的多肽可经历聚集和沉淀。经纯化多肽可为至少90%纯(如通过反相高效液相色谱RP-HPLC或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE所测量)或至少95%纯，或至少98%纯，或至少99%纯或更高纯度。不管多肽纯度的确切数值如何，所述多肽对于用作医药产品或用于进一步处理(诸如，与诸如PEG等水溶性聚合物连结)来说都足够纯。某些分子可在不存在其它活性成分或蛋白质(除赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白等外)的情况下用作治疗剂，或其可与另一蛋白质或聚合物复合。通用纯化方法可以任何适当次序对包含多肽的细胞溶解产物、提取物、培养基、包涵体、宿主细胞的周质空间、宿主细胞的细胞质或其它材料或者由任何分离步骤产生的任何多肽混合物进行多种分离步骤中的任一种，所述分离步骤包括(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱("HPLC")、反相HPLC("RP-HPLC")、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复。用于进行本文中所述技术的设备和其它必要材料在市面上有售。泵、馏分收集器、监测器、记录器和整个系统可自例如AppliedBiosystems(FosterCity,CA)、Bio-RadLaboratories,Inc.(Hercules,CA)禾口AmershamBiosciences,Inc.(Piscataway,NJ)获f寻。包括(但不限于)交换基质材料、培养基和缓冲液的色谱材料也可自这些公司获得。可使用专用设备(诸如泵)更迅速地实现平衡和本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤(诸如洗涤和洗提)。市售泵包括(但不限于)11化0八0@泵P-50、蠕动泵P-l、泵P-901和泵P-903(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及SUPERFRAC⑧馏分收集器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。混合器也可用于形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1和管道混合器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。可使用任何市售监测器来监测色谱过程。这些监测器可用于收集如UV、pH值和传导率等信息。检测器的实例包括监测器UV-l、UVICORDSII、监测器UV-MII、监测器UV-卯0、监测器UPC-900、监测器pH/C-900和传导率监测器(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。实际上，整个系统在市面上有售，包括来自AmershamBiosciences(Piscataway,NJ)的各种AKTA⑧系统。在本发明的一个实施例中，例如，可通过首先在脲中使所得经纯化多肽变性，接着在合适pH值下于含有还原剂(诸如DTT)的TRIS缓冲液中稀释来还原多肽且使其变性。在另一个实施例中，多肽是以介于约2M到约9M之间的浓度范围于脲中变性，接着在约5.0到约8.0的范围内的pH值下于TRIS缓冲液中稀释。可随后培育此实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，在室温下将再折叠混合物培育4小时到24小时。随后可将还原且变性的多肽混合物进一步分离或纯化。如本文中所述，在进行任何后续分离步骤之前，可调整第一多肽混合物的pH值。另外，可使用所属领域中已知的技术来浓縮第一多肽混合物或其任何后续混合物。此外，可使用所属领域技术人员已知的技术将包含第一多肽混合物或其任何后续混合物的洗提缓冲液换成适用于下个分离步骤的缓冲液。离子交换色谱在一个实施例中且作为可选的额外步骤，可对第一多肽混合物进行离子交换色谱。通常参看IONEXCHANGECHROMATOGRAPHY:PRINCIPLESANDMETHODS(目录号18-1114-21，AmershamBiosciences(Piscataway,NJ))。市售离子交换柱包括HITRAP、HIPREP⑧和HILOAD⑧柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。这些柱利用强阴离子交换剂，诸如QSEPHAROSEFastFlow、QSEPHAROSEHighPerformance和QSEPHAROSEXL;强阳离子交换剂，诸如SPSEPHAROSEHighPerformance,SPSEPHAROSEFastFlow和SPSEPHAROSEXL;弱阴离子交换剂，诸如DEAESEPHAROSEFastFlow;和弱阳离子交换剂，诸如CMSEPHAROSEFastFlow(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。可在纯化过程的任何阶段对多月太进行阴离子或阳离子交换柱色谱以分离实质上经纯化的多肽。可使用任何适合阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。有用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包括(但不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述材料的复合物。阳离子交换基质可为任何适当的阳离子交换剂，包括强和弱阳离子交换剂。强阳离子交换剂可在较宽的pH值范围内保持离子化，且因此能够在较宽的pH值范围内结合多肽。然而，弱阳离子交换剂可随pH而失去离子化。举例来说，当pH值降到约pH4或pH5以下时，弱阳离子交换剂可失去电荷。适当的强阳离子交换剂包括(但不限于)带电荷官能团，诸如磺丙基(SP)、甲磺酸根(S)或磺乙基(SE)。阳离子交换基质可为优选在约2.5到约6.0的pH值范围内结合多肽的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可在约pH2.5到约pH5.5的pH值范围内结合多肽。阳离子交换基质可为在约3.0的pH值下结合多肽的强阳离子交换剂。或者，阳离子交换基质可为优选在约6.0到约8.0的pH值范围内结合多肽的强阳离子交换剂。阳离子交换基质可为优选在约8.0到约12.5的pH值范围内结合多肽的强阳离子交换剂。或者，强阳离子交换剂可在约pH8.0到约pH12.0的pH值范围内结合多肽。在装载多肽前，可例如使用若干柱体积的稀弱酸(例如4柱体积的20mM乙酸，pH3)平衡阳离子交换基质。平衡后，可加入多肽并在洗提实质上经纯化的多肽前，也使用诸如弱乙酸或磷酸溶液等弱酸溶液将柱洗涤1次到数次。举例来说，可使用约2-4柱体积的20mM乙酸(pH3)洗涤柱。还可使用其它洗涤液，例如2-4柱体积的0.05M乙酸钠(pH5.5)或者与0.1M氯化钠混合的0.05M乙酸钠(pH5.5)。或者，使用所属领域已知的方法，使用若干柱体积的稀弱碱来平衡阳离子交换基质。或者，可通过使阳离子交换基质与具有足够低pH值或离子强度的缓冲液接触以从所述基质中置换多肽来洗提实质上经纯化的多肽。洗提缓冲液的pH值可在约pH2.5到约pH6.0的范围内。更具体来说，洗提缓冲液的pH值可在约pH2.5到约pH5.5、约pH2.5到约pH5.0的范围内。洗提缓冲液可具有约3.0的pH值。此外，洗提缓冲液的量可极大变化且一般将在约2到约IO柱体积的范围内。在将多肽吸附到阳离子交换基质上之后，可通过使基质与具有足够高pH值或离子强度的缓冲液接触以从所述基质中置换多肽来洗提实质上经纯化的多肽。用于实质上经纯化多肽的高pH值洗提的适当缓冲液可包括(但不限于)浓度在至少约5mM到至少约lOOmM范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES和MES缓冲液。M^^可根据所属领域技术人员已知的适合方案进行RP-HPLC以纯化蛋白质。例如参看Pearson等人，ANALBIOCHEM.(1982)124:217-230(1982);Rivier等人，J.Chrom.(1983)268:112-119;Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359:391-402。可对多肽进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的多肽。在这点上，可使用具有多种长度(包括(但不限于)至少约C3到至少约C3Q、至少约C3到至少约C20或至少约C3到至少约C18)的烷基官能团的二氧化硅衍生树脂。或者，可使用聚合性树脂。举例来说，可使用TosoHaasAmberchromeCG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种垸基链长度的氰基或聚合性树脂。此外，可用诸如乙醇等溶剂洗涤RP-HPLC柱。SourceRP柱为RP-HPLC柱的另一实例。含有离子配对剂和有机改性剂(诸如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的合适洗提缓冲液可用于从RP-HPLC柱洗提多肽。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵和乙酸三乙基铵。可使用一种或一种以上梯度或等度条件来进行洗提，其中优选减少分离时间且降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。用于本文中的合适洗提缓冲液的实例可包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。疏水相互作用色谱纯化技术可对多肽进行疏水相互作用色谱(HIC)。通常参看HydrophobicInteractionChromatographyHandbook:PrinciplesandMethods(百录号18-1020-90，AmershamBiosciences(Piscataway,NJ))，其以引用的方式并入本文中。适合HIC基质可包括(但不限于)经垸基或芳基取代的基质，诸如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，所述基质包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质和混合模式树脂(包括(但不限于)聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水相互作用柱色谱的商业来源包括(但不限于)HITRAP、HIPREP⑧和HILOADfe(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)<>简单地说，在装载之前，可使用所属领域技术人员已知的标准缓冲液(诸如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。可将硫酸铵用作装载HIC柱的缓冲液。在装载多肽后，随后可使用标准缓冲液和条件来洗涤柱以去除不需要的材料，但将多肽留在HIC柱上。可用约3到约IO个柱体积的标准缓冲液(诸如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液)来洗提多肽。也可使用例如使用磷酸钾梯度的不断降低的线性盐梯度来洗提分子。随后可例如通过过滤(诸如透滤或超滤)来浓縮洗出液。可利用透滤来去除用于洗提多肽的盐。其它纯化技术可对第一多肽混合物或其任何后续混合物进行使用例如凝胶过滤(GelFILTRATION:PRINCIPLESANDMethods(目录号18-1022-18,AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)，其以引用的方式并入本文中)、羟基磷灰石色谱(适合基质包括(但不限于)HA-Ultrogel、HighResolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羟基磷灰石(BioRad)、Bio-GelHTP羟基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等的另一分离步骤，以去除任何过量盐且用适合缓冲液来代替所述缓冲液以用于下个分离步骤或甚至最终药物产品的调配。可在本文中所述的各步骤中使用所属领域技术人员已知的技术监测多肽(包括实质上经纯化的多肽)的产率。这些技术也可用于在最后分离步骤后评定实质上经纯化的多肽的产率。举例来说，可使用具有多种焼基链长度的若干反相高压液相色谱柱(诸如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC)中的任一种来监测多肽的产率。在本发明的特定实施例中，在各纯化步骤后多肽的产率可为各纯化步骤的原材料中的多肽的至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98Q/。、至少约99%、至少约99.9%或至少约99.99%。可使用诸如SDS-PAGE等标准技术或通过使用Western印迹法和ELISA检定测量多肽来测定纯度。举例来说，可针对从阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离的蛋白质产生多克隆抗体。抗体也可用于探测污染性宿主细胞蛋白质的存在。RP-HPLC材料VydacC4(Vydac)是由硅胶粒子组成，其表面带有C4垸基链。多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水相互作用强度的差别。用稀三氟乙酸中的乙腈梯度来进行洗提。使用不锈钢柱(填充2.8到3.2升VydacC4硅胶)进行制备型HPLC。通过加入三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogel洗出液且将其装载于VydacC4柱上。对于洗涤和洗脱来说，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集洗提部分且立即用磷酸盐缓冲液将其中和。汇集在IPC限度内的多肽洗提部分。DEAESepharose(Pharmacia)材料是由与琼脂糖凝胶珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。通过离子相互作用来介导多肽与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在洗掉这些物质之后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来去除痕量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱且用具有增加的离子强度的缓冲液洗提多肽。用DEAESepharosefastflow填充柱。调节柱体积以确保多肽装载量在每毫升凝胶3-10mg多肽的范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/钾)洗涤柱。装载汇集的HPLC洗出液洗提部分且用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，用洗提缓冲液(氯化钠、磷酸钠/钾)将多肽从柱洗提且根据标准洗提曲线收集于单一洗提部分中。将DEAESepharose柱的洗出液调节到指定传导率。将所得药物物质无菌过滤到铁氟隆(Teflon)瓶中且在-7(TC下储存。可使用的其它方法包括(但不限于)去除内毒素的步骤。内毒素为位于革兰氏阴性(Gram-negative)宿主细胞(诸如，大肠杆菌)的外侧膜上的脂多糖(LPS)。所属领域技术人员已知用于降低内毒素含量的方法且其包括(但不限于)使用二氧化硅支撑物、玻璃粉或羟基磷灰石的纯化技术；反相色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、阴离子交换色谱；疏水相互作用色谱；这些方法的组合等。可能需要修改或其它方法以从所关注的多肽中去除污染物(诸如共迁移蛋白质)。用于测量内毒素含量的方法已为所属领域技术人员所知且包括(但不限于)鲎变形细胞溶解物(LimulusAmebocyteLysate，LAL)检定。EndosafeTM-PTS检定为单管比色系统，其利用预先装载有LAL试剂、发色基质和对照标准品内毒素的药包以及手持分光光度计。其它方法包括(但不限于)动态LAL法，其为比浊度分析法并且使用96孔形式。可使用多种方法和程序评定包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的蛋白质的产率和纯度，所述方法和程序包括(但不限于)Bradford检定、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯染色SDS-PAGE(coomassiestainedSDS-PAGE)、质谱(包括(但不限于)MALDI-TOF)和所属领域技术人员己知的表征蛋白质的其它方法。其它方法包括(但不限于)与蛋白质染色方法联合的SDS-PAGE、免疫印迹、基质辅助激光解吸附/离子化质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。VIII.替代系统中的表达已使用若干种策略以在非重组宿主细胞、经诱变宿主细胞或无细胞系统中将非天然氨基酸引入蛋白质中。这些系统也适用于制备本发明的多肽。具有反应性侧链的氨基酸(诸如Lys、Cys和Tyr)的衍生化会使得赖氨酸转化为N、乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。利用肽片段的酶促接合和天然化学接合的新近发展，有可能制造较大蛋白质。例如参看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,A皿Rev.Biochem,69:923(2000)。化学肽接合和天然化学接合描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO02/098902和WO03/042235中，这些专利都是以引用的方式并入本文中。己使用将经所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制tRNA加到能够支持蛋白质生物合成的活体外提取物中的通用活体外生物合成方法，以将IOO个以上非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参看V.W.Cornish,D.Mendel和P.GSchultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34:621(1995);C丄Noren，S丄Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,XScience244:182-188(1989);和J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,jB/o5y"/7ze"'cwYe-s/ec(/c/ncor_pom〃owo/flwow-w她m/Z柳ajw/ype/"V/e，LAm.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导的研究。已提出称作选择性压力并入的活体内方法以利用野生型合成酶的杂乱性。例如参看N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,RM.Dong,L.Moroder和R.Huber,FASEB13:41(1999)。使向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株生长于含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中，而靶基因的转录受到阻遏。在稳定生长期开始时，天然氨基酸被耗尽且经非天然氨基酸类似物置换。对重组蛋白质表达的诱导使得含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，已使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，且其在UV光谱中显示两个易于鉴别的特征性肩峰，例如参看C.Minks,R.Huber，L.Moroder和N.Budisa,Anal.Biochem.,284:29(2000);已使用三氟甲硫氨酸代替噬菌体T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通过"FNMR研究其与壳寡糖配体的相互作用，例如参看H.Duewel，E.Daub,V.Robinson和J.F.Honek,Biochemistry,36:3404(1997):且已并入三氟亮氨酸代替亮氨酸，从而使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka,T.Nakajima，W.RDeGrado和D.A.Tirrell.Angew.Chem.Int.Ed.Engl..40:1494(2001)。此外，将硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸并入各种重组蛋白质中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参看W.A.Hendrickson,J.R.Horton和D.M.Lemaster,EMBOJ"9:1665(1990);J.O.Boles,K.Lewinski，M.Kunkle,J.D.Odom，B.Dunlap，L.Lebioda禾口M.Hatada，Nat.Struct.Biol"1:283(1994);N.Budisa，B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn，J.Kellermann和R.Huber,Eur.J.Biochem.,230:788(1995);和N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher，A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol.,270:616(1997)。也己有效地并入具有烯或炔官能团的甲硫氨酸类似物，从而允许通过化学方式对蛋白质进行额外修饰。例如参看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell,FEBSLett.,428:68(1998);J.C.MvanHest,K.L.Kiick和D.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.122:1282(2000);以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);美国专利第6,586,207号；美国专利公开案第2002/0042097号，其是以引用的方式并入本文中。这种方法的成功取决于氨酰基tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，所述合成酶通常需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。扩展这种方法的范围的一种方式是放宽氨酰基tRNA合成酶的底物特异性，这已在有限数量的情况下实现。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中用Gly置换Ala294可增加底物结合口袋的尺寸，且导致对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)对tRNAPhe的酰化。参看M.Ibba,P.Kast和H.Hennecke，Biochemistry,33:7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸替代苯丙氨酸。例如参看M.Ibba和H.Hennecke,FEBSLett"364:272(1995);以及N.Sharma,R.Furter,P.Kast和D.A.Tirrell，FEBSLett.,467:37(2000)。类似地，显示接近大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phel30Ser允许比酪氨酸更有效地并入重氮酪氨酸。参看F.Hamano-Takaku,T.Iwama，S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soil和S.Nishimura,J.Biol.Chem.,275:40324(2000)。在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略为修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶不能区分在结构上与同源天然氨基酸类似的氨基酸且因此将其活化。此错误在单独位点上得到校正，这使来自tRNA的错配氨基酸去酰基化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能且被并入。近来已用缬氨酰基tRNA合成酶(ValRS)证实这种方法。参看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle，T.L.Hendrickson,V.deCrecy-Lagard，P.Schimmel禾口P.Marliere，Science,292:501(2001)。ValRS可使具有Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)的tRNAVal错误氨酰基化；随后通过编辑区域水解这些非同源氨基酸。在使大肠杆菌染色体随机诱变之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地使tRNAVal装有Cys。由于Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团经Abu中的-CH3置换)，因此当使这种突变大肠杆菌菌株在存在Abu的情况下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示在天然蛋白质的各缬氨酸位置处约24%的缬氨酸经Abu置换。固相合成和半合成方法也已允许合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说，参看以下公开案和其中所引用的如下参考文献Crick，F丄C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.Gewem/wa^eo/Aecode/orjwofe/肌Nature,192:1227-1232(1961);Hofmanii,K.,Bo皿，H.5h/We51owjw/y/eW^.XOT/.7T2ge#ec/o/_p>razo/e-//w/cazo/erep/acewew&ow5"-;n^efwacdva"wgj^o^wcyo/awiS-pepf/cfeJ.AmChem,88(24):5914-5919(1966);Kaiser,E.T.5>wA"/c卿r露/zey6/o/og/ca//_yflc"'ve/e/"'cfesprafez>wAccChsmRss,22:47-54(1989》Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.尸ep"Weseg附e"/co一/wgc加(yzedse/nz'5^wf/j"z'ce"2^meA/(wm6/77/57w,JAmChemSoc,109:3808-3810(1987);Schnolzer,M.，Kent,SBH.Cow加wc"'wg/7r他iwdoveto7z'wgwpro/"e"e<i5^w/7ze"'cpeWc/w6ac編we-e喂-,W//77戸&認，Science,256(5054),221-225(1992);Chaiken,I.M.Sgm\yvw^;e//c/印/zWgsaw<iproW肌CRCCritRevBiochem,11(3):255-301(1981);Offord,R.E.iVo/"e/we"g/"ee〃'wgcAe脂'ca//we^msProteinEng.,1(3):151-157(1987);禾口Jackson,D.Y"Burnier,J.,Quan,C,Stanley,M.,Tom，J.,Wells,J.A.XZ)e'gwe<iPepfWeZigase/or7bfa/办w^je57'so/i/6owwc/ease^L^"wa^-a/Cfl^a/WcScisncs'266,(5183):243(1994)。已使用化学修饰在活体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸的多种非天然侧链引入蛋白质中。例如参看，Corey,D.R.，Schultz,P.G.Geweraffo"o/a/y^)WdiSegwe"ce-印e"ycs/wg/e-WrawdeGfifeox,/6o肌c/eawe,Scisnc6,238(4832):1401-1403(1987);Kaiser,E.T.,LawrenceD.S.，Rokita，S.E.77zec/ze附z'ca/wo<izyca^/owo/e"2^ma/7'c577ec(/c"乂AnnuRevBiochem,54:565-595(1985);Kaiser,E.T.,Lawrence,D.S.C7ze/w/ca/7wMfa"0wo/ewyz/weac"ves"es,Science,226(4674):505-511(1984);Neet，K.E.,NanciA,Koshland,D.E./Vo;er/z'Mo/Az'o/->yw6"/&/"，JBiol.Chem.243(24):6392-6401(1968);Polgar,L.(编)，M丄.Bender,jwewe"2ymecowto'm'wga57M^2"/cof〃>>"c"'ve77n'o/->si/6////57>2.J.AmChemSoc,88:3153-3154(1966);和Pollack,S丄，Nakayama,G.Schultz,P.G./"/rac^"/owo/wwc/eo//n7esawe/^e"rosco//cpraftes/wfofl""'6o办cow6/w/wgWes'Sci6nc6,242(4881):1038-1040(1988)。或者，使用以化学方式修饰的氨酰基tRNA的生物合成方法已用于将若干种生物物理探针并入在活体外合成的蛋白质中。参看以下公开案和其中所引用的参考文献Brunner，j._/VewJ7zc^o/fl6e"wgflwdcra^Z/wA/wgtm"/jo成Annu.RevBiochem,62:483-514(1993);禾口Krieg,U.C.,Walter,P.，Hohnson，A.E.i>/20tomw1y//wA7'wg0/57'g"ot/se《we"ceo/Natl.Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。先前己证实，通过将以化学方式氨酰基化的抑制tRNA加入经含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应，可在活体外将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，可使用对特定氨基酸来说为营养缺陷型的菌株，用密切结构同源物取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参看Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.爿gewera/m"Aoc，s"e層577e"ycz'wcorj!7oY^/owo/w朋她ra/07m>joacfc^/"toj9raf"7w，Science,244:182-188(1989);M.W.Nowak等人，Science268:439-42(1995);Bain，J.D.，Glabe，C.G"Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.，Diala，E.S.5/os，^2"/c57'fe邵ec折c/"co/-/wa/z'ow0/awow-wa/wa/aw/woaczW/wfoat;o(ype/^We,J.AmChemSoc.111:8013-8014(1989);N.Budisa等人，FASEBJ.13:41-51(1999);Ellman,J.A.，Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,CJ.，Schultz,P.G.所o^w^2e"c7w"/zod/or/"fro<^c/"gimwa/wa/fl脂'woac/cfe甜e邵e"yco^(y/WoproW"51，MethodsinEnz.,第202巻，301-336(1992);禾卩Mendel,D.，Cornish,V.W.&Schultz,P.G.SzYe層Z^e"WMw^atggwes^w"/zEx戸"c/edGe"e"cCWe,AnnuRevBiophvs.BiomolStruct.24,435-62(1995)。举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制tRNA且用非天然氨基酸以化学方式使其氨酰基化。使用常规定点诱变在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。例如参看Sayers，J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'五xo肌c/eoyez'w//os/^orof/n'o她-6fiwedo//go/7Wc/eo"We-<^>e"ec/NucleicAcidsRes,16(3):791-802(1988)。当将酰基化抑制tRNA和突变基因组合于活体外转录/翻译系统中时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸，得到在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用fH]-Phe的实验和使用a-羟基酸的实验证实，在UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且未在蛋白质中的任何其它位点处并入此氨基酸。例如参看，Noren等人，局J:文；Kobayashi等人，(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432;和Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.幼e-5^eci/c/wcor;o/-a"'o/7o/wove/6acA:6owez'wfo;論/叫Science.255(5041):197-200(1992)。可通过任何方法或技术(包括(但不限于)化学或酶促氨酰基化)利用所需氨基酸将tRNA氨酰基化。氨酰基化可通过氨酰基tRNA合成酶或其它酶分子(包括(但不限于)核糖酶)实现。术语-"核糖酶"可与"催化性RNA"互换。Cech和同事(Cech,1987，Science,236:1532-1539;McCorkle等人，1987,ConceptsBiochem.64:221-226)证实存在可充当催化剂的天然存在的RNA(核糖酶)。然而，尽管仅证实这些天然RNA催化剂对核糖核酸底物作用以供裂解和剪接，但近来核糖酶人工开发的发展已将催化谱系扩大到各种化学反应。研究已鉴别出可催化自身(2')3'末端氨酰基RNA键的RNA分子(Illangakekare等人，1995Science267:643-647)，以及可将氨基酸从一个RNA分子转移到另一个的RNA分子(Lohse等人，1996,Nature381:442-444)。美国专利申请公开案2003/0228593(其以引用的方式并入本文中)描述构建核糖酶的方法和其于利用天然编码和非天然编码的氨基酸使tRNA氨酰基化的用途。可使tRNA氨酰基化的酶分子(包括(但不限于)核糖酶)的基质固定形式使得能够有效亲和纯化氨酰基化产物。适当基质的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。用于氨酰基化的基质固定形式的核糖酶的制备和用途描述于ChemistryandBiology2003,10:1077-1084和美国专利申请公开案2003/0228593中，其以引用的方式并入本文中。化学氨酰基化方法包括(但不限于)避免在氨酰基化中使用合成酶的由下述文献介绍的方法Hecht和同事(Hecht,S.M.Ace.Chem.Res.1992，25，545;Heckler,T.G;Roesser,J.R.;Xu,C;Chang,P.;Hecht，S.M.Biochemistry1988，27,7254;Hecht，S.M.;Alford,B.L.;Kuroda,Y.;Kitano,S.J.Biol.Chem.1978，253，4517);和Schultz,Chamberlin,Dougherty等人(Cornish,V.W.;Mendel,D.;Schultz,P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621;Robertson,S.A.;Ellman,J.A.;Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722;Noren,C.J.;Anthony-Cahill,S.J.;Griffith,M.C.;Schultz,P.GScience1989，244，182;Bain,J.D.;Glabe,C.G.;Dix,T.A.;Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989，111,8013;Bain,J.D.等人Nature1992,356,537;Galli糧,J.P.;Lester,H.A.;Dougherty,D.A:Chem.Biol.1997,4,740;Turcatti等人J.Biol.Chem.1996,271，19991;Nowak,M.W.等人Science,1995，268，439;Saks,M.E.等人J.Biol.Chem.1996,271,23169;Hohsaka,T.等人J.Am.Chem.Soc.1999,121,34)。所述方法或其它化学氨酰基化方法都可用于使tRNA分子氨酰基化。产生催化性RNA的方法可能涉及产生单独的随机化核糖酶序列集合；.对所述集合进行定向进化；针对所需氨酰基化活性筛选所述集合；和选择展现所需氨酰基化活性的核糖酶序列。核糖酶可包含促进酰基化活性的基序和/或区域，诸如GGU基序和富集U的区域。举例来说，已报导富集U的区域可促进氨基酸底物的识别，且GGU基序可与tRNA的3'末端形成碱基对。GGU基序与富集U区域的组合可促进同时识别氨基酸与tRNA，且因此促进tRNA的3'末端的氨酰基化。可使用与tRNAAsnaxe连结的部分随机化r24mini通过活体外选择，随后系统工程改造活性克隆中所见的一致序列来产生核糖酶。通过此方法获得的例示性核糖酶称为"Fx3核糖酶"并且描述于美国公开申请案第2003/0228593号中，其内容是以引用的方式并入本文中，所述核糖酶可充当合成载有同源非天然氨基酸的各种氨酰基化tRNA的通用催化剂。在基质上固定可用于促成氨酰基化tRNA的有效亲和纯化。适当基质的实例包括(但不限于)琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁珠。可通过利用RNA的化学结构将核糖酶固定于树脂上，诸如，RNA核糖上的3'-顺-二醇可经高碘酸盐氧化以得到相应的二醛，以便促进RNA于树脂上的固定。可使用各种类型的树脂，包括廉价的酰肼树脂，其中还原胺化使得树脂与核糖酶之间相互作用以形成不可逆键。可通过此项柱上氨酰基化技术来显著促进氨酰基tRNA的合成。Kourouklis等人Methods2005;36:239-4中描述一种基于柱的氨酰基化系统。氨酰基化tRNA的分离可以多种方式实现。一种适当的方法是利用缓冲液(诸如含10mMEDTA的乙酸钠溶液；含有50mMN-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(3-丙垸磺酸)、12.5mMKC1(pH7.0)、10mMEDTA的缓冲液；或者简单地EDTA缓冲的水(pH7.0))从柱中洗提氨酰基化tRNA。可将氨酰基化tRNA加到翻译反应中以便将使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻译反应所产生的多肽的所选位置中。可使用本发明的氨酰基化tRNA的翻译系统的实例包括(但不限于)细胞溶解产物。细胞溶解产物提供由输入mRNA活体外翻译多肽所需的反应组件。所述反应组件的实例包括(但不限于)核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始因子和延长因子以及其它与翻译有关的因子。此外，翻译系统可为批量翻译或分隔翻译(compartmentalizedtranslation)。批量翻译系统组合单一隔室中的反应组件，而分隔翻译系统使翻译反应组件与可抑制翻译效率的反应产物分离。这些翻译系统在市面上有售。此外，可使用偶联式转录/翻译系统。偶联式转录/翻译系统允许将输入DNA转录成相应的mRNA，而mRNA又经反应组件翻译。市售偶联式转录/翻译的实例为RapidTranslationSystem(RTS，RocheInc.)。所述系统包括含有大肠杆菌溶解产物的混合物以提供诸如核糖体和翻译因子等翻译组件。此外，包括RNA聚合酶以将输入DNA转录成mRNA模板以用于翻译。RTS可经由插入反应隔室(包括供应/废料隔室和转录/翻译隔室)之间的膜分隔反应组件。可通过包括(但不限于)转移酶、聚合酶、催化性抗体、多功能蛋白等的其它试剂进行tRNA的氨酰基化。Lu等人于MolCell.2001年10月；8(4):759-69中描述一种以化学方式将蛋白质接合到含有非天然氨基酸的合成肽的方法(称为蛋白质接合)。也已使用显微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看，M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.GLabarca，S.K.Silverman,W.G.Zhong，J.Thorson,J.N.Abelson，N.Davidson,P.G.Schultz,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Scenes,268:439(1995);以及D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645〖2000)。将爪蟾卵母细胞(Xenopusoocyte)与活体外制得的两种RNA物质共注射在所关注的氨基酸位置处具有UAG终止密码子的编码靶蛋白的mRNA，和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制tRNA。随后所述卵母细胞的翻译机器在UAG指定的位置处插入非天然氨基酸。这种方法已允许通常不适用于活体外表达系统的整合膜蛋白的活体内结构-功能研究。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移测量距离，例如参看G.Turcatti,K.Nemeth，M.D.Edgerton,U.Meseth,F.Talabot,M.Peitsch，J.Knowles,H.Vogel和A.Chollet,J.Biol.Chem.,271:19991(1996);并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露的残基，例如参看J.P.Gallivan,H.A.Lester和D.A.Dougherty,Chem.Biol..4:739(1997);使用经笼蔽酪胺酸类似物以实时监测离子通道中的构象变化，例如参看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Neuron,20:619(1998);以及使用a羟基氨基酸以改变用于探究其门控机制的离子通道主链。例如参看P.M.England,Y.Zhang，D.A.Dougherty和H.A.Lester,￡§11，96:89(1999);以及T.Lu，A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan,P.G.Schultz和J.Yang,Nat.Neurosci.4:239(2001)。活体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力提供多种优点，包括(但不限于)突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活有机体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白于治疗性治疗和诊断使用中的用途。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性和其它性质的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展理性且系统地操纵蛋白质结构的能力，从而探查蛋白质功能并且产生具有新颖特性的新蛋白质或有机体。在位点特异性地并入p-F-Phe的一次尝试中，将酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨酰基-tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。例如参看R.Furter,ProteinSci.,7:419(1998)。使用无细胞(活体外)翻译系统获得本发明聚核苷酸的表达也是可能的。翻译系统可为细胞或无细胞翻译系统，并且可为原核或真核翻译系统。细胞翻译系统包括(但不限于)全细胞制剂，诸如可将所需核酸序列转录成mRNA并且翻译mRNA的渗透细胞或细胞培养物。无细胞翻译系统在市面上有售并且众所周知多种不同类型和系统。无细胞系统的实例包括(但不限于)原核细胞溶解产物，诸如大肠杆菌溶解产物；和真核细胞溶解产物，诸如麦胚提取物、昆虫细胞溶解产物、兔网织红细胞溶解产物、兔卵母细胞溶解产物和人类细胞溶解产物。当所得蛋白质经糖基化、磷酸化或以其它方式修饰时，由于许多所述修饰仅可能在真核系统中发生，故真核提取物或溶解产物可为优选的。这些提取物和溶解产物中有一些在市面上有售(Promega;Madison,Wis.;Stratagene;LaJolla,Calif.;Amersham;ArlingtonHeights,111.;GIBCO/BRL;GrandIsland,N.Y.)。膜提取物(诸如含有微粒体膜的犬胰腺提取物)也可用，其可用于翻译分泌蛋白质。在可包括mRNA作为模板(活体外翻译)或DNA作为模板(组合式活体外转录与翻译)的这些系统中，活体外合成是由核糖体指导。已进行相当多的尝试来研发无细胞蛋白质表达系统。例如参看，Kim,D.M.和J.R.Swartz,祝ofec/mo/ogyflmf万/oe"g/raeen"g,74:309-316(2001);Kim,D.M.和J.R.Swartz，22,1537-1542,(2000);Kim,D.M.和J.R.Swartz,B她cA"o/ogyiVogmw,16,385-390,(2000);Kim,D.M.禾口J.R.Swartz,5Zo/ec/mo/ogyflmB/oewg/weenwg,66,180-188,(1999);以及Patnaik,R.禾口J.R.Swartz,5z'o"cAm々M^24,862-868,(1998);美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO00/55353;WO卯/05785，其是以引用的方式并入本文中。可用于表达包含非天然编码的氨基酸的多肽的另一种方法包括mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts和J.Szostak,iVoc.A^/爿c^/.Scf.94:12297-12302(1997);A.Frankel等人，C/^脂'W7&5/o/ogy10:1043-1050(2003)。在本方法中，在核糖体上将与嘌呤霉素(puromycin)连接的mRNA模板翻译成肽。如果已对一个或一个以上tRNA分子进行修饰，那么也可将非天然氨基酸并入肽中。在已读取最后一个mRNA密码子后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽连结物在活体外检定中具有引人关注的特性，那么可容易地由mRNA序列揭示其身份。以此方式，可筛选包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽的文库，以鉴别具有所需特性的多肽。最近，已报导利用经纯化组分的活体外核糖体翻译，其允许合成经非天然编码的氨基酸取代的肽。例如参看A.Forster等人，iVoc.A^/^caJ.Sc/.100:6353(2003)。还可使用重建翻译系统。已成功地使用经纯化翻译因子的混合物以及溶解产物或补充有经纯化翻译因子(诸如，起始因子-l(IF-l)、IF-2、IF-3(a或(3)v延长因子T(EF-Tu)或终止因子)的溶解产物的组合将mRNA翻译成蛋白质。无细胞系统也可为偶联式转录/翻译系统，其中如Cwrw",Prafocofa/"Mo/ecw/ar所o/ogy(F.M.Ausubel等人编辑，WileyInterscience,1993)(其以引用的方式特别并入本文中)中所述，将DNA引入所述系统中，转录成mRNA并翻译mRNA。在真核转录系统中转录的RNA可为异核RNA(hnRNA)或者5'端帽子(7-甲基鸟苷)且3'端加多聚A尾的成熟mRNA(其可在某些翻译系统中具有优势)形式。举例来说，在网织红细胞溶解产物系统中，以高效率翻译加帽的mRNA。IX.与多肽偶合的大分子聚合物可使用本文所述的组合物、方法、技术和策略实现对本文所述的非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包括将其它官能团并入多肽的非天然氨基酸组分上，包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、聚核苷酸、DNA、RNA、反义聚核苷酸、糖、水溶性树突状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼蔽部分、光化辐射可激发部分、可光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、并有重原子的部分、可化学裂解基团、可光裂解基团、延长的侧链、碳键联糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、有毒部分、同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米递质、放射性核苷酸、放射性递质、中子捕获剂，或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。作为本文所述的组合物、方法、技术和策略的说明性非限制性实例，以下描述将集中在将大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽中，同时应了解相关组合物、方法、技术和策略也适用于(必要时利用适当修饰且所属领域技术人员可利用本文的揭示内容进行)添加其它官能团，包括(但不限于)上文所述的官能团。可将多种大分子聚合物和其它分子与本发明的多肽键联，以调节多肽的生物特性和/或对分子提供新颖生物特性。可将这些大分子聚合物经由天然编码的氨基酸、非天然编码的氨基酸，或者天然或非天然氨基酸的任何官能取代基，或添加到天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能团与多肽键联。聚合物的分子量可在广泛范围内，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7，000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、卯0Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1，000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。本发明提供实质上均质的聚合物:蛋白质连结物制剂。如本文所使用，"实质上均质"意思指据观察聚合物:蛋白质连结物分子大于总蛋白质的一半。聚合物:蛋白质连结物具有生物活性并且本文所提供的本发明的"实质上均质"的聚乙二醇化多肽制剂为足够均质以展现均质制剂的优势(例如，便利临床应用中每批与每批之间药物动力学的可预计性)的制剂。还可选择制备聚合物:蛋白质连结物分子的混合物，且本文所提供的优势在于可选择包括在混合物中的单一聚合物:蛋白质连结物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与各种数量的所连接的聚合物部分(即，二、三、四等)的混合物并且将所述连结物与使用本发明的方法所制备的单一聚合物:蛋白质连结物组合，且得到具有预定的单一聚合物:蛋白质连结物比例的混合物。所选聚合物可为水溶性聚合物，因此与其连接的蛋白质不会在水性环境(诸如生理学环境)中沉淀。聚合物可为分枝或未分枝的。对于最终产品制剂的治疗用途来说，聚合物将为医药学上可接受的。聚合物的实例包括(但不限于)聚垸基醚和其烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙烯/丙二醇和其经甲氧基或乙氧基封端的类似物，尤其聚氧乙二醇，后者也称为聚乙二醇或PEG);聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基垸基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺(例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚羟基垸基丙烯酸酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟基烷基纤维素；壳多糖和其衍生物，例如壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基壳多糖、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸酯；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉(pullulan)和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，诸如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三聚物；其混合物；和上述物质的衍生物。聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将变化，其在反应混合物中的浓度也将变化。一般来说，可通过所选择的聚乙二醇的分子量和可用反应性基团的可用数量确定最佳比率(就反应效率来说，因为存在极少量过量的未反应的蛋白质或聚合物)。就分子量来说，通常聚合物的分子量越高，那么可与蛋白质连接的聚合物分子的数量就越少。类似地，当优化这些参数时，应考虑聚合物的分枝情况。一般来说，分子量越高(或分枝越多)，那么聚合物:蛋白质的比率就越高。如本文所使用且当涵盖PEG:多肽连结物时，术语"治疗有效量"是指对患者提供所需益处的量。所述量将随个体的不同而不同，且将视多种因素(包括患者的总体身体情况和待治疗的病状的潜在病因)而定。用于疗法的多肽的量提供可接受的变化率且在有益水平下保持所需反应。可由所属领域技术人员使用公开可用的材料和程序来容易地确定本发明组合物的治疗有效量。水溶性聚合物可为任何结构形式，包括(但不限于)线性、叉状或分枝形式。通常，水溶性聚合物为聚(亚烷二醇)，诸如聚(乙二醇)(PEG)，但也可使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG描述本发明的某些实施例。PEG为众所周知的水溶性聚合物，其在市面上有售或可根据所属领域技术人员己知的方法通过使乙二醇开环聚合来制备(Sandler和Karo,PolymerSynthesis,AcademicPress:NewYork,第3巻，第138-161页)。术语"PEG"广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子(不考虑PEG的尺寸或其末端的修饰)，并且可以下式表示为与多肽键联XO-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y，其中n为2到10,000且X为H或末端修饰，包括(但不限于)Cl4院基、保护基或末端官能团。在一些情况下，本发明中使用的PEG在一个末端以羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH3("甲氧基PEG")。或者，PEG可以反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包括通常用于与20种常见氨基酸中所见的官能团反应的反应性基团(包括(但不限于)马来酰亚胺基、活性碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯酯)、活性酯(包括(但不限于)N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性但与非天然编码的氨基酸中存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)叠氮基、炔基)。应注意，在上式中以Y表示的PEG的另一末端将直接或经由天然存在或非天然编码的氨基酸间接连接到多肽。举例来说，Y可为与多肽胺基(包括(但不限于)赖氨酸s胺或N末端)的酰胺、氨基甲酸酯或脲键。或者，Y可为与硫醇基(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基)的马来酰亚胺键。或者，Y可为与经由20种常见氨基酸通常不可得的残基的键。举例来说，PEG上的叠氮基可与多肽上的炔基反应以形成Huisgen[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与非天然编码的氨基酸中存在的叠氮基反应以形成类似产物。在一些实施例中，强亲核试剂(包括(但不限于)肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码的氨基酸中存在的醛或酮基反应以形成腙、肟或縮氨基脲，适当时，在一些情况下可通过用适当的还原剂处理将其进一步还原。或者，可经由非天然编码的氨基酸将强亲核基团并入多肽中并且将其用于优先与水溶性聚合物中存在的酮或醛基反应。PEG的任何分子质量可视实际需要使用，包括(但不限于)约100道尔顿(Dalton，Da)至!J100,000Da或视需要更高(包括(但不限于)有时为0.1-50kDa或10-40kDa)。PEG的分子量可在广泛范围内，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间。PEG的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约10,000Da与约40，000Da之间。还可使用支链PEG，包括(但不限于)各链的MW在1-100kDa范围内(包括(但不限于)1-50kDa或5-20kDa)的PEG分子。支链PEG各链的分子量可(包括(但不限于))介于约l，OOODa与约100,000Da或更高之间。支链PEG各链的分子量可介于约l，OOODa与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1，000Da。在一些实施例中，支链PEG各链的分子量介于约l，OOODa与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG各链的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG各链的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG各链的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。多种PEG分子描述于(包括(但不限于))ShearwaterPolymers,Inc.目录、NektarTherapeutics目录中，其以引用方式并入本文中。一般来说，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码的氨基酸反应。举例来说，可使用具有用于与氨基酸侧链反应的炔和叠氮基部分的PEG衍生物将PEG与如本文所述的非天然编码的氨基酸连接。如果非天然编码的氨基酸包含叠氮基，那么PEG通常将含有炔部分以实现[3+2]环加成产物的形成，或者含有膦基的活性PEG物质(即，酯、碳酸酯)以实现酰胺键的形成。或者，如果非天然编码的氨基酸包含炔，那么PEG通常将含有叠氮基部分以实现[3+2]Huisgen环加成产物的形成。如果非天然编码的氨基酸包含羰基，那么PEG通常将包含有效的亲核基团(包括(但不限于)酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)以便分别实现相应腙、肟和縮氨基脲键的形成。在其它替代性实例中，可使用上述反应性基团的相反取向，亦即，非天然编码的氨基酸中的叠氮基部分可与含有炔的PEG衍生物反应。在一些实施例中，具有PEG衍生物的多肽变体含有可与非天然编码的氨基酸侧链上存在的化学官能团反应的化学官能团。在一些实施例中，本发明提供含叠氮基和乙炔的聚合物衍生物，其包含平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚(乙二醇)。然而，应了解，包括(但不限于)聚(乙二醇)和其它相关聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇))的多种水溶性聚合物也适用于实践本发明且术语PEG或聚(乙二醇)的使用意欲涵盖且包括所有所述分子。术语PEG包括(但不限于)任何形式的聚(乙二醇)，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、叉状PEG、分枝PEG、侧接PEG(即，PEG或相关聚合物具有一个或一个以上与聚合物主链侧接的官能团)或具有可降解键的PEG。PEG通常澄清，无色，无臭，可溶于水，对热稳定，对许多化学剂呈惰性，不水解或变质并且通常无毒。认为聚(乙二醇)为生物可相容的，据悉PEG能够与活组织或有机体共存而不引起危害。更具体来说，PEG实质上为非免疫原性的，据悉PEG不倾向于在体内产生免疫反应。当与体内具有某种所需功能的分子(诸如生物活性剂)连接时，PEG倾向于遮蔽试剂并且可减少或消除任何免疫反应，从而有机体可忍受所述试剂的存在。PEG连结物不倾向于产生实质免疫反应或引起凝固或其它不合需要的作用。具有式-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-(其中n为约3到约4000，通常为约20到约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，分子量为约800Da到约100,000Da的PEG尤其可用作聚合物主链。PEG的分子量可在广泛范围内，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间。PEG的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、謹Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，PEG的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。聚合物主链可为线性或分枝。所属领域一般已知分枝聚合物主链。通常，分枝聚合物具有中央分枝核心部分和与中央分枝核心键联的多个线性聚合物链。PEG通常是以分枝形式使用，所述分枝形式可通过将环氧乙垸与各种多元醇(诸如，甘油、甘油寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)加成来制备。中央分枝部分也可从若干氨基酸(诸如，赖氨酸)衍生。分枝聚(乙二醇)可以通式R(-PEG-OH)m表示，其中R是自核心部分衍生，诸如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇，且m表示臂的数量。多臂PEG分子(诸如，美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596;WO96/21469和WO93/21259中所述的分子，各专利以全文引用的方式并入本文中)也可用作聚合物主链。分枝PEG也可为以PEG(-YCHZ2)n表示的叉状PEG的形式，其中Y为键联基团，且Z为通过指定长度的原子链与CH键联的活性末端基团。另一分枝形式侧接PEG具有沿PEG主链而不是在PEG链末端的反应性基团(诸如羧基)。除这些形式的PEG外，聚合物还可经制备成在主链中具有弱键或可降解键。举例来说，PEG可经制备成在聚合物主链中具有易于水解的酯键。如下文所示，此水解导致聚合物裂解成具有较低分子量的片段-PEG-C02-PEG-+H20—PEG-C02H+HO-PEG-。所属领域技术人员应了解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括所属领域己知的所有形式，包括(但不限于)本文所揭示的形式。许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链在本发明中特别有用。适当聚合物的实例包括(但不限于)其它聚(亚烷二醇)，诸如聚(丙二醇)("PPG")、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇与丙二醇的共聚物)、其四聚物、其混合物等。尽管聚合物主链各链的分子量可变化，但通常在约800Da到约100,000Da、通常约6,000Da到约80,000Da的范围内。聚合物主链各链的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间，包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8，000Da、7,000Da、6000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物主链各链的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。所属领域技术人员将认识到，实质上水溶性主链的上述列表决不详尽且仅为说明性的，并且预期具有上述品质的所有聚合物材料都适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为"多官能的"，意思是聚合物主链具有经官能团官能化或活化的至少两个末端且可能多达约300个末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，各末端与可相同或不同的官能团键结。在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构X_A—POLY—B—N=N=N，其中N-N:N为叠氮基部分；B为键联部分，其可存在或不存在；POLY为水溶性非抗原性聚合物；A为键联部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；且x为第二官能团。A和B的键联部分的实例包括(但不限于)含有至多18个且可含有l-10个碳原子的多官能垸基。烷基链中可包括杂原子，诸如氮、氧或硫。烷基链还可在杂原子处分枝。A和B的键联部分的其它实例包括(但不限于)含有至多10个且可含有5-6个碳原子的多官能芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。适当键联基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号、第5,643,575号和美国专利申请公开案2003/0143596中所述的键联基团，所述专利各自以引用的方式并入本文中。所属领域技术人员将认识到，键联部分的上述列表决不详尽且仅为说明性的，并且预期具有上述品质的所有键联部分都适用于本发明中。用作X的适当官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯和l-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(诸如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸l-苯并三唑酯)、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。如所属领域技术人员所了解，所选X部分应可与叠氮基相容，因此不会发生与叠氮基的反应。含叠氮基的聚合物衍生物可为均双官能性的，意思指第二官能团(即，X)也为叠氮基部分；或杂双官能性的，意思指第二官能团为不同官能团。术语"经保护"是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下反应的保护基或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而变化。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自由叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)组成的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(诸如，丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苯甲基或垸基(诸如，甲基、乙基或叔丁基)。所属领域中已知的其它保护基也可用于本发明中。文献中末端官能团的特定实例包括(但不限于)碳酸N-琥珀酰亚胺酯(例如参看美国专利第5，281，698号、第5,468,478号)、胺(例如参看，Buckmann等人Makromol.Chem.182:1379(1981);Zalipsky等人Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(例如参看，Andresz等人Makromol.Chem.179:301(1978))、丙酸琥珀酰亚胺酯和丁酸琥珀酰亚胺酯(例如参看,Olson等人Poly(ethyleneglycol)Chemistry&BiologicalApplications,第170-181页，Harris&Zalipsky编，ACS,Washington,D.C.,1997;还参看美国专利第5,672,662号)、琥珀酸琥珀酰亚胺酯(例如参看，Abuchowski等人CancerBiochem.Biophys.7:175(1984)和Joppich等人Makromol.Chem.180:1381(1979))、琥珀酰亚胺酯(例如参看，美国专利第4,670,417号)、苯并三唑碳酸酯(例如参看，美国专利第5，650，234号)、缩水甘油基醚(例如参看，Pkha等人Eur.JBiochem.94:11(1979),Elling等人,Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991))、氧基羰基咪唑(例如参看，Beauchamp,等人，Anal.Biochem.131:25(1983);Tondelli等人J.ControlledRelease1:251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参看，Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985);和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech"27:45(1991))、醛(例如参看，Harris等人J.Polym.Sci.Chem.编22:341(1984);美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参看，Goodson等人Biotechnology(NY)8:343(1990);Romani等人ChemistryofPeptidesandProteins2:29(1984))和Kogan,SyntheticComm.22:2417(1992))、原吡啶基二硫化物(例如参看，Woghiren等人Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯醇(例如参看，Sawhney等人，Macromolecules，26:581(1993))、乙烯基砜(例如参看，美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。在本发明某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链X—CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-N=N=N，其中X为如上文所述的官能团；且n为约20到约4000。在另一实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链X—CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-0-(CH2)m-W-N=N=N，其中W为包含l-10个碳原子的脂肪族或芳香族连接基部分；n为约20到约4000;且X为如上文所述的官能团；m介于l与10之间。可通过所属领域已知和/或本文所揭示的多种方法制备本发明的含叠氮基PEG衍生物。在下文所示的一种方法中，平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链第一末端与第一官能团键结且第二末端与适当离去基团键结)与叠氮基阴离子(其可与多种适当平衡离子中的任一种配对，所述离子包括钠、钾、叔丁基铵等)反应。离去基团经历亲核置换且经叠氮基部分置换，提供含所需叠氮基的PEG聚合物。X陽PEG-L+N3-—X-PEG-N3如所示，用于本发明中的适当聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG为聚(乙二醇)且X为不与叠氮基反应的官能团，且L为适当离去基团。适当官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、縮醛、烯基、胺、氨氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶和酮。适当离去基团的实例包括(但不限于)氯离子、'溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙磺酸根和甲苯磺酸根。在制备本发明的含叠氮基聚合物衍生物的另一方法中，使具有叠氮基官能团的键联剂与平均分子量为约800Da到约IOO，OOODa的水溶性聚合物主链接触，其中所述键联剂具有将与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应从而形成含叠氮基聚合物衍生物产物的化学官能团，其中所述叠氮基经键联基团与聚合物主链分隔。例示性反应方案展示于下X-PEG-M+N-连接基-N-N-N—PG-X-PEG-连接基-N:N二N，其中PEG为聚(乙二醇)，且X为封端基团，诸如垸氧基或如上文所述的官能团；且M为不与叠氮基官能团反应但与N官能团有效且选择性地反应的官能团。适当官能团的实例包括(但不限于)如果N为胺，那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨氧基部分，那么M为酮；如果N为亲核基团，那么M为离去基团。可通过已知方法实现粗产物的纯化，所述方法包括(但不限于)沉淀产物随后视需要进行色谱法。更具体实例展示于下文中，在PEG二胺的情况下，其中一个胺经诸如叔丁基-Boc等保护基保护且所得单保护PEG二胺与具有叠氮基官能团的键联部分反应BocHN-PEG-NH2+H02C-(CH2)3-N=N=N在此情况下，可使用多种活化剂(诸如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑)将胺基与羧酸基偶合以在单胺PEG衍生物与具有叠氮基的键联部分之间产生酰胺键。在成功形成酰胺键后，可直接使用所得含N-叔丁基-Boc保护的叠氮基的衍生物修饰生物活性分子或者其可经进一步设计以安装其它有用官能团。举例来说，可通过用强酸处理来水解N-t-Boc基团以产生co-氨基-PEG-叠氮化物。所得胺可用作合成把手(handle)以安装其它有用官能团(诸如马来酰亚胺基、活性二硫化物、活性酯等)以产生有价值的杂双官能试剂。当需要将不同分子与聚合物各末端连接时，杂双官能衍生物也特别有用。举例来说，co-N-氨基-N-叠氮基PEG将允许将具有活性亲电基团的分子(诸如醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等)与PEG的一个末端连接并且将具有乙炔基的分子与PEG的另一末端连接。在本发明另一实施例中，聚合物衍生物具有以下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage147</formula>其中R可为H或垸基、烯烃、垸氧基或芳基或经取代芳基；B为键联部分，其可存在或不存在；POLY为水溶性非抗原性聚合物；A为键联部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；且x为第二官能团。A和B的键联部分的实例包括(但不限于)含有至多18个且可含有l-10个碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括杂原子，诸如氮、氧或硫。垸基链还可在杂原子处分枝。A和B的键联部分的其它实例包括(但不限于)含有至多10个且可含有5-6个碳原子的多官能芳基。芳基可经一个或一个以上碳原子、氮、氧或硫原子取代。适当键联基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号和第5,643,575号以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的键联基团，所述专利各自以引用的方式并入本文中。所属领域技术人员将认识到，键联部分的上述列表决不详尽且仅为说明性的，并且预期具有上述品质的多种键联部分都可用于本发明中。用作X的适当官能团的实例包括羟基、经保护羟基、垸氧基、活性酯(诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯和l-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(诸如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸l-苯并三唑酯)、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和乙炔。如将了解的，所选X部分应可与乙炔基相容，因此不会发生与乙炔基的反应。含乙炔的聚合物衍生物可为均双官能性的，意思指第二官能团(即，X)也为乙炔部分；或杂双官能性的，意思指第二官能团为不同官能团。在本发明的另一实施例中，聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链-X—CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-0-(CH2)m-CECH，其中X为如上文所述的官能团；n为约20到约4000;且m介于1与IO之间。各杂双官能PEG聚合物的特定实例展示于下文中。可使用所属领域技术人员已知和/或本文所揭示的方法制备本发明的含乙炔PEG衍生物。在一种方法中，平均分子量为约800Da到约100,000Da的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链第一末端与第一官能团键结且第二末端与适当亲核基团键结)与具有乙炔官能团和适于与PEG上的亲核基团反应的离去基团的化合物反应。当将具有亲核部分的PEG聚合物与具有离去基团的分子组合时，所述离去基团经历亲核置换且经亲核部分置换，从而提供所需含乙炔的聚合物。X-PEG隱Nu+L-A-C—X-PEG-Nu-A-CeCR'如所示，用于所述反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚(乙二醇)，Nu为亲核部分且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。Nu的实例包括(但不限于)将主要经由SN2型机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯基、酰肼基、氨氧基。Nu基团的其它实例包括主要经由亲核加成反应来反应的官能团。L基团的实例包括氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙磺酸根和甲苯磺酸根，和预期将经历亲核置换的其它基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、a-p不饱和羰基、碳酸酯基和预期将经历亲核试剂加成的其它亲电基团。在本发明另一实施例中，A为具有1-10个碳原子的脂肪族连接基或具有介于6-14个之间的碳原子的经取代芳环。X为不与叠氮基反应的官能团且L为适当的离去基团。在制备本发明的含乙炔聚合物衍生物的另一方法中，使平均分子量为约800Da到约100,000Da、在一末端具有经保护官能团或封端剂且在另一末端具有适当离去基团的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。例示性反应方案展示于下X-PEG-L+-C三CR'—X-PEG-OCR'，其中PEG为聚(乙二醇)，且X为封端基团，诸如烷氧基或如上文所述的官能团；且R'为H、垸基、烷氧基、芳基或芳氧基或者经取代垸基、垸氧基、芳基或芳氧基。在上述实例中，离去基团L应具有足够的反应性以在与足够浓度的乙炔阴离子接触时进行SN2型置换。实现乙炔阴离子对离去基团的SN2置换所需的反应条件已为所属领域技术人员所知。通常可通过所属领域中的已知方法实现粗产物的纯化，所述方法包括(但不限于)沉淀产物随后视需要进行色谱法。可将水溶性聚合物与本发明的多肽键联。水溶性聚合物可经由并入多肽中的非天然编码的氨基酸，或非天然编码或天然编码的氨基酸的任何官能团或取代基，或添加到非天然编码或天然编码的氨基酸中的任何官能团或取代基键联。或者，水溶性聚合物经由天然存在的氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、赖氨酸或N末端残基的胺基)与并入非天然编码的氨基酸的多肽键联。在一些情况下，本发明的多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上非天然氨基酸，其中将一个或一个以上非天然编码的氨基酸与水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或寡糖)键联。在一些情况下，本发明的多肽另外包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上与水溶性聚合物键联的天然编码的氨基酸。在一些情况下，本发明的多肽包含一个或一个以上与水溶性聚合物键联的非天然编码的氨基酸和一个或一个以上与水溶性聚合物键联的天然存在的氨基酸。在一些实施例中，本发明中所使用的水溶性聚合物相对于未连结形式增加多肽的血清半衰期。可调节与本发明的多肽键联的水溶性聚合物的数量(即，聚乙二醇化或糖基化的程度)从而提供改变(包括(但不限于)增加或降低)的药理学、药物动力学或药效学特征，诸如活体内半衰期。含有强亲核基团(即，酰胼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物在本发明的一个实施例中，利用含有直接与PEG主链键联的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基非天然编码的氨基酸的多肽。在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-0-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在一些实施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-X-NH-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000，并且X视情况为可存在或不存在的羰基(C=0)。在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2,其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000。在本发明另一实施例中，利用含有借助酰胺键与PEG主链键联的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的多肽。在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-0-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在一些实施例中，含肼或酰肼的PEG衍生物具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-X-NH-NH2,其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10,n为100-1,000，并且X视情况为可存在或不存在的羰基(OO)。在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为IOO-I，OOO。在本发明另一实施例中，利用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分枝PEG衍生物修饰包含含羰基氨基酸的多肽，其中所述分枝PEG各链的MW在10-40kDa的范围内且可为5-20kDa。在本发明另一实施例中，利用具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码的氨基酸的多肽。举例来说，在一些实施例中，肼或酰肼末端PEG衍生物将具有以下结构2CH(CH2)m-X-NH-NH2，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000，并且X视情况为可存在或不存在的羰基(C=0)。在一些实施例中，含有氨基脲基的PEG衍生物将具有以下结构[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-C(0)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(0)-NH-NH2，其中R为简单垸基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、0、S、C(O)或不存在，m为2-10且n为IOO-I，OOO。在一些实施例中，含有羟胺基的PEG衍生物将具有以下结构2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000，并且在各情况下X视情况为可存在或不存在的O、N、S或羰基(C=0)。含炔PEG衍生物在本发明另一实施例中，用含有将与存在于非天然编码的氨基酸侧链上的叠氮基部分反应的炔部分的PEG衍生物修饰多肽。在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-OCH，其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。在本发明另一实施例中，利用含有借助酰胺键与PEG主链键联的末端叠氮基或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔非天然编码的氨基酸的多肽。在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-NH-C(OHCH2)p-OCH,其中R为简单垸基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000。在本发明另一实施例中，利用含有末端炔部分的分枝PEG衍生物修饰包含含叠氮基氨基酸的多肽，其中所述分枝PEG各链的MW在10-40kDa的范围内且可为5-20kDa。举例来说，在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构[RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC三CH,其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10且n为100-1,000，并且X视情况为O、N、S或羰基(C=0)或不存在。含膦PEG衍生物在本发明另一实施例中，用含有活性官能团(包括(但不限于)酯、碳酸酯)且另外包含将与存在于非天然编码的氨基酸侧链上的叠氮基部分反应的芳基膦基的PEG衍生物修饰多肽。一般来说，PEG衍生物将具有在1-100kDa范围内且在一些实施例中在10-40kDa范围内的平均分子量。在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构Ph2P(H2C)n"丫X、W<formula>formulaseeoriginaldocumentpage155</formula>其中n为l-10;X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物，且R可为H、垸基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR'、-NR'R"、-SR'、-卣素、-C(O)R'、-CONR'R"、-S(0)2R'、-S(0)2NR'R"、-CN和-N02。R'、R"、R"'和R""各自独立地指氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)经l-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫垸氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，各R基团是如当存在一个以上这些基团时各R'、R"、R'"和R""基团一样独立地选择。当R'与R"连接到同一氮原子时，其可与氮原子组合形成5、6或7元环。举例来说，-NR'R"意欲包括(但不限于)l-吡咯烷基和4-吗啉基。根据上述有关取代基的论述，所属领域技术人员将了解，术语"垸基"意欲包括包含与除氢基外的基团结合的碳原子的基团，诸如卤垸基(包括(但不限于)-CF"n-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(0)CH3、-C(0)CF3、-C(0)CH2OCH^)。其它PEG衍生物和通用聚乙二醇化技术可与GH(例如hGH)多肽键联的其它例示性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括以下专利中所述者:例如美国专利公开案第2004/0001838号、第2002鳩52009号、第2003/0162949号、第2004/0013637号、第2003/0228274号、第2003/0220447号、第2003/0158333号、第2003/0143596号、第2003/0114647号、第2003/0105275号、第2003/0105224号、第2003/0023023号、第2002/0156047号、第2002/0099133号、第2002鳩86939号、第2002/0082345号、第2002/0072573号、第2002細52430号、第2002/0040076号、第2002/0037949号、第2002/0002250号、第2001鳩56171号、第2001/0044526号、第2001/0021763号；美国专利第6,646,110号、,第5,824,778号、第5,476,653号、第5,219,564号、第5,629,384号、第5,736,625号、,第4,902,502号、第5,281,698号、第5,122,614号、第5,473,034号、第5,516,673号、,第5,382,657号、第6,552,167号、第6,610,281号、第6,515,100号、第6，461，603号,>第6,436,386号、第6,214,966号、第5,990,237号、第5,900,461号、第5,739,208号,,第5,672,662号、第5,446,090号、第5,808,096号、第5,612,460号、第5,324,844号',第5,252,714号、第6,420,339号、第6,201,072号、第6,451,346号、第6,306,821号',第5,559,213号、第5，747，646号、第5,834,594号、第5,849,860号、第5,980,948号->第6,004,573号、第6,129,912号；WO97/32607、EP229,108、EP402,378、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、WO98/32466、WO95/06058、EP439508、WO97/03106、WO96/21469、W095/13312、EP921131、WO98/05363、EP809996、WO96/41813、WO96/07670、EP605963、EP510356、EP400472、EP183503和EP154316,所述专利都以引用的方式并入本文中。本文所述的任何PEG分子都可以任何形式使用，包括(但不限于)单链、支链、多臂链、单官能、双官能、多官能或其任何组合。增强对血清白蛋白的亲和力还可将各种分子与本发明的多肽融合以调节血清中多肽的半衰期。在一些实施例中，将分子与本发明的多肽键联或融合以增强对动物体内的内源血清白蛋白的亲和力。举例来说，在一些情况下，制备多肽与白蛋白结合序列的重组融合体。例示性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(例如参看Makrides等人,《/尸/k3rwaco/.2Tzer277:534-542(1996)禾口Sjolander等人,《/7m/ww"o/.A/ieAocfe201:115-123(1997))或白蛋白结合肽，诸如Dennis等人，/历o/.C/zem.277:35035-35043(2002)中所述的肽。在其它实施例中，本发明的多肽经脂肪酸酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。例如参看Kurtzhals等人，5/oc/e附.《/312:725-731(1995)。在其它实施例中，将本发明的多肽与血清白蛋白(包括(但不限于)人血清白蛋白)直接融合。所属领域技术人员将认识到，还可在本发明中将多种其它分子键联以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。X.多肽的糖基化本发明包括并有一个或一个以上具有糖残基的非天然编码的氨基酸的多肽。糖残基可为天然(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然(包括(但不限于)3-氟半乳糖)的。可通过N或O键联配糖键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)肟或相应的C或S键联糖苷)将糖与非天然编码的氨基酸键联。可将糖(包括(但不限于)糖基)部分在活体内或活体外添加到多肽中。在本发明的一些实施例中，用经氨氧基衍生化的糖修饰包含含羰基非天然编码的氨基酸的多肽以产生经由肟键键联的相应糖基化多肽。与非天然编码的氨基酸连接后，可通过用糖基转移酶和其它酶处理来进一步设计糖以产生与多肽结合的寡糖。例如参看H.Liu等人，,C&肌Soc.125:1702-1703(2003)。在本发明的一些实施例中，利用制备为氨氧基衍生物的具有指定结构的聚糖直接修饰包含含羰基非天然编码的氨基酸的多肽。所属领域技术人员将认识到，可使用其它官能团(包括叠氮基、炔、酰肼、肼和氨基脲)将糖与非天然编码的氨基酸键联。在本发明一些实施例中，随后可通过(包括(但不限于))分别与(包括(但不限于))炔基或叠氮基衍生物的Huisgen[3+2]环加成反应来修饰包含含叠氮基或炔基非天然编码的氨基酸的多肽。本发明允许以极高选择性修饰蛋白质。XI.多肽二聚体和多聚体本发明还提供多肽组合(包括(但不限于)GH超基因家族成员GH，例如hGH和hGH类似物)，诸如均二聚体、杂二聚体、均多聚体或杂多聚体(即，三聚体、四聚体等)，其中含有一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽直接与另一多肽或其变体的多肽主链结合或经由连接基结合。由于与单体相比，多肽二聚体或多聚体连结物的分子量有所增加，故其可展现新颖或所需的特性，包括(但不限于)相对于单体多肽不同的药理学、药物动力学、药效学；经调节的治疗半衰期；或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本发明多肽二聚体将调节多肽受体的二聚化。在其它实施例中，本发明的多肽二聚体或多聚体将充当多肽受体拮抗剂、激动剂或调节剂。在一些实施例中，含有二聚体或多聚体的GH(例如hGH)中存在的一个或一个以上GH(例如hGH)分子包含与存在于位点II结合区内的水溶性聚合物键联的非天然编码的氨基酸。因此，二聚体或多聚体的各个GH(例如hGH)分子可用于经由位点I界面结合GH(例如hGH)多肽受体，但不能经由位点II界面结合第二GH(例如hGH)多肽受体。因此，GH(例如hGH)多肽二聚体或多聚体可啮合两个不同GH(例如hGH)多肽受体中每一者的位点I结合位点，但由于GH(例如hGH)分子具有与位点II区域中存在的非基因编码的氨基酸连接的水溶性聚合物，故GH(例如hGH)多肽受体无法啮合GH(例如hGH)多肽配体的位点II区域并且二聚体或多聚体充当GH(例如hGH)多肽拮抗剂。在一些实施例中，含有二聚体或多聚体的GH(例如hGH)多肽中存在的一个或一个以上GH(例如hGH)分子包含与存在于位点I结合区内的水溶性聚合物键联从而允许与位点II区域结合的非天然编码的氨基酸。或者，在一些实施例中，含有二聚体或多聚体的GH(例如hGH)多肽中存在的一个或一个以上GH(例如hGH)分子包含与不在位点I或位点II结合区内的位点处存在的水溶性聚合物键联从而使二者均可结合的非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，使用位点I、位点II或两者均可供结合的GH(例如hGH)分子的组合。至少一个具有可供结合的位点I且至少一个具有可供结合的位点II的GH(例如hGH)分子的组合可提供具有所需活性或特性的分子。此外，位点I和位点II均可供结合的GH(例如hGH)分子的组合可产生超级激动剂GH(例如hGH)分子。在一些实施例中，多肽是直接键联，包括(但不限于)经由Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键键联。在一些实施例中，键联多肽将包含不同的非天然编码的氨基酸以便利二聚化，包括(但不限于)第一多肽的一个非天然编码的氨基酸中的炔与第二多肽的第二非天然编码的氨基酸的叠氮基将经由Huisgen[3+2]环加成连结。或者，可将包含含酮非天然编码的氨基酸的第一多肽与包含含羟胺非天然编码的氨基酸的第二多肽连结且所述多肽经由形成相应肟反应。或者，两个多肽经由连接基键联。可使用任何杂双官能或均双官能连接基来键联可具有相同或不同一级序列的多肽。在一些情况下，用于将多肽连在一起的连接基可为双官能PEG试剂。连接基可具有多种分子量或分子长度。可使用较大或较小分子量连接基来提供多肽之间或者一种多肽与其受体或结合搭配物之间或键联实体与多肽受体或结合搭配物之间所需的空间关系或构象。具有较长或较短分子长度的连接基也可用于提供多肽之间或多肽与其受体之间或键联实体与多肽之间所需的间隔或可弯曲性。类似地，可利用具有特定形状或构象的连接基以在多肽达到其靶之前或之后对多肽或键联实体赋予特定形状或构象。多肽与键联实体之间的空间关系的这种最优化可对所述分子提供新颖、经调节或所需特性。在一些实施例中，本发明提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接基，其包括a)聚合物主链至少第一末端上含叠氮基、炔、肼、酰肼、羟胺或羰基的部分；和b)聚合物主链第二末端上的至少第二官能团。第二官能团可与第一官能团相同或不同。在一些实施例中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施例中，本发明提供包含分枝分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，分枝分子结构可为树突状。在一些实施例中，本发明提供包含一个或一个以上多肽的多聚体，其是由与水溶性活性聚合物的反应而形成，其具有以下结构R-(CH2CH20)n-0-(CH2)m-X，其中n为约5到3,000，m为2-10，X可为含叠氮基、炔、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或羰基的部分，且R为可与X相同或不同的封端基、官能团或离去基团。R例如可为选自由以下各基团组成的群组的官能团羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-苯并三唑酯、碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳酸l-苯并三唑酯、縮醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘代乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃和酮。XII.多肽的抗体形成的测量和关于免疫原性的临床前试验用于测量和评定抗体形成的检定包括(但不限于)生物检定和结合检定。生物检定包括(但不限于)使用来自动物个体或患者的血清以检测中和抗体的检定。测量血清中和外源分子的生物活性的能力。举例来说，基于细胞的生物检定可测量增殖、细胞毒性、信号转导或细胞因子释放。检测中和及非中和抗体的结合检定测量血清结合外源蛋白质的能力。测量所述抗体的方法包括(但不限于)ELISA。这两种抗体存在的重要性已于Schellekens,H等人ClinicalTherapeutics2002;24(11):1720-1740中论述,所述文献以引用的方式并入本文中。Schellekens,H等人ClinicalTherapeutics2002;24(11):1720-1740(其以全文引用的方式并入本文中)还论述在表达内源人类蛋白的非人类灵长类动物和转基因小鼠模型中的动物试验以及活体外试验方法。Whiteley等人J.Clin.Invest.1989;84:1550-1554(其以引用的方式并入本文中)论述将转基因小鼠用于利用人类胰岛素的免疫原性研究。Wadhwa，M.等人JofImmunolMethods2003;278:1-17(其以引用的方式并入本文中)论述检测和测量免疫原性的多种技术，诸如表面等离子共振(SPR;Biacore)、放射免疫沉淀检定(RIPA)、免疫检定(诸如固相结合免疫检定)、桥联和竞争性ELISA和免疫印迹。其它技术包括(但不限于)电化学发光(ECL)。Chirino等人DDT2004;9(2):82-90(其以引用的方式并入本文中)描述研究蛋白质治疗剂的免疫原性的离体T细胞活化检定。检定本发明多肽的其它方法已为所属领域技术人员所知。XII.多肽活性和多肽对多肽受体的亲和力的测量可如McFarland等人，Sc/e"ce,245:494-499(1989)和Leung,D.等人，iVa/w",330:537-543(1987)所述制备hGH受体。可使用标准或已知的活体外或活体内检定测定hGH多肽活性。举例来说，可使用在存在hGH的情况下增殖的细胞系(例如，表达hGH受体或泌乳素受体的细胞系)以监测hGH受体结合。例如参看Clark,R.等人，祝o/.C/zem.271(36):21969(1996);Wada等人，Mo/.五油c由/.12:146-156(1998);Gout,P.W.等人Ca"cerie;y.40,2433-2436(1980);WO99/03887。对于包含非天然氨基酸的未聚乙二醇化或聚乙二醇化的hGH多肽来说，可使用BIAcoreTM生物传感器(Pharmacia)测量激素对其受体的亲和力。例如参看美国专利第5,849,535号；Spencer,S.A.等人，J.5/o/Oze7.,263:7862-7867(1988)。测试hGH活性的活体内动物模型包括例如Clark等人，《/.5/o/.C/zem.271(36):21969-21977(1996)中所述的模型。关于包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的hGH多肽的二聚化能力的检定可如Cunningham,B.等人，5Wewce,254:821-825(1991)和Fun,G.等人，Sc/e"ce，256:1677-1680(1992)中所述进行。为评定经修饰hGH多肽的生物活性，可使用测量hGH与其受体相互作用的下游标记的检定。hGH与其内源产生的受体的相互作用引起人类IM-9淋巴细胞细胞系中转录家族成员STAT5的信号转导子和活化子的酪氨酸磷酸化。STAT5的两种形式STAT5A和STAT5B是从IM-9cDNA文库中鉴别。例如参看Silva等人，Mol.Endocrinol.(1996)10(5):508-518。所有所引用的参考文献和专利都以引用的方式并入本文中。美国专利公开案第US2005/0170404号(其以全文引用的方式并入本文中)描述表征hGH多肽的其它检定。表征多肽与其受体或结合搭配物的检定已为所属领域技术人员所知。有关检定方法的参考文献的编辑并不详尽，且所属领域技术人员将认识到可用于测试所需最终结果的其它检定。XIII.功效、功能性活体内半衰期和药物动力学参数的测量本发明的一个重要方面是通过在存在或不存在多肽与水溶性聚合物部分的连结的情况下构建多肽获得的延长的生物半衰期。多肽血清浓度的迅速降低使得评估对使用连结和未连结的多肽和其变体的治疗的生物反应变得重要。本发明的连结和未连结的多肽和其变体还在皮下或静脉内投药后具有延长的血清半衰期，使得可能通过例如ELISA方法或初级筛选检定测量。可使用来自BioSourceInternational(Camarillo,CA)或DiagnosticSystemsLaboratories(Webster,TX)的ELISA或RIA试剂盒。活体内生物半衰期的测量是如本文所述进行。可根据Clark，R.等人，/C&w.271(36):21969-21977(1996)中所述的方案测定包含非天然编码的氨基酸的多肽(诸如hGH多肽)的功效和功能性活体内半衰期。可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每治疗组N=5只动物)中评估包含非天然编码的氨基酸的多肽(诸如hGH多肽)的药物动力学参数。举例来说，使动物经动脉内接收25微克/大鼠的单一剂量或经皮下接收50微克/大鼠的单一剂量，且根据预定时程取得约5-7个血样，所述时程通常对于未连结水溶性聚合物的包含非天然编码的氨基酸的GH(例如hGH)多肽为约6小时，且对于包含非天然编码的氨基酸且与水溶性聚合物连结的GH(例如hGH)多肽为约4天。已在多种物种中充分研究GH(例如hGH)多肽的药物动力学数据并且可将其与对于包含非天然编码的氨基酸的GH(例如hGH)多肽所获得的数据直接比较。关于涉及GH(例如hGH)的研究参看MordentiJ.等人，户/Kw附.及"8(11):1351-59(1991)。还可在灵长类动物(例如，恒河猴(cynomolgusmonkey))中评估药物动力学参数。通常，经皮下或经静脉内投与单次注射，且随时间监测血清多肽含量。可通过所属领域中已知的各种检定测定根据本发明的多肽的比活性。可通过本文所述或提及或者所属领域技术人员已知的方法测试根据本发明所获得和纯化的多肽突变蛋白或其片段的生物活性。XIV.投药和医药组合物视情况将本发明的多肽或蛋白质(包括(但不限于)GH(例如hGH)、合成酶、包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质等)(包括(但不限于))与适当的医药载剂组合用于治疗用途。所述组合物例如包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。调配物经制备成与投药模式相适应。一般来说，所属领域技术人员已知投与蛋白质的方法并且其可应用于投与本发明的多肽。在一些实施例中，本发明提供一种医药组合物，其含有通过共价键与至少一个水溶性聚合物键联的多肽(其中所述共价键为肟键)和医药学上可接受的赋形剂。多肽可为hGH。在一些实施例中，多肽包括非天然编码的氨基酸，诸如含羰基的非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸为含酮氨基酸，例如对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施例中，GH(例如hGH)含有在GH(例如hGH)中与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2中的氨基酸35对应的位置处取代的非天然编码的氨基酸，例如对乙酰基苯丙氨酸。水溶性聚合物可为PEG。适当PEG包括线性和分枝PEG;可使用本文所述的任何PEG。在某些实施例中，PEG为约0.1-100kDa或约1-100kDa或约10-50kDa或约20-40kDa或为约30kDa的线性PEG。在一些实施例中，医药组合物含有GH，例如通过肟键与30kDaPEG键联的GH(例如hGH)，其中所述肟键在GH中位于与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2中氨基酸35对应的位置处的对乙酰基苯丙氨酸与PEG之间。根据所属领域技术人员已知的方法，视情况在一种或一种以上适当的活体外和/或活体内动物疾病模型中测试包含一种或一种以上本发明多肽的治疗组合物以证实功效、组织代谢且估算剂量。具体来说，最初可通过本文中非天然氨基酸与天然氨基酸同源物的活性、稳定性或其它适当量度(包括(但不限于)比较经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的多肽与天然氨基酸多肽)(即在相关检定中)来确定剂量。投药可通过通常用于将分子引入以使其与血液或组织细胞紧密接触的任何途径进行。本发明的非天然氨基酸多肽是以任何适当的方式视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起投与。对患者投与本发明的所述多肽的适当方法都可用，且尽管可使用一种以上途径投与特定组合物，但特定途径通常能够提供比另一途径更快捷且更有效的作用或反应。医药学上可接受的载剂是通过所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法部分决定。因此，存在多种本发明医药组合物的适当调配物。可通过任何适用于蛋白质或肽的常规途径来投与本发明的多肽(包括(但不限于)聚乙二醇化hGH)，所述途径包括(但不限于)不经肠途径，例如包括(但不限于)皮下或静脉内注射或者任何其它注射或输注形式。多肽组合物可通过多种途径投与，包括(但不限于)口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、透皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。还可经由脂质体投与包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物。所属领域技术人员通常已知所述投药途径和适当的调配物。包含非天然编码的氨基酸的多肽(包括(但不限于)聚乙二醇化hGH)可单独使用或与其它适当组分(诸如医药载剂)组合使用。单独或与其它适当组分组合的包含非天然氨基酸的多肽也可制成气雾剂调配物(即，其可"成雾状")以经由吸入投与。可将气雾剂调配物放入加压可接受推进剂中，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。适于不经肠投药(诸如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径)的调配物包括水性和非水性等张无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预定受体的血液等张的溶质，以及可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。可于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中提供多肽调配物。不经肠投药和静脉内投药是优选的投药方法。具体来说，己经用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径(包括(但不限于)通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它医药学上传递蛋白质的途径)以及当前使用的调配物提供本发明多肽的优选投药途径和调配物。在本发明的上下文中，投与患者的剂量足以在患者体内随时间引起有益的治疗反应或视应用而引起其它适当的活性。通过特定载体或调配物的功效、所使用的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状以及欲治疗患者的体重或表面积来确定剂量。剂量大小也通过在特定患者体内伴随特定载体、调配物等的投药的任何不利副作用的存在、性质和程度等来确定。在确定治疗或预防疾病(包括(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)的过程中欲投与的载体或调配物的有效量时，医师评估循环血浆含量、调配物毒性、疾病进展和/或(相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的制备。例如投与70公斤患者的剂量通常在等于当前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内，所述范围可针对相关组合物的活性或血清半衰期的改变而调整。本发明的载体或医药调配物可通过任何已知的常规疗法来补充治疗条件，包括抗体投与、疫苗投与、投与细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等。对于投药，本发明的调配物是以由相关调配物的LD-50或ED-50确定的速率投与，和/或包括(但不限于)当应用于患者的质量和总体健康状况时，观察各种浓度的非天然氨基酸多肽的任何副作用。投药可以单次剂量或分剂量实现。如果经历调配物输注的患者出现发烧、寒战或肌肉疼痛，那么其接收适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)或其它疼痛/发烧控制药物。在将进行输注之前30分钟，对经历输注反应(诸如发烧、肌肉疼痛和寒战)的患者预先给予阿司匹林、对乙酰氨基酚或(包括(但不限于))苯海拉明(diphenhydramine)。将哌替啶(meperidine)用于不能对解热剂和抗组织胺快速反应的更为严重的寒战和肌肉疼痛。视反应的严重程度减缓或中断细胞输注。本发明的多肽可直接投与哺乳动物个体。投药可通过通常用于将多肽引入个体的任何途径进行。根据本发明实施例的多肽组合物包括适于经口、经直肠、局部、吸入(包括(但不限于)经由气雾剂)、口腔(包括(但不限于)舌下)、经阴道、不经肠(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、大脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤与粘膜表面，包括气道表面)和透皮投药的多肽组合物，但在任何指定情况下最适合的途径将视所治疗病状的性质和严重程度而定。投药可为局部的或全身的。可于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中提供化合物调配物。本发明的多肽可与医药学上可接受的载剂制备成单位剂量可注射形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)的混合物。本发明的多肽还可通过连续输注(包括(但不限于)使用微型泵，诸如渗透泵)、单次团注或缓释储槽式调配物投与。适于投药的调配物包括水性和非水性溶液、等张无菌溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。溶液和悬浮液可由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。冷冻干燥是用于将水从所关注蛋白质制剂中去除的现存蛋白质的常用技术。冷冻干燥或冻干是首先将欲干燥的材料冷冻且随后通过在真空环境中升华去除冰或冷冻溶剂的过程。预先冻干的调配物中可包括赋形剂以在冷冻干燥过程中增强稳定性和/或改进储存时冻干产物的稳定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。所属领域技术人员也已知药物的喷雾干燥。举例来说，参看DrugDev.Ind.Pharm，18(11&12),1169-1206(1992)中的Broadhead，J.等人，"TheSprayDryingofPharmaceuticals"。除小分子药物外，也已将多种生物材料喷雾干燥并且这些材料包括酶、血清、血浆、微生物和酵母。由于喷雾干燥可将液态医药制剂以单步骤工艺转化成无粉尘或团聚细粉，所以喷雾干燥为有用技术。基本技术包含以下四个步骤a)使进料溶液雾化成喷雾；b)喷雾-空气接触；c)干燥喷雾；和d)使干燥产物与干燥空气分离。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号(其以引用的方式并入本文中)中描述通过喷雾干燥制备重组促红细胞生成素。本发明的医药组合物可包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂是通过所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法部分决定。因此，存在多种本发明多肽的医药组合物(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的适当调配物(例如参看ie脂'"gto"^P/zarw"ceM〃cfl/Scz'e"(^y,第17版1985))。适当载剂包括(但不限于)缓冲液，其含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸或组氨酸衍生物、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括(但不限于)抗坏血酸；低分子量多肽，包括(但不限于)小于约10个残基的多肽；蛋白质，包括(但不限于)血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括(但不限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷氨酸盐或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包括(但不限于)EDTA和依地酸钠(edentatesodium);二价金属离子，包括(但不限于)锌、钴或铜；糖醇，包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成盐平衡离子，包括(但不限于)钠和氯化钠；和/或非离子表面活性剂，包括(但不限于)TweenTM(包括(但不限于)Tween80(聚山梨醇酯80)和Tween20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM和其它普流尼克酸(pluronicacid)(包括(但不限于)普流尼克酸F68(泊洛沙姆188(poloxamer188))或PEG。适当的表面活性剂例如包括(但不限于)基于聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙垸)(即，(PEO-PPO-PEO))或聚(环氧丙垸)-聚(环氧乙垸)-聚(环氧丙垸)(即，(PPO-PEO-PPO))或其组合的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO在市面上以商品名Pluronics、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASFWyandotteCorp.,Wyandotte,Mich.)销售并且进一步描述于美国专利第4,820,352号中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可为适当的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于使多肽对一种或一种以上应力(包括(但不限于)由搅动产生的应力)稳定。上述一些物质可称为"增积剂(bulkingagent)"。一些也可称为"张力改变剂(tonicitymodifier)"。针对产物稳定性和抗菌功效还可应用抗菌防腐剂；适当防腐剂包括(但不限于)苯甲醇、苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯、甲酚和酚或其组合。本发明的多肽(包括与诸如PEG等水溶性聚合物键联的多肽)还可以通过持续释放系统投与或作为持续释放系统的部分投与。持续释放组合物包括(包括但不限于)成形物件形式的半透性聚合物基质，包括(但不限于)薄膜或微囊。持续释放基质包括生物可相容材料，诸如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人，《/WomedMa加ie&,15:267-277(1981);Langer,C/ze附.rec/.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利第3，773，919号；EP58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯共聚乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与"乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，所o/w/少me22，547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯垸酮和硅酮。持续释放组合物还包括脂质体包埋的化合物。可通过本身已知的方法制备含有所述化合物的脂质体DE3,218,121;Eppstein等人，iVoc.Ato/.爿caof.Sc/.C/.S.A,82:3688-3692(1985);Hwang等人，Ato/.爿cadC/H，77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;美国专利第4,619,794号；EP143,949;美国专利第5,021,234号；日本专利申请案83-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP102,324。所有所引用的参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。可通过例如以下文献中所述的方法制备经脂质体包埋的多肽DE3,218,121;Eppstein等人，尸rac.iVa".爿cadC/H，82:3688-3692(1985);Hwang等人，户wc.iVa".77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;美国专利第4,619,794号；EP143,949;美国专利第5,021,234号；日本专利申请案83-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP102,324。脂质体的组成和尺寸已为人们所熟知或者能够易于凭所属领域技术人员的经验确定。脂质体的一些实例描述于例如ParkJW等人，Proc.淑/.JcfldScz'.园92:1327-1331(1995);LasicD和PapahadjopoulosD(编):MedicalApplicationsOFLiposomes(1998);DrummondDC等人，Liposomaldrugdeliverysystemsforcancertherapy,TeicherB(编)CancerDrugDiscoveryandDevelopment(2002);ParkJW等人，C//".Omc"8:1172-1181(2002);NielsenUB等人，祝oc編.5/—1591(1-3):109-118(2002);MamotC等人，Ca"ceri仏63:3154-3161(2003)中。所有所引用的参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。在本发明的上下文中，投与患者的剂量应随时间足以在个体体内引起有益的反应。一般来说，每剂不经肠投与的本发明多肽的总医药有效量在每天每公斤患者体重约0.01微克到每公斤患者体重约100微克，或者每天每公斤体重约0.05毫克到每公斤患者体重约l毫克的范围内，但这是以治疗判断为依据。给药频率也是以治疗判断为依据，并且可以比批准用于人类的市售多肽产品频率更高或更低。通常，可通过上文所述的投药途径中的任一种投与本发明的聚乙二醇化多肽。在一些实施例中，本发明提供一种组合物，其包含医药组合物形式的本文所述的任何多肽，其对本文所述的储存和给药方案足够稳定。所属领域中已知测试稳定性的方法。XV.本发明GH(例如hGH)多肽的治疗用途本发明的GH(例如hGH)多肽可用于治疗多种病症。本发明的GH(例如hGH)激动剂多肽可例如用于治疗生长缺陷、免疫障碍并刺激心脏功能。患有生长缺陷的个体例如包括患有特纳氏综合症(Turner'sSyndrome)的个体、GH缺乏的个体(包括儿童)、在生长板闭合前正常生长曲线减慢或延迟约2-3年的儿童(有对称为"矮小儿童")和类胰岛素生长因子-I(IGF-I)对GH的反应已经化学方式(即，通过糖皮质激素治疗)或自然条件阻断的个体，诸如IGF-I对GH的反应自然减少的成人患者。本发明的hGH多肽可用于治疗患有以下病状的个体儿童生长激素缺乏、特发性身材矮小、儿童期开始的成人生长激素缺乏、成人期开始的成人生长激素缺乏或继发性生长激素缺乏。在成人期经诊断为生长激素缺乏的成人可能已患有垂体肿瘤或接受辐射。包括(但不限于)代谢综合症、头部损伤、肥胖、骨质疏松症或抑郁的病状可在成人中引起类生长激素缺乏症状。激动剂GH(例如hGH)变体可通过增加其免疫功能来刺激哺乳动物免疫系统，而不管所述增加是由抗体介导还是细胞介导所引起，且不管免疫系统对于用GH(例如hGH)多肽治疗的宿主为内源性的还是从对宿主受体给予GH(例如hGH)多肽的供体移植的(如在骨髓移植物中)。"免疫障碍"包括个体免疫系统对抗原具有较正常个体降低的抗体或细胞反应的任何病状，包括因药物(例如化疗)治疗而具有降低的免疫性的较小脾脏的个体。患有免疫障碍的个体的实例例如包括老年患者、经历化疗或放射疗法的个体、由大病恢复或即将经历手术的个体、患有AIDS的个体、患有先天性和获得性B细胞缺乏(诸如低丙种球蛋白血症、通常变化的无丙种球蛋白血症(commonvariedagammaglobulinemia)和选择性免疫球蛋白缺陷(例如IgA缺陷))的患者、感染病毒(诸如培养时间比患者的免疫反应短的狂犬病)的患者和患有遗传病症(诸如迪乔治综合症(diGeorgesyndrome))的个体。本发明的GH(例如hGH)拮抗剂多肽可用于治疗巨人症和肢端肥大症、糖尿病和由糖尿病引起的并发症(糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病)、血管性眼病(例如，涉及增殖性新血管形成)、肾病和GH反应性恶性疾病。血管性眼病包括例如视网膜病(例如由早熟或镰刀形红细胞贫血症引起)和黄斑变性。GH反应性恶性疾病例如包括维尔姆斯肿瘤(Wilm'stumor)、肉瘤(例如骨肉瘤)、乳癌、结肠癌、前列腺癌和甲状腺癌，和表达GH受体mRNA的组织(即，胎盘、胸腺、脑、唾液腺、前列腺、骨髓、骨胳肌、气管、脊髓、视网膜、淋巴结和由伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、结肠直肠癌、肺癌、淋巴母细胞白血病和黑素瘤引起)的癌症。本发明的GH(例如hGH)激动剂多肽例如可用于治疗慢性肾衰竭、与慢性肾功能不全(CRI)相关的生长衰竭、与特纳氏综合症相关的身材矮小、儿科普拉德一威利综合症(Prader-WilliSyndrome,PWS)、患有消瘦或恶病质的HIV患者、小于胎龄(SGA)儿出生、肥胖和骨质疏松症。GH(例如hGH)的平均量可变化且尤其应建立在执业医师的推荐和处方的基础之上。GH(例如hGH)的确切量是个见仁见智的问题，其是以诸如所治疗病状的确切类型、所治疗患者的情况以及组合物中的其它成分等因素为依据。本发明还提供投与治疗有效量的另一活性剂。所属领域技术人员根据使用hGH的疗法可容易地确定欲给予的_&里o本发明的医药组合物可以常规方式制造。在一些实施例中，本发明提供一种治疗方法，其包括对需要治疗的个体投与有效量的激素组合物，所述组合物包含通过共价键与至少一个水溶性聚合物键联的生长激素(GH)，其中所述共价键为肟键。在一些实施例中，所述方法包括对个体(例如人类)投与GH(例如hGH)。在一些实施例中，GH(例如hGH)包括非天然编码的氨基酸，诸如含羰基非天然编码的氨基酸。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸为含酮氨基酸，例如对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施例中，GH(例如hGH)含有在GH(例如hGH)中与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2中的氨基酸35对应的位置处取代的非天然编码的氨基酸，例如对乙酰基苯丙氨酸。水溶性聚合物可为PEG。适当PEG包括线性和分枝PEG;可使用本文所述的任何PEG。在某些实施例中，PEG为约0.1-100kDa或约1-100kDa或约10-50kDa或约20-40kDa或为约30kDa的线性PEG。在一些实施例中，医药组合物含有GH，例如通过肟键与30kDaPEG键联的GH(例如hGH)，其中所述肟键在GH中位于与美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2中氨基酸35对应的位置处的对乙酰基苯丙氨酸与PEG之间。在一些实施例中，所治疗的个体罹患儿童生长激素缺乏、特发性身材矮小、儿童期开始的成人生长激素缺乏、成人期开始的成人生长激素缺乏或继发性生长激素缺乏。如本文所述且如所属领域中已知，可以任何适当形式、途径、剂量、频率和持续时间对个体投与GH(例如hGH)。在一些实施例中，本发明提供一种治疗方法，其包括对需要治疗的个体投与有效量的激素组合物，所述组合物包含通过共价键与至少一个水溶性聚合物键联的生长激素(GH),其中所述水溶性聚合物为线性聚合物，且其中所述激素组合物是以不超过约每隔一天1次；每3、4、5或6天1次；每周1次；每8、9、10、11、12或13天1次；每两周1次；每15、16、17、18、19或20天1次；每三周1次；每22、23、24、25、26、27、28、29或30天1次；每月1次；或小于约每月1次的频率给予。应了解，投药频率可由个体或更通常专业治疗人员自行改变，或可使用任何频率组合。在一些实施例中，每周不到约1次、每两周1次、每三周1次或每月1次投与GH组合^^。在一些实施例中，每周不到约1次、每两周1次或每月1次投与GH组合物。在一些实施例中，每周不到约1次投与GH组合物。在一些实施例中，每两周不到约1次投与GH组合物。在一些实施例中，每月不到约1次投与GH组合物。本发明还提供投与治疗有效量的另一活性剂以及本发明的hGH。所属领域技术人员根据使用hGH的疗法可容易地确定欲给予的量。实例提供以下实例以说明但不限制所主张的本发明。实例1使用表达hGH的转基因小鼠来研究具有非天然氨基酸取代的甲硫氨酰基hGH多肽和在非天然氨基酸取代处经聚乙二醇化的甲硫氨酰基hGH多肽的免疫原性。Sweetser,D.A.等人于PNAS1988;85:9611-9615和Genes&Development1988;2:1318-1332中描述经由融合部分脂肪酸结合蛋白基因与hGH基因的构筑体表达hGH的转基因小鼠。两个hGH转基因小鼠杂合体繁殖对是购自TheJacksonLaboratory。使用扩增hGH转基因各个区域的引物组A、C和F以确定hGH转基因的存在。当两个或两个以上引物组得到所需PCR产物时，将小鼠评为hGH转基因阳性。图1展示利用三个引物组的脂肪酸结合蛋白(FABP)-hGH融合物转基因的示意图。根据制造商的说明书，利用购自DiagnosticSystemsLaboratories(Webster,Texas)的ELISA试剂盒测量血浆hGH含量。认为通过PCR测试为hGH转基因阳性且通过ELISA展现高血浆hGH含量的第一代后代为hGH转基因型。随后将转基因Fl与野生型C57BL/6小鼠回交以获得足够动物以供研究。将通过PCR和ELISA测试为hGH阴性的后代用作用于在研究中与hGH表达耐受动物相比较的天然动物。当用甲硫氨酰基hGH((met)-hGH)、具有在第35位取代的非天然氨基酸(对乙酰基苯丙氨酸)的甲硫氨酰基hGH((met)-ahGH;(met)Y35pAF-hGH)、具有在第35位取代的非天然氨基酸(对乙酰基苯丙氨酸)且在所述非天然氨基酸处经聚乙二醇化的甲硫氨酰基hGH((met)-ahGH-PEG;PEG-(met)Y35pAF-hGH;PEG-ahGH)或安慰剂激发时，评估hGH耐受小鼠和天然小鼠的免疫反应。hGH转基因小鼠和天然小鼠的给药方案展现于表2(无佐剂)和表3(存在弗氏不完全佐剂(incompleteFreund'sadjuvant))。<table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table>和第55天的样本执行ELISA以检测抗hGH抗体的存在和血浆hGH含量(DiagnosticSystemsLaboratories(Webster,Texas))。为检测抗hGH抗体，在室温下将ELISA板用(met)-hGH、(met)-ahGH((met)Y35pAF-hGH)或(met)陽ahGH-PEG(PEG-(met)Y35pAF-hGH)涂覆4小时。随后将板用PBS洗涤1次，接着在4。C下用PBS+5%BSA+0.05%Tween20阻断整夜。整夜培养后，将板洗涤2次，随后在各种稀释度下添加血浆样本。添加血浆样本后，在室温下将板静置1小时且随后洗涤4次。添加HRP连结的山羊抗小鼠IgG，且在室温下将板培养2小时。将板洗涤4次。随后添加TMB底物，且在室温下将板培养15-20分钟。通过加入1NH2S04终止反应，且在450nm下读取吸光率。/zGZ/转基齿小鼠的表征通过PCR关于hGH转基因的存在且通过对hGH具特异性的ELISA关于血浆hGH含量筛选总共63只小鼠。通过PCR和hGHELISA确定63只小鼠中有30只为非转基因型且因此在研究中将其登记为hGH天然动物。通过PCR测试33只小鼠为hGH转基因阳性。然而，这33只hGH转基因阳性动物中有两只在其血浆中未展现可检测的hGH含量且被排除在研究外。因此，在研究中将hGH转基因阳性且血浆hGH含量升高的31只动物登记为hGH耐受动物。天然小嵐和转基齿小嵐的抗体及应经(met)-hGH免疫的hGH天然(非tg)小鼠和转基因小鼠的抗体反应展示于图2-4中。经(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然小鼠和转基因小鼠的抗体反应展示于图5-7中。经PEG-(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然小鼠和转基因小鼠的抗体反应展示于图8-10中。经弗氏不完全佐剂中的(met)-hGH免疫的hGH天然小鼠和转基因小鼠的抗体反应展示于图11-13中。经弗氏不完全佐剂中的(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然小鼠和转基因小鼠的抗体反应展示于图14-16中。经弗氏不完全佐剂中的PEG-(met)Y35pAF-hGH免疫的hGH天然小鼠和转基因小鼠的抗体反应展示于图17-19中。将用于ELISA的平板用(met)-hGH、(met)-ahGH((met)Y35pAF-hGH)或(met)-ahGH-PEG(PEG-(met)Y35pAF-hGH)涂覆。图2与图8的比较表明聚乙二醇化hGH在表达hGH的转基因小鼠中不具免疫原性。另外，图11与图17的比较表明当将聚乙二醇化hGH与弗氏不完全佐剂一起调配时，聚乙二醇化hGH在表达hGH的转基因小鼠中不具免疫原性。研究开始和结束时的血浆hGH含量展现于表4(无佐剂)和表5(存在弗氏不完全佐剂)。表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table>图20展示免疫原性数据(抗体滴度)的概要。表6和7概括在无佐剂的情况下经免疫的动物的抗体滴度。<table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table>表7<table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table>表9<table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table>实例2如图22图B所示，当以与兔的免疫原性连结形式提供时，对乙酰基苯丙氨酸不具免疫原性。此外，还展示对乙酰基苯丙氨酸的免疫原性在诱导兔抗体产生方面不如天然氨基酸。通过EDC连结方法将Phe、Tyr、对乙酰基苯丙氨酸(pAF)和DNP的脱胺衍生物与兔的天然载体蛋白兔血清白蛋白(RSA)偶合。去除氨基以防止发生二肽和三肽形成，且将氨基酸与RSA上的赖氨酸侧链键联。用每只动物50微克弗氏不完全佐剂中的连结物将每组3只兔免疫。对动物增强免疫2次，并在免疫后8周时收集血清。通过ELISA针对相应KLH连结的氨基酸对血清进行测试。DNP的结果展示于图22图A中；Phe在图22图C中；且Tyr在图22图D中。RSA、RSA-Phe、RSA-Tyr、RSA-对乙酰基苯丙氨酸(pAF)和RSA-DNP的MALDI-TOF质谱分析展示于图21中。对于RSA，MW为66.2kDa且aa/RSA为0。对于RSA-Phe，MW为68.4kDa且aa/RSA为15。对于RSA-Tyr，MW为68.3kDa且aa/RSA为13。对于RSA-pAF，MW为69.6kDa且aa/RSA为18。对于RSA-DNP，MW为68.3kDa且aa/RSAM20RF34LM85NM86RF95NhGH耐受(met)-ahGH+IFAM18LM19NF41NF43LF44RLhGH天然(met)-ahGH-PEG+IFAM24NM25RM92NF48NF49RhGH耐受(met)-ahGH-PEG+IFA+-HII-+++++++++++++++++++DD++D++4D+++D+++—NNNNN++rI"一DDDNNNDDDDDNNNNN为8。实例3本实例描述选择将非天然编码的氨基酸并入hGH的优选位点的众多潜在标准组中的一种。本实例说明如何选择hGH多肽内供引入非天然编码的氨基酸的优选位点。使用晶体结构3HHR(其由hGH与受体(hGHbp)细胞外域的两个分子复合构成)以确定可引入一个或一个以上非天然编码的氨基酸的优选位置。利用其它hGH结构(例如1AXI)以检査晶体结构数据集之间一级和二级结构元件的潜在变化。这些结构的坐标可从蛋白质数据银行(ProteinDataBank,PDB)(Bernstein等人Mo/则1997，112,第535页)或经由可从万维网rcsb.org上得到的结构生物信息学合作研究组织PDB(ResearchCollaboratorforStructuralBioinformaticsPDB)得到。除因晶体无序而疏漏的残基148-153和C末端F191残基外，结构模型3HHR含有完整的成熟hGH22kDa序列。存在两个二硫桥，即由C53与C165和C182与C185形成的桥。本实例中使用的序列编号是根据美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2中所示的成熟hGH(22kDa变体)氨基酸序列进行。使用以下标准评估引入非天然编码的氨基酸的各hGH位置(a)基于3HHR、1AXI和1HWG(与hGHbp单体或二聚体连结的hGH的结晶结构)的结构分析，残基不应干扰任一hGHbp的结合；(b)残基不应受丙氨酸或同系物扫描诱变影响(Cunningham等人S"'e"ce(1989)244:1081-1085和Cunningham等人Scfe"ce(1989)243:1330-1336);(c)残基不应表面暴露且展现与周围残基的最小范德华(vanderWaals)或氢键相互作用；(d)残基在hGH变体中不应缺失或变化(例如Tyr35、Lys38、Phe92、Lysl40);(e)残基在经非天然编码的氨基酸取代后将引起保守改变；和(f)残基可见于高度可弯曲区域(包括(但不限于)CD环)或结构呈刚性的区域(包括(但不限于)B螺旋)。此外，利用Cx程序(Pintar等人(2002)说o!'n/onwa"cs,18,第980页)评估各蛋白质原子的突出程度可得出有关hGH分子的其它结论。因此，在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸并入(但不限于)以下hGH位置中的一个或一个以上位置处第1位前(即，N末端处)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，蛋白质的羧基末端)(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处取代29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处取代29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141,142、143、145、147、154、155、156、186和187(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处取代35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处取代30、74、103(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码的氨基酸在以下位置中的一个或一个以上位置处取代35、92、143、145(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，在一个或一个以上所述位置处将非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物键联，所述位置包括(但不限于)以下位置第l位前(即，N末端处)、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即,蛋白质的羧基末端)(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，在一个或一个以上所述位置处将非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物键联，所述位置包括(但不限于)以下位置29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:l或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，在一个或一个以上所述位置处将非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物键联，所述位置包括(但不限于)以下位置29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，在一个或一个以上所述位置处将非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物键联，所述位置包括(但不限于)以下位置35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，在一个或一个以上所述位置处将非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物键联，所述位置包括(但不限于)以下位置30、74、103(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，在一个或一个以上所述位置处将非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物键联30、35、74、92、103、143、145(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。在一些实施例中，在一个或一个以上所述位置处将非天然存在的氨基酸与水溶性聚合物键联35、92、143、145(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸)。用于产生hGH拮抗剂的一些位点包括1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123、127或在第1位前添加，或其任何组合(美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2或SEQIDNO:1或3的相应氨基酸，或任何其它GH序列)。利用激动剂设计的标准(c)-(e)选择这些位点。拮抗剂设计还可包括位点I残基的定点修饰以增加对hGHbp的结合亲和力。实例4本实例详述大肠杆菌中包括非天然编码的氨基酸的hGH多肽的克隆和表达。克隆hGH和其片段的方法在美国专利第4,601,980号、第4,604,359号、第4,634,677号、第4,658,021号、第4,898,830号、第5,424,199号和第5,795,745号中有详细描述，所述专利以引用的方式并入本文中。编码全长hGH或缺乏N末端信号序列的成熟形式的hGH的cDNA分别展示于美国专利第US2005/0170404号SEQIDNO:21和SEQIDNO:22中。使用所引入的包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统来表达含有非天然编码的氨基酸的hGH。O-RS优先利用非天然编码的氨基酸使O-tRNA氨酰基化。接着，翻译系统响应所编码的选择密码子将非天然编码的氨基酸插入hGH中。表2:美国专利公开案第US2005/0170404号的O-RS和O-tRNA序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage180</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage181</column></row><table>用含有经修饰hGH基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需非天然编码的氨基酸具特异性)的质粒转化大肠杆菌允许将非天然编码的氨基酸位点特异性地并入hGH多肽中。37'C下在含有0.01-lOOmM的特定非天然编码氨基酸的培养基中生长的经转化大肠杆菌以高保真度和效率表达经修饰hGH。所属领域技术人员已知纯化和分析hGH的方法且其可通过SDS-PAGE、Westem印迹分析或电喷雾-电离离子阱质谱等证实。实例5本实例详述含羰基氨基酸的引入和与含氨氧基PEG的后续反应。本实例展示一种产生hGH多肽的方法，所述多肽并有随后与约5,000MW的含氨氧基PEG反应的含酮非天然编码的氨基酸。根据实例3(hGH)的标准鉴别的残基35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、120、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155各自单独地经具有以下结构的非天然编码的氨基酸取代用于将对乙酰基苯丙氨酸位点特异性并入hGH的序列为上文实例4中所述的美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2(hGH)和SEQIDNO:4(muttRNA，詹氏甲垸球菌mt^ASL0以及16、17或18(TyrRSLWl、5或6)。修饰后，使包含含羰基氨基酸的hGH多肽变体与以下形式的含氨氧基PEG衍生物反应R-PEG(N)-0-(CH2)n-0-NH2，其中R为甲基，n为3且N为约5,000MW。使以10mg/mL溶解于25mMMES(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH6.0)、25mMHepes(SigmaChemical,St.Louis，MO)(pH7.0)中或者溶解于10mM乙酸钠(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH4.5)中的含对乙酰基苯丙氨酸的经纯化hGH与10到100倍过量的含氨氧基的PEG反应，且随后在室温下搅拌10-16小时(Jencks，W.J.爿肌C/ze附，Soc.1959,81,第475页)。随后将PEG-hGH稀释于适当缓冲液中以供立即纯化和分析。实例6由羟胺基经由酰胺键与PEG键联组成的与PEG的连结。使用实例5中所述的程序将具有以下结构的PEG试剂与含酮非天然编码的氨基酸偶合.R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-0-NH2，其中R-甲基，r^4且N为约20,000MW。反应、纯化和分析条件如实例5中所述。实例7本实例详细描述hGH多肽与含酰肼PEG的连结以及随后的原位还原。根据实例4和5中所述的程序制备并有含羰基氨基酸的hGH多肽。经修饰后，将具有以下结构的含酰肼PEG与hGH多肽偶合R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-X-NH-NH2，其中11=甲基，r^2且N二10,000MW，且X为羰基(C=0)。使以0.1-10mg/mL溶解于25mMMES(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH6.0)、25mMHepes(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH7.0)中或者溶解于10mM乙酸钠(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH4.5)中的含对乙酰基苯丙氨酸的经纯化hGH与1到100倍过量的含酰肼PEG反应，且通过加入溶解于水中的lMNaCNBH3(SigmaChemical,St.Louis,MO)储液达到10-50mM最终浓度来原位还原相应腙。在4'C到室温下于暗处进行反应达18-24小时。通过加入约pH7.6的1MTris(SigmaChemical,St.Louis,MO)达到50mM的最终Tris浓度或者稀释于适当缓冲液中来终止反应以供立即纯化。实例8本实例详细描述将含炔氨基酸引入hGH多肽中且用mPEG-叠氮化物衍生化。以下残基35、88、91、92、94、95、99、101、131、133、134、135、136、140、143、145和155各自经以下非天然编码的氨基酸(hGH;美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2)取代用于将对炔丙基酪氨酸位点特异性并入hGH的序列为上文实例4中所述的美国专利公开案第US2005/0170404号的SEQIDNO:2(hGH)、SEQIDNO:4(muttRNA,詹氏甲垸球菌m^A^A)以及9、lO或ll。使用实例5中所述的条件在大肠杆菌中表达含炔丙基酪氨酸的hGH多肽且加以纯化。将以0.1-10mg/mL浓度溶解于PB缓冲液(100mM磷酸钠、0.15MNaCl，pH=8)中的含炔丙基酪氨酸的经纯化hGH和10-1000倍过量的含叠氮基PEG添加到反应混合物中。随后将催化量的CuS04和Cu线添加到反应混合物中。培养混合物(包括(但不限于)在室温或37'C下约4小时或者在4'C下整夜)后，加入H20并使混合物滤过透析膜。通过(包括(但不限于))类似于实例5中所述的程序分析添加的样本。在本实例中，PEG将具有以下结构R-PEG(N)-0-(CH2)2-NH-C(0)(CH2)n-N3，其中R为甲基，n为4且N为10,000MW。实例9本实例详细描述炔丙基酪氨酸对hGH多肽中较大疏水性氨基酸的取代。将以下hGH区域，艮卩1-5(N末端)、6-33(A螺旋)、34-74(介于A螺旋与B螺旋之间的区域，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(介于B螺旋与C螺旋之间的区域，B陽C环)、106-129(C螺旋)、130-153(介于C螺旋与D螺旋之间的区域，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C末端)(美国专利公开案第US2005/0170404的SEQIDNO:2)中的一个中存在的Phe、Trp或Tyr残基用如实例8中所述的以下非天然编码的氨基酸取代<formula>formulaseeoriginaldocumentpage183</formula>修饰后，将PEG与包含含炔氨基酸的hGH多肽变体连接。PEG将具有以下结构Me-PEG(N)-0-(CH2)2-N3，且偶合程序将遵循实例8中的程序。这将产生包含非天然编码的氨基酸的hGH多肽变体，所述氨基酸与天然存在的较大疏水性氨基酸中的一个大致等排且在多肽内的不同位点处经PEG衍生物修饰。实例10将实例1中所述在第35位经对乙酰基苯丙氨酸(pAF)取代的甲硫氨酰基hGH多肽与单甲氧基-PEG-2-氨氧基-乙胺氨基甲酸酯盐酸盐(30KPEG)连结。在大肠杆菌宿主中使用对乙酰基苯丙氨酸和表达正交tRNA-氨酰基tRNA合成酶对的构筑体表达hGH多肽。执行以下程序以在hGH多肽与PEG之间形成肟键。对于PEG:Y35pAFhGH多肽，使用为8的摩尔比测定30KMPEG-氧基胺的用量。将PEG粉末称重，并在室温下在搅拌下将粉末分约3等份缓慢添加到8.86mg/mlY35pAFhGH溶液中。将大块固体PEG手工打碎。第一次和第二次添加后，在28'C下将反应混合物培养IO分钟。最后一次添加后，将反应混合物置于28'C下，同时轻柔搅拌40小时。应了解，本文所述的实例和实施例仅出于说明性目的，并且将对所属领域技术人员提出根据所述实例和实施例的各种修改或改变，且所述修改和改变都将包括在本申请案的精神和范围以及随附权利要求书的范围内。本申请案中引用的所有公开案、专利、专利申请案和/或其它文献都以全文引用的方式并入本文中用于所有目的，其引用程度就如同独立地指出将各个别公开案、专利、专利申请案和/或其它文献以引用的方式并入本文中用于所有目的一般。权利要求1.一种调节多肽免疫原性的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代所述多肽中的任一个或一个以上天然存在的氨基酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含通过一个或一个以上翻译后修饰来修饰所述多肽的额外步骤。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含将所述多肽与连接基、聚合物或生物活性分子键联或键结的额外步骤。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多肽是与水溶性聚合物键联或键结。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述多肽是经由所述非天然编码的氨基酸与所述水溶性聚合物之间的肟键与所述水溶性聚合物键联或键结。7.—种调节多肽免疫原性的方法，所述方法包含产生一个或一个以上编码包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽的聚核苷酸；在允许表达所述包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽的条件下，培养包含所述一个或一个以上编码所述包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽的聚核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；和纯化所述包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸的多肽。8.根据权利要求1或7所述的方法，其中所述非天然编码的氨基酸包含羰基。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述非天然编码的氨基酸包含酮。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述非天然编码的氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸。11.根据权利要求l或7所述的方法，其中所述多肽为人类生长激素。12.—种多肽，其包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸且具有经调节的免疫原性。13.—种多肽，其包含一个或一个以上非天然编码的氨基酸，且与天然多肽相比，其具有针对所述多肽的一个或一个以上特定表位的经调节的免疫原性。14.根据权利要求13所述的多肽，其中与所述天然多肽相比，所述多肽具有针对所述多肽的一个或一个以上特定表位的增加的免疫原性。15.根据权利要求13所述的多肽，其中与所述天然多肽相比，所述多肽具有针对所述多肽的一个或一个以上特定表位的降低的免疫原性。16.—种组合物，其包含根据权利要求12或13所述的多肽和医药学上可接受的载剂。17.—种治疗个体的方法，其包含对所述个体投与治疗有效量的根据权利要求16所述的组合物。18.—种根据权利要求12或13所述的多肽的用途，其选自由以下组成的群组消除免疫原性多肽的免疫原性、作为包括或刺激免疫原的免疫原性的疫苗、阻断抗体与多肽的结合和治疗一种或一种以上自体免疫疾病。19.根据权利要求12所述的多肽，其中所述多肽与所述天然多肽相比具有较高的免疫原性。20.根据权利要求12所述的多肽，其中所述多肽与所述天然多肽相比具有较低的免疫原性。全文摘要本发明尤其关于通过一个或一个以上非天然编码的氨基酸取代多肽中任一个或一个以上天然存在的氨基酸或添加一个非天然的氨基酸来调节多肽的免疫原性；以及关于具有改进的生物或药理学特性(诸如改进的治疗半衰期或经调节的免疫原性)的多肽的制备。文档编号C12P21/00GK101384711SQ200780002740公开日2009年3月11日申请日期2007年1月18日优先权日2006年1月19日发明者布鲁斯·E·金摩,汤姆士·O·丹尼尔,陈毕·辛姆申请人:Ambrx公司