专利名称：从食品样品中简易提取细菌dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌基因组DNA的提取方法，尤其涉及从食品样品中简易提取适 用于致病菌检测的DNA的方法。
背景技术：
自2004年4月安徽阜阳发生"劣质奶粉"事件以来，奶粉安全问题成为社会各界 广泛关注的焦点。奶粉的主要消费群体是婴幼儿、儿童、老人或病人等免疫力较低的人群， 尤其婴幼儿是奶粉的重要消费群体，因此，奶粉的安全性尤为重要，一直受到国务院、职能 部门和各级政府的高度重视。2002年科技部下达了"十五"国家重大科技奶业专项，对乳制 品中几种常见致病菌进行了快速检测方法的研究。由此可见，研究并建立快速准确检测奶 粉中的致病菌的方法以保障奶制品的安全非常必要。 国标中检测食品中致病菌的方法多是采用传统的分离培养和生化鉴定的方法，报 告检验结果大致需5 7天，加之检验方法繁琐、费时费力，不仅成为检验部门的一项沉重 负担，而且越来越不能满足食品安全和日益发展的国际贸易的需要。另外，在检验环境中， 也很容易造成环境和/或标本的污染。再者，传统方法还存在培养条件苛刻或某些致病菌 难以培养的问题。 以PCR为基础的现代分子生物学技术为病原微生物的检测开辟了一条快速灵敏 的途径。分子生物学技术应用于微生物检测首先需要用PCR方法扩增临床样品中病原体的 靶核酸序列，然后用其它多种分子生物学手段对扩增产物进行分析，从而鉴定病原体的有 无和种类。对扩增产物进行分析的常用方法包括电泳、杂交等。以DNA杂交为基础的基因 芯片技术，更具有敏感性高、特异性强、可实现大规模集成化等优点。 分子生物学技术应用于食品致病微生物检测的核心之一是样品中病原体DNA的 有效提取。食品中可能的致病菌既有G+菌，也有G—菌，且食品种类复杂，成分多样，含有丰富 的蛋白、脂肪、维生素、微量元素等，某些成分有强烈抑制PCR反应的作用，如果在细菌DNA 提取过程中不能有效去除这些抑制成分，将会对以后的PCR反应造成很大问题。
为了克服上述缺陷，目前人们已采取了多种方法，例如对标本进行预处理并使用 柱层析方法分离DNA，以及P. Cremonesi等人的方法(J. DairySci， 89 (2006) :163-169)。但 这些方法皆因成本较高或试剂有毒且易于造成DNA的损伤等问题，而难以在基层医疗单位 的实验室广泛使用。 因此，本领域有必要提供一种新的食品样品中细菌的基因组DNA的方法，以便能 够以较低的成本，简单、快速地从食品样品中提取高质量的总DNA，使其适应检验检疫领域 检测食品中致病菌的需要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种操作简便、易行的从食品 样品中提取高质量细菌基因组DNA的方法，以适应检验检疫领域快速检测食品中致病菌的需要。 本发明提供的从食品样品中提取细菌基因组DNA的方法，主要包含步骤 1)以含有细菌的食品为样品，过夜培养，离心富集菌体，然后用无菌水充分洗涤，
得沉淀物； 2)使用含KC1， Tris-HCl， MgCl2和蛋白酶K的裂解液重悬步骤1)所得的沉淀物， 得重悬液； 3)将步骤2)所得的重悬液进行第一次水浴，裂解细菌细胞，然后再经第二次水 浴； 4)将步骤3)的所得物进行离心，获得含所述细菌基因组DNA的中层上清；
5)收集步骤4)的含所述细菌基因组DNA的中层上清，烘干，即制得所述细菌基因 组DNA。
本发明的较佳实施例中，步骤1)中样品可以为婴儿配方奶粉，该婴儿配方奶粉中 含有沙门氏菌、志贺氏菌、化脓性链球菌、蜡样芽孢杆菌、产酸克雷伯氏菌、金黄色葡萄球 菌、粘质沙雷氏菌、单增李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏 菌、弗氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、副溶血弧菌中的至少一种致病菌。
本发明的较佳实施例中，步骤2)所述的裂解液还可以包含TritonX-lOO， NP40或 Tween 20中的至少一种。优选地，步骤2)所述的裂解液包含KC1，Tris_HCl，MgCl2，Triton X-IOO， NP40， Tween 20和蛋白酶K ;具体地可以为裂解液包含50mM KCl，10mM Tris-HCl， 2. 5mM MgCl2，0. 1%的Triton X-IOO，O. 5% NP40，0. 5% Tween 20禾P 0. lmg/ml的蛋白酶K ; 其中Tris-HCl的pH值优选为9. 0。 本发明的较佳实施例中，步骤3)中第一次水浴的温度为40 60°C ，优选为45 55t:，更佳地为50°C。 本发明的较佳实施例中，步骤3)中第一次水浴的时间为0 120分钟，较佳地为 20 100分钟，更佳地为40 80分钟，最合适为60分钟；第二次水浴的温度优选为100°C 。
本发明的实验结果表明，本发明所述的方法其去除抑制剂的效果明显，其所使用 的裂解液可有效破坏细菌细胞壁，去除蛋白并去除抑剂成分；灵敏度高，使用本发明的方 法，可对少至102cfu的样品进行处理，而获得稳定的PCR扩增效果；操作简便，适用于实际 检验；所需试剂均为常规试剂，无毒且费用低；而且对DNA的损伤很小，提高了 PCR的稳定 性和分析结果的准确性。 下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和 原则前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明的权利要求范围 内。
图1A-图IB为经裂解液溶液处理奶粉样品中不同细菌后所得DNA的琼脂糖电泳 结果及以其为模板的PCR产物的琼脂糖电泳结果。其中l-15分别为沙门氏菌、志贺氏菌、 化脓性链球菌、蜡样芽孢杆菌、产酸克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、粘质沙雷氏菌、单增李斯 特氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、普通变形 杆菌、奇异变形杆菌、副溶血弧菌，M为DL2000Marker， N为负对照。
图2为对不同食品样品(猪肉、鸡蛋)经裂解液处理得到的DNA及以其为模板的 PCR产物的琼脂糖电泳结果。1为将金黄色葡萄球菌掺入的鸡蛋样品中，2为将金黄色葡萄 球菌掺入的猪肉样品中，3为将阪崎肠杆菌掺入的鸡蛋样品中，4为将阪崎肠杆菌掺入的猪 肉样品中，M为DL2000Marker。 图3A-图3B为裂解液不同时间下的裂解效果梯度试验。其中3A为革兰氏阳性菌 的结果，3B为革兰氏阴性菌的结果，M为DL2000Marker。 图4A-图4B为裂解液在不同温度下裂解效果的梯度试验。其中4A为革兰氏阳性 菌的结果，4B为革兰氏阴性菌的结果，M为DL2000Marker。 图5为使用裂解液提取基因组与使用商品化试剂盒提取基因组的对比实验。其中 G+(裂)为裂解液提取的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的结果，G-(裂)为裂解液提取的 革兰氏阴性细菌阪崎肠杆菌的结果，G+(kit)为基因组提取试剂盒提取革兰氏阳性细菌金 黄色葡萄球菌的结果，G-(kit)为基因组提取试剂盒提取的革兰氏阴性细菌阪崎肠杆菌的 结果，M为DL2000Marker。
具体实施例方式
下面通过最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。以下实施例仅仅是用于说明 而不是限制本发明。 实施例1提取婴儿配方奶粉样品中的细菌总DNA 提取婴儿配方奶粉样品中的细菌总DNA的完整步骤包括 1)取1. 5ml的含菌的婴儿奶粉过夜培养物加入到1. 5ml灭菌离心管中，8000rpm 离心5分钟收集菌体。 2)加入700 ii 1的无菌水洗涤菌体2次 3)加入100ii 1裂解液(50mM KCl，10mM Tris-HCl (pH9. 0) ， 2. 5mMMgCl2， 0. 1 %的 Triton X-IOO，O. 5% NP40，0. 5% Tween 20和0. lmg/ml的蛋白酶K)重悬菌体。
4)将上述菌悬液5(TC水浴1小时后再IO(TC水浴15分钟。 5)16，000Xg离心4分钟，取中层上清20iil转移到一个新的1. 5ml灭菌离心管 中，进行后续PCR反应或-201:储存。 实施例2裂解溶液处理不同细菌的奶粉样品实验 将沙门氏菌、志贺氏菌、化脓性链球菌、蜡样芽孢杆菌、产酸克雷伯氏菌、金黄色葡 萄球菌、粘质沙雷氏菌、单增李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、小肠结肠炎耶尔森 氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、副溶血弧菌分别搀入含婴儿配方奶 粉的培养基中，过夜培养后，按照上述实施例的提取婴儿配方奶粉样品中细菌中总DNA的 方法操作，最终所得DNA的琼脂糖电泳结果及以其为模板的PCR产物的琼脂糖电泳结果如 图1A和图1B所示，其中1-15分别为上述15种细菌，M为DL2000Marker， N为负对照。从 所述图中可以看出该提取方法可以提取出高质量的、对PCR无影响的基因组DNA。
实施例3裂解液处理不同食品样品的实验 将革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(坂崎杆菌)分别搀入鸡蛋、 猪肉食品中，过夜培养后，分别参照上述实施例的提取婴儿配方奶粉样品中细菌DNA的方 法操作，所提取的DNA和以其为模板的PCR产物的琼脂糖电泳结果如图2所示，其中的1为将金黄色葡萄球菌掺入的鸡蛋样品中，2为将金黄色葡萄球菌掺入的猪肉样品中，3为将阪 崎肠杆菌掺入的鸡蛋样品中，4为将阪崎肠杆菌掺入的猪肉样品中，M为DL2000Marker。从 中可以看出该提取方法可以从不同的食品中提取出高质量的、对PCR无影响的基因组DNA。
实施例4裂解液不同时间下裂解效果的实验 将革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(坂崎杆菌)分别过夜培养 后，按照上述实施例的提取婴儿配方奶粉样品中细菌中总DNA的方法操作，5(TC水浴时间 分别为0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、80分钟、100分钟、120分钟，最终所得DNA的琼脂 糖电泳结果及以其为模板的PCR产物的琼脂糖电泳结果如图3A和3B所示，其中3A为革兰 氏阳性菌的结果，3B为革兰氏阴性菌的结果，M为DL2000Marker。从所述图中可以看出，不 小于60分钟的作用时间，效果较好，优选时间为60分钟。
实施例5裂解液不同温度下裂解效果的实验 将革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(坂崎杆菌)分别过夜培养 后，按照上述实施例的提取婴儿配方奶粉样品中细菌中总DNA的方法操作，水浴时间分别 为4(TC、45t:、5(rC、55t:、6(rC，最终所得DNA的琼脂糖电泳结果及以其为模板的PCR产物 的琼脂糖电泳结果如图3A和3B所示，其中4A为革兰氏阳性菌的结果，4B为革兰氏阴性菌 的结果，M为DL2000Marker。从所述图中可以看出，5(TC或更高的作用温度，效果较好，但由 于成分中有蛋白酶K，过高温度会影响其活性，所以最佳温度为5(TC。
实施例6裂解液与商品化基因组提取试剂盒的对比实验 将革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(坂崎杆菌)分别过夜培养 后，按照上述实施例的提取婴儿配方奶粉样品中细菌中总DNA的方法操作，同时按照基因 组提取试剂盒(北京天根公司)使用说明书的操作方法提取基因组，最终所得DNA的琼脂 糖电泳结果及以其为模板的PCR产物的琼脂糖电泳结果如图5所示，其中G+(裂)为裂 解液提取的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的结果，G-(裂)为裂解液提取的革兰氏阴性 细菌阪崎肠杆菌的结果，G+(kit)为基因组提取试剂盒提取革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球 菌的结果，G-(kit)为基因组提取试剂盒提取的革兰氏阴性细菌阪崎肠杆菌的结果，M为 DL2000Marker。从所述图中可以看出，该裂解液提取的基因组的扩增效果与试剂盒提取效 果相当。
权利要求
一种从食品样品中提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于包含步骤1)以含有细菌的食品为样品，过夜培养，离心富集菌体，然后用无菌水充分洗涤，得沉淀物；2)使用含KCl，Tris-HCl，MgCl2和蛋白酶K的裂解液重悬步骤1)所得的沉淀物，得重悬液；3)将步骤2)所得的重悬液进行第一次水浴，裂解细菌细胞，然后再经第二次水浴；4)将步骤3)的所得物进行离心，获得含所述细菌基因组DNA的中层上清；5)收集步骤4)的含所述细菌基因组DNA的中层上清，烘干，即制得所述细菌基因组DNA。
2. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于步骤l)中样品为婴儿配方奶粉，该婴儿配 方奶粉中含有沙门氏菌、志贺氏菌、化脓性链球菌、蜡样芽孢杆菌、产酸克雷伯氏菌、金黄色 葡萄球菌、粘质沙雷氏菌、单增李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、副溶血弧菌中的至少一种致病菌。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述的裂解液包含Triton X-IOO， NP40或Tween 20中的至少一种。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2)所述的裂解液包含KCl，Tris-HCl， MgCl2， Triton X_100， NP40， Tween 20和蛋白酶K。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤2)所述的裂解液包含50mM KCl，10mM Tris-HC1，2. 5mM MgCl2， 0. 1 %的Triton X-IOO，O. 5% NP40，0. 5% Tween 20禾P0. lmg/ml的 蛋白酶K。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤2)所述的裂解液中Tris-HCl的pH值 为9.0。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中第一次水浴的温度为40 6(TC。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤3)中第一次水浴的温度为45 55t:。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤3)中第一次水浴的温度为5(TC。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中第一次水浴的时间为0 120 分钟。
11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于步骤3)中第一次水浴的时间为20 100 分钟。
12. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于步骤3)中第一次水浴的时间为40 80 分钟。
13. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤3)中第一次水浴的时间为60分钟。
14. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中第二次水浴的温度为IO(TC。
全文摘要
本发明公开了一种从食品样品中简易提取细菌基因组DNA的方法，其主要包含步骤以含有细菌的食品为样品，过夜培养，离心富集菌体，然后用无菌水充分洗涤，得沉淀物；使用含KCl，Tris-HCl，MgCl2和蛋白酶K的裂解液重悬上述的沉淀物，得重悬液；对所得的重悬液进行第一次水浴，裂解细菌细胞，然后再经第二次水浴；将所得物进行离心，获得含所述细菌基因组DNA的中层上清；收集上清，烘干，即制得所述细菌基因组DNA。使用本发明的方法，可充分裂解革兰氏阳性和革兰氏阴性(G+、G-)菌的细胞壁，同时由于裂解液中加入了蛋白酶K，并加热煮沸，使得蛋白凝固变性，提高了DNA的提取效率和纯度。
文档编号C12Q1/68GK101748175SQ20081018255
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月5日 优先权日2008年12月5日
发明者曹勃阳, 杨斌, 王敏, 王磊 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司