专利名称：一种重组人胰岛素规模化生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，准确地说公开了一种重组人胰岛素规模化生产工艺。
背景技术：
糖尿病是目前世界上严重危害人类健康的三大非传染性疾病之一，随着人们生活 水平和生活方式的不断提高和改善，糖尿病的发病率一直以每年10%的速度上升。据统计， 目前全世界有糖尿病病人约2亿人，我国也有5000万以上的糖尿病患者；2010年我国发病 人数预计将达到6000万；到2025年，我国糖尿病患者总数将接近1亿，成为世界上糖尿病 患者人数仅次于印度的第二大国。就近几年的胰岛素市场来看，2003年全球胰岛素市场已 达40多亿美元(其中欧美市场胰岛素销售额达39亿美金)，成为占有全球降血糖药物市 场10%以上的重要品种。2005年，全世界胰岛素市场将有约为50亿美元的经济效益，其 中98%都是来自于人胰岛素市场。全球人胰岛素的生产厂家主要有美国Lilly公司、丹麦 NOVO公司和德国Aventis公司三家巨头，大约占据人胰岛素98%左右的市场份额。而在 中国市场，由于人胰岛素价格高，动物胰岛素的使用比例仍然较高，大概占了 60%左右的胰 岛素市场；人胰岛素国内市场98.5%以上的份额主要依赖进口。近几年，由于疯牛病以及 动物口啼疫等传播性疾病的蔓延，使以动物源为辅料的胰岛素产品逐渐进入淘汰之列。发 达国家的糖尿病患者已普遍使用人胰岛素，随着人们对糖尿病及其治疗认识水平的逐步提 高，我国使用人胰岛素的患者也将大幅度上升，重组人胰岛素取代动物胰岛素势在必行。
国内市场上，取得重组人胰岛素生产批文的厂家，总共占有国内人胰岛素市场份 额不超过1.5%。虽然通化东宝关于重组人胰岛素的媒体报道较多，但国内该公司的重组人 胰岛素产品的销售量却很少。我们认为，目前，国内在重组人胰岛素的大规模生产上依然存 在不可跨越的技术难题，无法达到低成本的公斤级批次生产规模。
发明内容
本发明公开的一种重组人胰岛素规模化生产工艺，就是控制10吨规模发酵过程 中的工艺参数的稳定，使收率保证达到180g菌体/L发酵液，在高蛋白浓度情况下，进行 高效率复性，复性效率超过90% ;用酶切除C肽后，在大规模层析条件下，使酶切收率大 于95% 。最终实现400kg的年生产力，总收率达75g/L以上，纯度达99. 5%以上，效价达 28.5U/mg以上，质量符合美国药典标准(27版)。同时，获得低精蛋白锌重组人胰岛素注射 液(50R和30R)的生产批件。
实施方式 是采用重组DNA技术在大肠杆菌中高效表达一种特异的人工设计的胰岛素原。 该胰岛素原不同于天然的胰岛素原，具有易于高效表达、易于下游分离纯化、复性以及转 化为天然胰岛素的特点。在大肠杆菌中表达的天然人胰岛素原非常难于进行高效、简便 的复性，造成生产成本极高，无法进行公斤级的规模生产。我公司通过蛋白质工程和基因 工程技术，成功设计构建了一种非天然的胰岛素原序列。该胰岛素原为Met-Lys-XXX-A
3链-XXX-XXX-Gly-Gly-Arg-Lys-B链。在重组人胰岛素规模化的生产中具有以下特点1 、在 大肠杆菌中易于高效稳定表达，表达量超过总蛋白量的40%，高密度发酵工艺稳定简单，细 菌生产繁殖周期短，生长快，培养成本低；2、分子量较小，人胰岛素所占比例超过85%;3、易 于复性，在高浓度情况下可以高效率复性，即在0. 5毫克/毫升的浓度下进行复性，2小时即 可完成复性过程，复性效率超过90X;复性后经一步胰酶、羧肽酶即可切除前导肽，以及A、B 链之间的连接肽；获得与天然胰岛素完全一致的产品；4、每升发酵液经过下游分离纯化以 及复性酶切转化后，可获得750毫克以上的高纯度、高效价的重组人胰岛素，直接成本(原 辅料成本)每公斤不超过15万元人民币。我们在成功完成IOOL发酵规模生产的工艺基础 上，对该工艺进行了长达3个月的验证，在验证期间，我们实施了每两天生产一批的生产周 期，解决了每一步工艺的衔接问题，现在已经完全能够做到该工艺批与批之间的连续生产， 工艺稳定，批与批之间重复性极强，每批收率始终稳定在75g以上，HPLC纯度分析始终稳定 在99. 5%以上，小鼠血糖法测定效价始终稳定在28. 5U/mg以上。由于我们100L发酵规模 生产的工艺极为稳定、可靠，因此该产品的收率、成本和生产周期将明显优于所有国内外公 开的资料及我们通过其它渠道所获得的资料所载工艺。 另外，生产重组人胰岛素需要的两种重要辅料胰酶和羧肽酶均由我们的专有技术 生产，技术成熟度高，大大降低了重组人胰岛素的生产成本，其中胰酶是从我们公司的动物 胰岛素提取的废渣中提取的。经过严格的成本测算考核，该工艺的直接成本(原辅料成本) 不高于15万元/kg人胰岛素，低于动物胰岛素的生产成本，因此不仅从疗效上优于动物胰 岛素，成本上也更有优势。
权利要求
重组人胰岛素规模化生产工艺，就是控制10吨规模发酵过程中的工艺参数的稳定，使收率保证达到180g菌体/L发酵液，在高蛋白浓度情况下，进行高效率复性，复性效率超过90％；用酶切除C肽后，在大规模层析条件下，使酶切收率大于95％。最终实现400kg的年生产力，总收率达75g/L以上，纯度达99.5％以上，效价达28.5U/mg以上，质量符合美国药典标准(27版)，同时，获得低精蛋白锌重组人胰岛素注射液(50R和30R)的生产批件。
全文摘要
重组人胰岛素规模化生产工艺，主要特征是解决重组人胰岛素从中试规模(100L)放大到小批量(1吨)生产，直至规模化(10吨)。方案为(1)控制10吨规模发酵过程中的工艺参数的稳定，使收率保证达到180g菌体/L发酵液；(2)在高蛋白浓度情况下，进行高效率复性，复性效率超过90％；(3)用酶切除C肽后，在大规模层析条件下，使酶切收率大于95％。最终实现400kg的年生产力，总收率达75g/L以上，纯度达99.5％以上，效价达28.5U/mg以上。
文档编号C12R1/19GK101736063SQ20081019460
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月14日 优先权日2008年11月14日
发明者夏同威 申请人:夏同威