用来处理分析物的设备及其使用方法

专利名称：用来处理分析物的设备及其使用方法
用来，分析物的设备 及其鹏方法
技术领域：
本发明涉及用来处理分析物的设备和使用所述设备处理和/或检测分析物 的方法。
分析物像生物M进入实际设备的生物酶驱动处理的运输，对于像在生物 传感、即时诊断和健康保健方面的应用成为一个^^越重要的问题。具体的应
用例子是便携式DNA测序，^t个体化用药、用于非常早期疾病检测的单分子 级的医学诊断和灵i^极高的生物危害化合物、药物和环境敏感性化合物的检 测是必要的。
在人工环境里存在着许多与分析物,处理和检观啲实5见有关的挑战，例 如，像在微流回路中的无机表面上。
,处理最关键的问题之一，像在人工结构里面的DNA消化，是将^ 运输和使它停留在所希望的位置，在该位置酶促处理后紧接着将发生一个分析 步骤。另外一个重要问题是用新鲜的好替代已分析的肝(反复鹏和检测)。 通常ttM过分析物预浓縮来提高检测限。并且在多数生物应用中，处理和检 观涉骤必须在液相状态下进行，使酶在表面壁上非特异性吸附和, 成为一个 突出的问题。
几种像在极微和微流结构中特异性固定定位点和DNA肝共价或非共价 固定在那些所定义的定位点上的结合方法已经被研究，(S.Matsuum等人, Nucleic Acid Research 29,16(2001)e79; S.Katsura等人1st Annual International 正EE"EMBS Special Topic Conference On Microtechnologies In Medicine & Biology (2000) Lyon, France)。然而，也发现在DNA ^iif壁上的非特异性吸附和DNA 在定位点或者太弱(非共价)或者不可逆(共价)的结合使这种方法不具吸引 力。
激光阱也能被用来在微流结构里面定位和固定珠-DNA组fKK. Ddire等人, J Biotech. 86 (2001) 225-236;丄Stephan等人J Biotech. 86 (2001) 255-267; U. Keyser等人Nature Physics 2 (2006) 473477)。然而，这样的步骤需要大量硬件，
不适合便携式的解决办法。
由Washizu等人发表的方法描述了使用交流电场将DNA ^ 捕获和共价 粘附在铝电丰肚。DNA兽,申展并被酶辦^S(T. Yamamoto等人正EETmas. on Industry Appl.， 36， 4 (2000) 1010-1017)。但是，这种方法的主要缺点是DNA沿 着电极结合在特定位置的可靠性和重复性。
美国专利US 2003/0064400 Al描述了J15iiM珠-DNA组件将DNA定位
在微^a道内。这些珠的定位只^m过将珠捕获在'i^i道和极小通道的交叉处 实现的。然而，鹏的结构和尺寸很容易由于珠的聚集而导致堵塞。
因此，本发明的一个目的是提供用于处理分析物的改进的设备。本发明另 外一个目的是提供允许固定单分析物分子并且将其定位在它们的检领IJ/分析点附 近的设备。本发明的又一个目的是提供允许预浓縮分析物来提高检测限和检测 器灵敏度的方法和设备。
本发明的目的Jiilil处理分析物的设备来实现的，该设备包括包括基底， 所述基底是单片材料并且包含 通道系统，所述通道系统具有
至少一个第一类型通道，所述第一鄉通道的尺寸是深度和宽度为l拜到
lmm，
至少一个第二，通道，所述第二lllMil道与所述第一，通道是流体相 连的，所述第二鄉通道的深度和宽度为lnm至iJ2000nm，所鄉一类型鹏流 入所述第二鄉通道，
分析物处理或释放区域，所述区,成在所，一类型通道流入所述第二 类型通道的位置，
以及与所述第二类型通道是流体相连的的检测器，所述检测器与所述分析物处 理或释放区鄉目隔开。
tti^i也，所述^^不是复合基底。
在一个实施方案中，根据本发明的设备进一步包括肯滩结合分析物的载体 颗粒，以及肖辦在所述第一类型鹏内运输所述载体颗粒的在所i^lit系统内 的線ij,其中，tmtfe，所述载体颗粒尺寸是在0.1nm到lmm的范围内，雌 訓nm至lj5fim。
在一个实施方案中，所述第一类型通道的尺寸是所述载体颗粒尺寸的至少5倍宽和深。
在一个实施方案中，所述第一鄉通道的尺寸是深度为10Mm到20Mm,宽 度为10拜到200拜，并E^述载体颗粒的尺寸是在小于或等于2miti的范围内。
雌地，所述分析物处理離放区域有锥形结构，其中所鹏縣统的横 截面从所述第一，通道到所述第二^通道以不,梯度^^地减小。
在一个实施方案中，所述第二鄉通道的尺寸范围是深度和宽度为100nm 到800nm。
在另外一个实施方案中，所述第二类型通道的尺寸范围是从大于到
在一个实施方案中，所述第一类型通道另外还包括阻碍结构，所述阻碍结 构在所述第一类型通道中防止物质例如溶剂和载体颗粒的未阻碍流动，其中， 优选地，所述阻碍结构是被放进所述第一类型通道中的正方形、三角形和圆形物质。
在一个实施方案中，所述载体颗粒是球形、立方体形、平行化(paralkliped)
或不规则皿。
^ife，所述第一l^fflit的长度范围是从lmm到10cm，所述第二KIM 通道的长度范围是从lnm至ijlmm, tt^tfe勝100nm到IOO拜。
在一个实施方案中，所述检测器与所述分析物处理区域有一距离，所淑巨 离在lnm到1000Mm的范围内，■ 5nm至lj 1罔。
在一个实施方案中，所述检测器选自生物孔蛋白、Ait^米孔、纳隙传感 器、电化学传緣光谱传繊、质谱传感器、拉曼光谱传麟和FTIR光谱传繊。
在一个实駄案中，根据本发明的设备进一步包括引Mn/或维持凝诉卩所 述载体颗粒M所述通道系统流动的设备，其中，,地，所述引A^P/或维持 流动的设备在所述總诉卩/^^述载体颗粒上施加电力、磁力、电磁力或流胸力。
在一个实施方案中，根据本发明的设备进一步包括在所述分析物处理， 放区域固定所述载体颗粒的装置，其中，i^fe，所述固定體在所述翻诉o/ ^^f述载体颗粒上施力口电力、磁力、电磁力或流胸力。
在一个实駄案中，其中所述基底是由选自硅、1化硅、玻璃、聚合物
例如pdms、聚碳酸酯、pe、硅氧烷的材料制成的，并且所i^iii^统Jiii31 电子束记M、蚀刻术、模塑、聚焦离子束蚀刻术、激光烧蚀术、压花制成 的，其中所述基底是由聚合物或聚合物组合制成的，并且所述基底是使用
模板(master)通过模塑或压花所述聚合物形成单片材料，在所述模板里， 提供了所M道系统的负象。
在一个实施方案中，所述载体颗粒是由选自二氧化硅、三氧化二铝，金属 性的和/或有磁性的材料例如Au、 Ag、 Pd、 Pt、 Al、 Ti、 Fe、 Ni,陶瓷和聚糊 例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、三聚氰胺、聚交酯、 葡聚糖的材料制成的。
在一个实 案中，所述载体颗^腿一步包括分析物结合基团，所述基团 与所述分析物上的相应载体颗粒结合基团相互作用，其中，雌地，其中一对 分析物-结合基团和相应的载体颗粒结合基团选自生物素/(链霉)抗生物素蛋白、 抗彬抗原、，醇变体、镍/His6、凝集素/糖、谷胱甘肽/谷胱甘肽-S-转移 酶，NH2/COOH/环氧基共价键合、以髙亲合力结合来自各种物种的不同 种类和子类免疫球蛋白的Fe片段的蛋白A、 G，氢键，或基于DNA碱基 杂交、适体(aptamer)结合例如蛋白质-DNA/RNA相互作用、胶原/胶原 结合蛋白，Dig/抗洋地黄毒苷，或者基于激素结合，或者基于其它静电、 离子和/或共价相互作用。
在一个实施方案中，其中所^I道系统在所^1道的表面被修饰，所述修 饰;M5i应用化学物质以M^分析物在表面上的非特异性吸附而实现的，其中， tti^地，所述改变是i!31液相沉积或气相沉积来实现的，i^气相沉积，更优 选硅烷的气相沉积。
在一个实 案中，其中所^Mit的所述表面选自聚，例如PDMS和二 氧化硅，其中，优选地，所述《射布题过将所述表面暴露于具有化学端基例如 甲基、氨基、氟或硫醇基的^化合物或将疏水基团暴露于所述通道表面 的其它种类分子来实现的。
在一个实施方案中，根据本发明的设备进一步包括在所述分析物处理或释 放区i^人所述载体颗f嫌^^f述分析物的體，其中，雌地，释^;;f述分析 物的装置基于所述分析物从所述载体颗粒的光诱导释放、电场诱导释放、温 度诱导释放、化学反应或生化反应例如与辅因子的生化反应、酶介导诱导的
1
释放，来实施这样的释放。
在一个实施方案中，根据本发明的设备进一步包皿过化学反应例如裂解
成更小的片段或结构单元，而进一步^hS所述分析物的装置，其中，优选地， 所述M:化学反应进一步处理所述分析物的^a是载体珠，在所述载体珠上固 定有化学剂，,酶。
在一个实施方案中，所述分析物选自核酸例如单链、双链DNA、 RNA、 蛋白质、多肽、药物以及在环境条件下是气态或液态的其他肝、生物学或环 境上有害的分子。
本发明的目的也^131 1和/或检测分析物的方法来实现的，所述方^ 括以下步骤-
一将分析物结合在如上定义的载体颗粒上，
—通过根据本发明的设备的所i&ilil系统，将所述载体颗粒和结合到其上 的分析物运输到所述设备的所述分析物,，放区^，
一将所述载体颗粒和结合到其上的分析物固定在所述分析物处理，放区
域上'
—通鹏用光、电场、磁场、电磁场、热或冷，舰过实施化学或生4機 解反应例如j顿酶，如核酸酶、蛋白酶例如ExoI、 Exoffl、 Sfol、 Xbal和其它
限制酶的化学或生《機解反应，^^f述载体颗ai:释方处;f述分析物，
和/^ ^行化学或生^ 反应例如4顿酶，如核酸酶、蛋白鹏咖Exo I、 Exom、 Sfol、 Xbal和其它限制酶的化学或生1^^反应，来4zbS^f述分析 物，
一将所述释放的分析物^^述处理过的分析物^述释放且处理过的分析 物运输到所述检测器上，
—使用如上定义的检测，测所述释放的分析物或所述处理过的分析物或 所述释放且处理过的分析物。
在一个实施方案中，根据本发明的方法进一步包括^^ 述分析物已经被释 放和/或处理后/A^f述分析物M辦放区域去除所述载体颗粒的步骤。
雌地，所述运输步骤和所述去除步骤是利用所述装置来实施的，以便引 A^/或维持如上所定义的鋭诉卩载体颗粒的流动。
在一个实施方案中，所述固定步骤是313i^述分析物处理或释放区域的尺
寸或通过如上定义的所述固定所述载体颗粒的^置，或者通过二者的组合来实现的。
1Mi也，l柳所述检测器的检测步骤题过光学检测、化学检测、电检测、 磁检测、电化学检测来实现的。
在一个实施方案中，所述分析物是核酸，所述处理分析物的步骤是所述核 酸的,降解，所述检测所述处理过的分析物的步骤包括单核苷酸或核苷酸碱 基的检测，以说明所述核酸的序列。
在一个实施方案中，所述 ^过将载体珠加入到所3^1道系统中 来实现的，在所Mii上，固定有用于,隨的载体珠酶。
本发明的目的也可以通过根据本发明的设备的生产方法来实现，包括以下 步骤
—提供具有有如上所定义的所m道系统的负象的模板 一使用所述模板和聚合物材料或适合形成聚合物的材料来模塑或压花所 述基底，从而获得所述的作为单片材料的基底，所述基底包含所述通道系统。
优选地，该方法进一步包括以下步骤-一用平板例如玻璃板覆盖所述通道系统。
在一个实施方案中，所述模板的所述通道系统的负象是通过选自电 子束记录术、蚀刻术、离子束蚀刻术、激光烧蚀术、光刻技术和这些技术 的组合的方法形成的。
这里被用与基底有关的术语'单片材料'意思是一种特定情况，其中该 基底是被制成作为一个单片材料。例如美国专利US2003/0064400描述 了一种里面有不同尺寸通道的系统的设备的制造，其中，每一类型的通 道被限定成不同的基底，并且这些基底被按序组合例如胶合在一起。这 样组装的基底此处也称为'复合基底'，并且根据本发明的基底不是这样的 '复合基底'。更确切地，在这里使用的术语'单片'，意思是一个特定情况， 其中，有一个由一片材料制成的单一基底，该一片材料不包括不同部分 或组分组装在一起，例如通过胶合或其它机械连接。更确切地，在根据 本发明的基底中，有一个单片材料，该材料里面存在通道系统。这里有 时也指通道系统'被嵌在所述基底里'。与根据本发明的'单一基底'或'整体
基底'或'非复合基底'相反，在美国专利US2003/0064400中有超过一个的 基底或者'复合基底'。在根据本发明的优选实施方案中，根据本发明的基 底是由单片材料或单片材料形成的，该材料在优选实施方案中是由一种 聚合物或几种聚合物的结合制成的，并且是通过使用一个适当的模板压 花这样的聚合物形成的，其中，通道系统的负象事先已经形成。在另一 个实施方案中，这样的适当模板也用来压花例如热压花成聚合物材料。 本领域技术人员都知道怎么形成一个适当的模板，例如由一个硅片或 二氧化硅片幵始，使用适当的沉积和去除步骤顺序，例如，电子束记录术、 蚀刻术、聚焦离子束蚀刻术、激光烧蚀术和其它照相平版印刷技术，以产 生所述通道系统。怎么形成适当模板的例子以后会在本申请中给出。
在这里使用的术语'通道系统'意思是指是流体相连的的通道网络。术 语'是流体相连的'的意思是两个通道之间的空间关系，该关系要求物质例 如液体，可以从一个通道运输或流动到另一个通道。
'第一类型通道'意思是指一种特定类型的通道，该通道的特征是其深 度和宽度的尺寸范围是从lMm到lmm。这样的通道的长度可以变化。这
种'第一类型通道'在这里指的是'微通道'。
'第二类型通道，意思是指另外一种类型的通道，该通道的特征是有更 小的尺寸，即其深度和宽度的尺寸范围是从lnm到2000nm。再者，这样
是通道的长度也可以变化。这种'第二类型通道'在这里有时指的是'纳米 通道，。'第一类型'和'第二类型'通道相互可是流体相连的。
在这里使用的术语'所述第二类型通道被嵌在所述第一类型通道里'， 意思是指一个空间布局，这里第二类型通道完全被所述第一通道包住。
在这里使用的'分析物处理或释放区域'意思是指在该区域里，第一类 型通道形成以流体连接到第二类型通道，以致通过该通道系统的流动路 径的截面区域从第一类型通道尺寸减少到第二类型通道尺寸。这个"分析 物处理或释放区域"在这里有时也指',纳(micro-tonano)的转变或收縮'。
在这个分析物处理或释放区域里，通常将其上结合有分析物的载体颗粒 固定，以使该分析物可以被释放和/或进一步处理。通常，这样的进一步 处理在分析物仍然结合在载体颗粒上或分析物在所述第二类型通道(纳 米通道)中时就会发生。优选地，这个分析物处理或释放区域具有'锥形
结构'，并且流动路径的截面区域的减少或者以间断的梯级或者以连续的 形式实现。在优选实施方案中，第一类型通道深度和宽度至少是所述载
体颗粒的尺寸的5倍。这已经被证明在避免载体颗粒的堵塞和聚集时取 得了特别好的结果。同样，第二类型通道的尺寸与载体颗粒的尺寸一样 或比载体颗粒的尺寸小，以致防止载体颗粒进入第二类型通道。然而， 被结合在载体颗粒上的分析物可以进入所述第二类型通道，并且，可以 继续发生下一步骤例如化学处理。
这里关于通道系统使用的术语'锥形结构'意思是指一个特定情况，其 中通道宽度/直径/截面从第一类型通道减少到第二类型通道。这样的减少 可以是逐渐的或可以是以梯级的形式。这样的锥形结构可以使用上述的 蚀刻和沉积技术以及其他光刻技术，通过在模板上产生适当的这样锥形 的负象来获得。
对本领域技术人员来讲，也很清楚在所述第一类型通道范围内的流动模式
会由于引入'阻碍结构'穀膨响，例如断^^的(部分)壁、正方形、长方 形、圆形的物质被鹏所述第一鄉鹏的流动路径。
在优选实施方案中，通道系统的表面，，第一，Mit^二类型通道 或两者的表面，可以M将通道表面暴露于气相，化合物而改变。发明者已
经发现这会减少表面上分析物的非特异性吸附。3!51^样的改变，通道的表面 可以，适度的疏水，与水的接触角大约为60°。优选的气相沉积，例如在气相 中硅烷化，能确保第二类型通道(纳糊道)表面也被改变。在特别雌的实 施方案中，硅烷化合物具有甲基基团，该基团大大减少了在表面上分析物例如 核酸的非特异性吸附，同时避免了双链核酸的固定(不希望的)。
也可能改变通道的表面的液相沉积，是不雌的，因为经常在纳米级的范 围内它不接3ffil道系统的特性，并且通常它依靠有机翻IJ的存在(形 相)， 有机溶剂与大多数根据本发明将要被用于基底的聚合物例如聚二甲基硅氧烷 (PDMS)不相容。
使用根据本发明的设备可以预浓缩分析物，以便接下，过根据本发明的 检测器来检测。因此，可以提高检测器的灵鹏，并且提高检测器的检测限。
所述分析物的检测ffl31许多装置，行，最明显的是生物孔蛋白、Ai^纳 米孔、纳隙传感器，电化学传感器。
这些传感器的读出,用电的。就生物孔蛋白或A3t纳米子L^讲，将一个 电压横加于孔上(如附图5a所示)。所施加的电势驱动离子电Mil该孔，并 且像DNA^Sff变酶之类的物体ilii该孔，离子电流^>片刻(例如Akeson 等人，Me决o必jbr c/wracteriz/"g cft/p/ex "wc/e/c ac/dwo/ea//es,专禾!j U S 6936433 B 2 ， 2005; experimentally shown for DNA bases by Y Astier, O. Braha^ and H. Bayley, 7bwm/M /ecw/e 納we"c/"g: Z)/w"她"峭ca"ow <
5""g/"e^i2af尸rate/" A^fwo/ oAi 五(7w&pec/vw说a A/o/ecw/ary4db/7fe/;丄Am. Chem. Soc., 128(5), pp, 1705-1710,(2006))。
就纳隙传繊来讲，分子舰一个1 3nm宽的电极缝隙。已经出版的观 点预测流过1 3nm的隧道电流能被正在转变分子的独特介电性质所调整 (theoretically predicted by J. Lagerqvist M. Zwolak^ M. Di Ventre "Fast DNA Sequencing via Transverse Electronic Transport", Nano Lett. 6 (4) (2006) 779-782; M. Zwol成M. Di Ventre "Electronic Signature of DNA Nucleotides via Transverse Transport", Nano Lett. 5 (3) (2005) 421>424)。
可以用来实现^^^道系统内运,体颗粒的溶剂可以是水、水溶液、 有机鋭,如乙醇、丙醇及其混，、有机翻IJ与水的混合物等等。
根据本发明的设备进一 步包括"弓I入或维持溶剂流il31所述通道系统的装 置"，禾口"将所述载体颗粒固定在所述分析物处理，放区域的體"。这些^S 通常都禾拥电或磁场或电磁场或者仅运用流体动力。最简单地来讲，这样的装 置可以是泵或者注射器，通31it用它们^^就会^E通3i31道。可选择地，这 样的装置可以是磁铁或者一组放在适当位置的电极，该位置可以是所m道系 统或所述分析物处理或释放区域内部或周围。
这里j顿的术语'施加电、磁或电磁力'意思是指应用电、磁或电磁场。流 体动力也可以通过应用压力差来施加。
分析物在载体颗粒上的附着，过在所述载体颗粒上的分析物结合基团和 所述分析物上相应的载体颗粒结合基团之间获得的链接来实现的。
单位载体颗粒上分析物的数量可以在O到x之间变化，这里，在优选实施 方案中，x大于或等于l ，并且x受分析物的浓度和载体表面上的特定分析物的 最大可能聚集密度所影响。分析物的数量可以皿存在的分析物浓度自动地调
整。对核酸测序例如DNA测序来讲，雌^m体上一个分析物，这可以在核
酸-载体组合步骤中M;小心调整核酸浓度而实现。然而，在其它实施方案中，x
可以大于l，例如气相检测应用。
分析物从所述载体颗粒的释放可以Sil光诱导、Mil^用电场的诱导、温 度诱导或通过化学反应的诱导来实现。同样，进一步的处理可以M3i化学g 来实现。例如，分析物通过加AiS当的化学剂或酶,可以,成更小的碎片。 更具体地，就酶隨来讲，这样的,可以MM加入适当的辅因子被引发，没 有辅因子酶还不肖跑作用。
在一个优选实施方案中，m^置可以被使用，例如用于诸如DNA之类 的核酸的测序目的，因此单核苷敏核苷酸 肯滩以在分析繊酸范围内出现 的顺序被检测。
在这个测序设备的一个实 案中，珠-核酸组件，即被固定在珠上的核酸,
在从微至纳转变中被捕获，并且固定仅仅il3i^个转变的尺寸禾n/^i3l应用电 或磁或电磁场来实现。可以使用电极施加电场。核酸的酶IW通过加入适当的 核酸外切酶的辅因子而开始，该核酸外切酶也加到反应混合物中。释放的 基团使用分子检测器在纳米通道末端检测。在一个替换型实施方案中， 核酸外切酶可以与单独的珠相连，该珠可能是用流体动力(微至纳转变)、 电、磁或电磁场在第二类型通道内被捕获。核酸进一步与珠键合，并且 也用流体动力、电、磁或电磁场被捕获。携带酶的珠和携带核酸的珠可 以有不同的尺寸。这个替换型实施方案的优点是酶和检测器之间的距离 保持常数，因为珠被固定在流路内某一位置。核酸载体珠和酶之间的距 离需要通过外部的场例如磁、电或电磁场或通过流动来控制。这个替换
型实施如图5c所示。 下面参考附图，其中
附

图1示出了用载体在临近^检测，获、运输和释放分析物的方法的
示意附图2示出了用载條临近分子检测娜获、运输和释放分析物的方法的 示意图。在这里，分析物在检测前被处衝
附图3示出了肖滩捕获单个载体的锥形的微至纳转变； 附图4示出了替换载体的示意附图5a和图5b示出了通过利用沐DNA装配体用于测序DNA的设备総， 该组合被捕获在鹏纳的收縮部位里(有或没有电场电极。DNA的酶,M: 加入辅因子幵始并且释放基团M31^ffl^f检测皿测。图5c示出了将酶固定 在载体珠表面的可选办法；
附图6示出了在玻i^面上溶液中DNA-珠装配体的荧光图像； 附图7a示出了模板制作的工艺步骤，图7b显示了所制成的模板结构在硅 片上的扫描电镜(SEM)图像，该硅片接着被用于聚二甲基硅氧烷模塑以实 现微至纳转变；
附图8显示了 16Mm似-DNA在微^it表面上的非特异性吸附减少的荧 光图像，该通道表面通过气相硅烷化用甲基三乙氧基硅垸覆盖，(a)没有硅 烷化，(b)硅烷化；
附图9显示了微至纳转变和DNA-,配体被捕获在500nm宽的Sif里。 该DNA ^TM31流,力伸皿A^米流体Sit;
附图10显示了一个DNA-麟配体加入到己经被捕获的聚集体中的荧光图
像；
附图lla和附图lib显示了用直流电场操纵所捕获的DNA的荧光图像。附 图1 lc显示了J151相反的流体动力流动进行的操纵。A显示了一个长IO脾的 标尺；
附图12显示了在750nm宽的纳^Jlil里，在H)s (上面的壁面)，tl-5min (中间的壁面)，t2-10min (较低的壁面)时，捕获的DNA用核酸外切酶降 解的荧光图像；
附图13显示了降解的DNA片断在纳米通道出口处聚集的荧光图像 (对照白圆圈，壁面1 4显示了不同的时间点)；
附图14a-c显示了在纳米通道里酶降解的结果，通道的宽度分别是 500nm、 750nm、 1萨、1.5jjm和2jjm，时间分别是t-Oh、 t=2h、 t=16h (壁
面从顶部到底部)；
附图15a和附图15b显示了更多数量的珠-DNA组合体的捕获荧光图 像，导致了在纳米通道内部较高的DNA浓度
附图16a和附图16b显示了在纳米通道内通过使用SFOI酶将靠近珠 上固定点的DNA切断的单个DNA链释放的荧光图像；
附图17显示了沿着纳米通道收縮部分的实现。
本发明通过参考下面的例子进一步进行描述，这些是试图说明而不 是限定本发明的范围。
实施例1
DNA测序
这个例子描述了如何在微流结构中^^棘乙烯珠捕获DNA舒，如何 将珠-DNA组合体运输到^ba点，如何在所希望的位置捕获它们，以及最后如何 ^^酶处理该DNA。酶)l,地释放m，该,被TO^子检测器并且被按序 分析。
附图5a/b描述了一个设备概念的实例。在捕获了被生物素酶改性的核酸链， 例如通过使用涂上一层链霉素的聚苯乙烯珠的DNA链以后，该装配体被驱动 ( 流体动力流动或电 场)i4A微流至纳流的转变结构(*斜己1)。在这 个步骤里，酶(由黑点表示)被加入到该装配体中，而酶的辅因子还不絲(标 记2)。该装配体接着被捕获，或者i!51外部和优选的不均匀电自场捕获，或 者在象鹏纳锥形转变的结构阻碍里捕获(标记3)。核酸，例如DNA,舰 ^ffl流体动力流动或者使用电场朝着检测点伸展(标记4)。 一种可能的延伸是 把其它物体(像珠、大M、蛋白质)附在核酸例如DNA的末端或支干上以进 一步支撑伸展过程。这些物体可以被磁或电场接近。
舰加入辅因子(例如Mg2"，单鹏的,和释放幵始了 (l祝5 )。带 负电荷的单碱基或者通过流体动力流动或者通过电场被朝着分子检测器驱动 (标记6)。分子检测器可以競近发表的单OT检测器，尤其像蛋白质基纳米 孔(US6936433B2)、孑L-蛋白与肝适配器的结合(YAstier等人J.Am.Chem. Soc., 128,5 (2006) 1705-1710)、 Ai^l米孔(C. Dekker， NatureN加otechnology 2 (2007) 209-215 )和纳隙基传麟(J. Lagerqvist等人Nano Lett., 6,4 (2006) 779-782; M. Zwolak and M. Di Ventra^ Nano Lett., 5， 3 (2005) 421424)。每一个鹏的信号 接着齢被纪录并EJ顿序齢被排列。
在另一个实施例中，核酸-麟配体，例如DNA-麟配術皮捕获在锥形的微 至纳收縮部，没有酶附着在DNA上。接着在核酸例如DNA伸^itA纳^l道 后，通过加入酶和辅因子Mg2+,降解步骤开始了。
附图5c显示了一个实例，其中，用于处理的酶被固定在载体颗粒表面上。
核酸,酶，例如DNA ,酶，會滩ilil生物素与抗生物素蛋白连接、 織，结合、适体结合、通娜、马来舰胺、还原的半胱氨酸、戊二醛或 硫醇的直接偶联被结合到载体珠上，优选在载体和酶之间用隔离分子来减 少载体表面上的酶降解。携带载体的酶通过电场或磁场被捕获在第二收 縮部(标记0)。优选地，酶载体珠比DNA载体珠略小。通过与上述提 到的相同过程，DNA被插入纳米通道里(标记3),并且DNA直接朝向 固定酶的位置。当DNA的末端接近酶时，如果在溶液中存在辅因子(标 记5)，并且DNA片段可以到达分子检测器(标记6),那么降解就开始 了 (标记4)。
如附图5b所示，当降解发生时，通过使用辅助电极，可能将DNA 载体珠成功地安置在离酶较近的地方。也能够想象一旦DNA附着到其中 一个酶上，DNA载体就将从酶载体上弹回，留下还未处理的DNA片段 松弛成一个环状。
当降解幵始时，DNA也可能完全从载体珠上释放(例如酶促的， 通过光、热等)。
下面描述附图5a显示的概念的实现。 附图6显示了玻璃表面上溶液中的DNA-珠装配体。 生物素化寡核苷酸与在噬菌体 i-DNA的右(一个)末端(48，502个碱 基对(bp);Sigma)的12-核苷酸悬臂(overhang)杂交。互补和重叠的寡核苷 酸(5，-GGG-CGG-CGA-CCT-3，)在5'磷酸化并且在3'进行生物素标记(从 Eurogentec购买)。入-DNA与寡核苷酸以摩尔比1:1000混合，并且在50'C 下杂交1小时，接着在16'C下在连接酶缓冲溶液(Invitrogen)中与DNA 连接酶(Invitrogen)连接过夜。没有杂交的过量低聚物通过过滤除去。 提纯的生物素改性的DNA在(C下于137mMPBS缓冲液(PH7.4)中贮存。 生物素VDNA被固定在涂有链霉抗生物素蛋白的聚苯乙烯(PS)珠 (Polyscience，Inc)上，直径为1.8)om。聚苯乙烯颗粒与DNA链的比率是 1:1000。该混和物在室温下在低体积1M PBS缓冲液中摇动72小时。该 DNA装配体在4'C下贮存在1MPBS缓冲液中。在微流体设备中使用DNA 装配体以前，该DNA按1:50比例稀释，并且用YOYO-l(Molecular Probes) 在室温下以1:2染料/bp比率(或为1:10，如果在第一试验时没有稀释)
的条件下染色1小时。
附图7a示出了模板结构(用于接下来单层基底的制作)的制作步骤，图 7b显示了一个在硅片上制成的模板结构的例子，该硅片用于PDMS模塑以制 成根据本发明具有MiI和纳米通道的基底。
(IOO)带有1000nm热生长氧化物的硅片在2000rpm用PMMA_MA 抗蚀刻剂(resist)覆盖。用50kV的电子束记录仪(ebeam writer)使从 100nm到2Mm不同宽度范围的纳米结构暴露于PMMA(步骤A)。在PMMA 显影剂显影3分钟以后，30nm厚的铬层热气化在PMMA罩上(步骤B)。 在升高(lift-off) 6 12小时后(步骤C)，使用反应性离子蚀刻设备和 CHF3/Ar气体混和物将该片蚀刻几分钟，达到蚀刻的深度在200 500nm 之间(步骤D)。在一个60秒的铬罩湿化学蚀刻步骤(步骤E)以后， SU8基于环氧基的UV抗蚀刻剂(Microresisits， Germany)以3000rpm 被旋转到该结构上(步骤F)，使抗蚀刻层的厚度大约为10拜。在65'C 下烘焙该抗蚀刻层2分钟以后，再在9(TC下烘焙5分钟，将该层暴露在 UV下22秒，在65'C下后烘1分钟，再在95'C下后烘2钟，就形成了微 通道。显影步骤在SU8显影剂(Microresisits， Germany)中进行2分钟， 接下来用异丙醇漂洗(步骤G)。最终形成的模板结构的扫描电镜的图像 如附图7b所示。
在分压大约为4毫巴下，使用(十三氟-l,l，2,2-四氢辛基)-三氯硅烷使
该模板在气相中氟代硅烷化45分钟。这层能很好的作为下面模塑步骤里
的抗粘层。
PDMS elastomer (Stygard 184, Dow Chemicals)与PDMS固化剂按 10:1比例混合，在模板上使其孔化(pored)并在65'C下固化10小时。 在从模板上释放固化的PDMS后，将PDMS片切成片。并且打出来进和 出的孑L 。该PDMS沿着玻璃载玻片在PlasmaLab 80 (Oxfordlnstruments,Germany)中活化10秒钟，条件是在70W, 120mtorrt， 氧气流量为50sccm。
在这以后，将玻璃载玻片和PDMS片对齐，并且轻轻地压在一起， 这导致了在PDMS与玻璃之间不可逆的结合。为了将电极包括在流体设 备里，微焊接的铬/金电极附着在滑动盖板上，该滑动盖板临近流体通道。
为了使电极镀在通道上，需要适当的光学校准。
为了减少DNA分子在设备表面上的非特异性吸附，给结合的设备填 充甲基三乙氧基硅烷气体，该甲基三乙氧基硅烷通过在12(TC时加热硅烷 溶液30分钟变成气相。附图8a示出了DNA分子在刚结合、未处理的玻 璃表面的吸附；然而附图8b显示了对于甲基硅垸化玻璃表面的情况在相 似的条件下吸附没有发生。
附图9显示了微到纳转变和DNA-珠装配体被捕获的例子。该DNA好伸 MiSA^)米流体通道。附图10显示了 DNA-,配体加入到已经被捕获的组合 体中。
附图lla和附图lib显示了用直流电场操纵捕获的DNA。这里，在镀铬/ 金重叠电极(微装配在滑动盖板上，该滑动盖板临近微流体结构)上的最 大直流电压是2伏特，PBS缓冲液浓度是70mM。
附图llc显示了Mii相反的流胸力流动进行的操纵。
附图12显示了在750nm宽的纳;))6iiM,在H)s, tl-5min, t2-10min时， 用核酸外切酶(Exoin)降解捕获的DNA。
在捕获一些珠-DNA装配体后，1M PBS装配缓冲、^没有辅因子Mg^ 的酶缓冲、 tt置换(NES1, New England BioLabs, New EnglancMJSA)。核酸外 切酶(New England BioLabs, New England^ USA)以1U/…浓度加入。在这个 阶段，没有降解被看见。在与酶缓冲液一起加入浓度为lOmM的镁之后， 在大约10分钟的时间里所有的X-DNA都降解了 。
附图13显示了降解的DNA片断在纳米通道出口处的聚集，分子检 测器应该安装在这个位置(对照白圆圈)。
附图17显示了平面纳米孔检测器的实现。入口显示了在铬罩里30nm 收缩部的扫描电镜图像，这也用来确定在二氧化硅模板上纳米通道结构 (附图7a中的步骤C和步骤D)。在PDMS模塑和与玻璃结合后，本发 明者能证实像这么小的收缩部能被运输到PDMS结构内，并且仍可以用 含有FITC染料的水溶液填充(附图n)。在这个概念里，由可移动的物 体形成的收縮部的暂时堵塞能通过监测通过收縮部的离子电流来测量。
这些步骤以后，用过的和空载的载体珠能从微纳转变中被释放，该 释放是通过例如应用电、磁场、机械振荡或者通过反向流体动力流动实 现的(附图llc)。
实施例2
结构尺寸对酶活性的影响
本发明者已经观察到DNA降解过程看起来在较宽通道里比在非常 狭窄的通道里更有效。附图14a-c显示了使用Xba酶(New England BioLabs， New England, USA)对捕获的DNA分子的DNA降解实验的结果。附图14a 显示了在t=0时的情况，接着在加入Xba I以后，在大约中心位置 (24508bp)裂解了 i-DNA。能够很清楚的看到，2小时以后，在较宽通 道(即大于lMm)内(图14b)，降解进行的很好，而在狭窄的通道(小 于或等于l^im)里，几乎没有发生变化。附图14c显示了 16小时以后的 情况，在这里几乎所有的DNA链都显示了同样的长度，这说明狭窄通道 内降解活性相当低。显然，Xbal抗空间限制更敏感。
本发明者重复观察到在狭窄通道里的DNA分子在酶降解步骤后仍 然很长，并断定对通道尺寸的细心结构控制对调整酶活性有用。
实施例3
在液相中分子预浓縮和运输到检测点
在这个实施例中，我们证明了通过在临近从,纳转变处捕获超过一 个的载体，DNA分子的浓度可以局部升高。附图15a显示了仅仅一些在 微到纳转变处捕获的珠-DNA装配体，引起了在纳米通道里一定的荧光强 度。附图15b显示了一会以后的同一通道。更多的珠被捕获，导致了局 部更高的DNA浓度，这从更强的荧光可以得出。
实施例4
通过使用酶从珠上释放分析物(DNA)
在这个实施例中，本发明者证明了在珠-DNA组合体在临近从微至纳 转变处被捕获后DNA分子的完全释放。这里，使用Sfol酶(NewEngland BioLabs，NewEngl肌(UJSA),该酶在靠近珠的固定点处切幵了X-DNA。附 图16a显示了初始捕获的珠-DNA装配体，附图16b显示了在如箭头所标 记的通道里DNA链的酶引发的释放后相同的位置。
在说明书、权利要求和/或附图中公开的本发明的特征可以是分别的 和其中任意结合的，以其不同形式用于理解本发明的材料。
权利要求
1、一种用于处理分析物的设备，其包括基底，所述基底是单片材料并且包含通道系统，所述通道系统具有至少一个第一类型通道，所述第一类型通道的尺寸是深度和宽度为1μm到1mm，至少一个第二类型通道，所述第二类型通道与所述第一类型通道是流体相连的，所述第二类型通道的深度和宽度为1nm到2000nm，所述第一类型通道流入所述第二类型通道，分析物处理或释放区域，所述区域形成在所述第一类型通道流入所述第二类型通道的位置，以及与所述第二类型通道是流体相连的的检测器，所述检测器与所述分析物处理或释放区域相隔开。
2、 根据权利要求1的设备，所述基底不是复合基底。
3、 根据权利要求1 2任一权利要求的设备，进一步包括冑辦结合分析物 的载体颗粒，以及能够在所述第一类型iiii内运输所述载体颗粒的在所m道 系统内的，ij。
4、 根据权利要求3的设备，其中所述载体颗粒的尺寸为O.lnm到l鹏的， i^为100nm至ij5Mm。
5、 根据权利要求1 4任一权禾腰求的设备，其中所述第一鄉通道的尺 寸是所述载体颗粒尺寸的至少5倍宽和深。
6、 根据前述任何一权利要求的设备，其中所述第一类型鹏的尺寸是深度 为10拜到20拜，宽度为10拜到200拜，并^g^f述载体颗粒的尺寸是在小于 或等于2^m的范围内。
7、 根据前述任一项权禾腰求的设备，其中所述分析物鹏或释放区域有锥 形结构，其中所述通道系统的横截面从所述第一，通道到所述第二类型皿 以不连续梯度或连续地减小。
8、 根据前述任一项权禾腰求的设备，其中所述第二鄉鹏的尺寸是深度 和宽度为100nm到800nm。
9、 根据权禾腰求1 7任一权利要求的设备，其中所述第二鄉通道的尺 寸范围是从大于lMm到2拜。
10、 根据前述任一项权利要求的设备，其中所述第一，通道另外还包括 阻碍结构，所述阻碍结构在所述第一鄉通道中防止物质例如翻卿载体颗粒 的未阻碍流动。
11、 根据权利要求10的设备，其中所述阻碍结构是被^i^f述第一，通 道中的正方形、三角形、圆形物质。
12、 根据权禾腰求3 11任一权利要求的设备，其中所述载体颗粒是球形 的、立方体形的、平行皿或不规则形状。
13、 根据前述任一项权利要求的设备，其中所述第一类型通道的长度为 lmm到10cm，并且所述第二^通道的长度为lnm到lmm，优选为100nm到 100,
14、 根据前述任一项权利要求的设备，其中所述检测器与所述分析物处理 区域有一距离，所淑巨离为lnm至ij 1000Mm， 1M为5nm至iJlMm。
15、 根据前述任一项权利要求的设备，其中戶，检测器选自生物孔蛋白、 人造纳米孔、纳隙传感器、电化学传感器、光谱传感器、质谱传感器、拉曼光 谱传 和FTIR光谱传繊。
16、 根据前述任一项权禾腰求的设备，其进一步包括引A!P/或维持翻诉口 载体颗粒Mil^^I3I系统流动的装置。
17、 根据权利要求16的设备，其中所述引A^卩/或维持流动的装置在所述 、歸诉卩/^^ 述载体颗粒上施加电力、磁力、电磁力或流体动力。
18、 根据前述任一项权利要求的设备，其进一步包括^E^述分析物处理或 释放区域固定所述载体颗粒的装置。
19、 根据权利要求18的设备，其中戶脱固定體^^f述翻诉卩/^^述载 体颗粒上施加电力、磁力、电磁力或流胸力。
20、 根据前述任一项权利要求的设备，其中所述基底是由选自硅、二氧化 硅、玻璃、聚合物例如PDMS、聚碳酸酯、PE、硅敏的材料制成的，并且所 述鹏系统是通过电子束记录术、蚀刻术、模塑、聚焦离子束蚀刻术、激光 烧蚀术、压花制成的。
21、 根据权利要求20的设备，其中所述基底是由聚合物或聚合物组合 制成的，并且所述基底是使用模板通过模塑或压花所述聚合物形成单片材料，^;;f述模板里，提供了所舰縣统的负象。
22、 根据权禾腰求3 21任一权利要求的设备，其中所述载体颗粒是由选 自二氧化硅、三氧化二铝，金属性的禾P/或有磁性的材料例如Au、 Ag、 Pd、 Pt、 Al、 Ti、 Fe、 Ni，陶瓷和聚，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯、 聚四氟乙烯、三聚鄉、聚交酯、葡聚糖的材料制成的。
23、 根据权利要求3 22任一项的设备，其中所述载体颗粒进一步包括分 析物结合基团，所述基团与所述分析物上的相应载体颗粒结合基团相互作用。
24、 根据权利要求23的设备，其中一对分析银结合基团和相应的载体颗 粒结合基团选自生物素/(链霉)抗生物素蛋白、抗像抗原、皿醇变体、像His6、 凝集素/糖、谷胱甘肽/谷胱甘肽-S-转移酶，NH2/COOH/环氧基共价键合、 以高亲合力结合来自各种物种的不同种类和子类免疫球蛋白的Fe片段的 蛋白A、G，氢键，或基于DNA碱基杂交、适体结合例如蛋白质-DNA/RNA 相互作用、胶原/胶原结合蛋白，Dig/抗洋地黄毒苷，或者基于激素结合， 或者基于其它静电、离子和/或共价相互作用。
25、 根据前述任一项权利要求的设备，其中所^Mit系统^^3^I道的表 面被修饰，所述修饰^I过应用化学物质以减少分析物在表面上的非特异性吸 附而实现的。
26、 根据权利要求25的设备，其中所銜,JM31液相沉积或气相沉积， i^气相沉积，更,皿的气相沉积来实现的。
27、 根据权利要求25 26任一项的设备，其中所^1道的所述表面选自聚 合物例如PDMS和二氧化硅。
28、 根据权利要求27的设备，其中所述修饰;1JM;将所述表面暴露于具有 化学端基例如甲基、氨基、氟或硫醇基的硅烷化合物或将疏水基团暴露于 所述通道表面的其它种类分子来实现的。
29、 根据前述任一项权禾腰求的设备，其进一步包括柳述分析物鹏或 释放区域A^f述载体颗粒释^^述分析物的^S。
30、 根据权利要求29的设备，其中释^^f述分析物的装置基于所述分析 物从所述载体颗粒的光诱导释放、电场诱导释放、MJS诱导释放、化学反应 或生化反应例如与辅因子的生化反应、酶介导诱导的释放，来实施这样的 释放。
31、 根据前述任一项权利要求的设备，其进一步包括il31化学反应例如裂 解成更小的片段或结构单元，而进一步^H所述分析物的装置。
32、 根据权利要求31的设备，其中所^iii化学反应进一步处a^述分析物的装置是载体珠，在所述载体珠上固定有化学剂，皿酶。
33、 根据前述任一项权利要求的设备，其中所述分析物选自核酸例如单链、 双链DNA、 RNA、蛋白质、多肽、药物以及在环境剝牛下是气态g^态的其他、生物学或环境上有害的^F。
34、 一种处理和/或检测分析物的方法，所述方法包括以下步骤 —将分析物结合在如权利要求3 33任一项所述的载体颗粒上，—通过权利要求1 33任一项的设备的所^lit系统，将所述载体颗粒和结合到其上的分析物运输到所述设备的戶;M分析物处理^放区域上， 一将所述载体颗粒和结合到其上的分析物固定在戶;M分析物处理，放区域上，—通过应用光、电场、磁场、电磁场、热或冷，^!3i实施化学或生舰 解反应例如1顿酶，如核酸酶、蛋白酶例如ExoI、 Exoffl、 Sfol、 Xbal和其它 限制酶的化学或生倾解反应，A^万述载体颗粒上释^M述分析物，和/^1^行化学或生^^反应例如{顿酶，如核酸酶、蛋白,i洳Exo I、 Exoffl、 Sfol、 Xba I和其它P艮制酶的化学或生^f反应，来^bSI^述分析 物，—将所述释放的分析物激; 述处理过的分析物^0f述释aa处理过的分析 物运输到所述检测器上H顿权禾腰求1 33任一项所述的检测器检测戶服释放的分析物^^f述处理过的分析物^^述释放且，过的分析物。
35、 根据权利要求34的方法，所述方法进一步包括在所述分析物已经被释 放和/或处理后从所述分析物处理，放区域去除所述载体颗粒的步骤。
36、 根据权利要求34 35任一项的方法，其中所述的运输步骤和所述去除 步骤是利用权利要求16 33任一项所述的引A!P/或维持總卿载体颗粒的流 动的装置^行的。
37、 根据权利要求34 36任一项的方法，其中m^固定步骤Jiil31所述分 析物鹏離放区域的尺寸^1权禾腰求18 33任一项戶脱的所述固定所述载体颗粒的^g,或者M;二者的组合来实现的。
38、 根据权利要求34 37任一项的方法，其中j顿所述检测器的检澳涉骤 是通过光学检测、化学检测、电检测、磁检测、电化学检测来实现的。
39、 根据权利要求34 38任一项的方法，其中所述分析物是核酸，所述处理分析物的步骤是所述核酸的,降解，所述检测所述处理过的分析物的步骤 包括单核苷酸或核苷酸碱基的检测，以说明所述核酸的序列。
40、 根据权利要求39的方法，其中所述,隨Jiilil将载体珠加入到所 ^Mit系统中来实现的，^^ ^Mit上，固定有用于 的载体繊。
41、 一种制造权禾腰求1 33任一项的设备的方法，所述方魏括以下步骤—提供模板，所述模版具有权利要求1 33任一项所述的所^Mit系统的负象，一使用所述模板和聚合物材料或适合形成聚合物的材料来模塑或压花所 述基底，从而获得所述作为单片材料的基底，所述基底包括所述通道系统。
42、 根据权利要求41的方法，所述方法进一步包括以下步骤 一用平板例如玻璃板，覆盖所述通道系统。
43、 根据权利要求41 42任一项的方法，其中所述模板的所述通道系统 的负象是通过选自电子束记录术、蚀刻术、离子束蚀刻术、激光烧蚀术、 光刻技术和这些技术的组合的方法形成的。
全文摘要
本发明涉及用来处理分析物的设备及其使用方法。所述设备包括包含通道系统的基底，所述通道系统具有至少一个第一类型通道和至少一个第二类型通道；分析物处理或释放区域；以及与所述第二类型通道是流体相连的的检测器。
文档编号C12Q1/00GK101393090SQ200810210378
公开日2009年3月25日 申请日期2008年6月23日 优先权日2007年6月22日
发明者C·巴斯奎因, I·霍斯帕克, O·哈尼克, 安田章夫 申请人:索尼德国有限责任公司