专利名称：还原酶、其基因及其利用方法
技术领域：
本发明涉及新型还原酶和编码该还原酶的DNA、包含该DNA的重组 载体、和用该重组栽体进行转化的转化体等。本发明还涉及使用新型还原 酶或该转化体的作为光学活性醇的光学活性苯乙醇酸化合物的制造方法。
背景技术：
光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物是在医农药等的制造中有用的 化合物，迄今为止提出了使用不对称还原试剂的制造方法等，在国际公开 号WO0210101号记载的方法中，为了提高光学纯度而在>^应后进一步进 行再结晶等，在有机快报(Organic Letters), 2005，第7巻，24号，5425-5427 页中记栽的反应中，反应的光学收率也未必可以称为充分。另外，迄今为 止还不知道使用微生物等将邻位上具有取代基的立体上处于复杂环境的 苯乙醛酸化合物的酮基还原，从而不对称还原为光学活性的苯乙醇酸化合 物的方法。
发明内容
本发明提供以良好的光学收率将邻位上具有取代基的苯乙醛酸化合物 还原为光学活性的苯乙醇酸化合物的方法。
更具体而言，本发明提供能够将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还 原、以良好的光学收率制造光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的蛋白 质、编码该蛋白质的DNA(以下，简称为本发明DNA)、包含该DNA的转 化体、从该DNA制造该蛋白质的方法以及使用该蛋白质对邻位取代的苯 乙醛酸化合物进行不对称还原从而制造对应的光学活性的邻位取代的苯 乙醇酸化合物的方法。
即，本发明提供如下所述等，即
1.由下述的任何;^^序列构成的DNA:
a)对用序列编号1表示的Jl^酸序列进行编码的M序列；和b)用序列编号2表示的磁Jjf列。
2. —种DNA，其特征在于，通过将能够在宿主细胞内发挥功能的启动子与具有下述a) d)中的任何^^^序列的DNA以能够发挥功能的形式连接而形成
a) 对用序列编号1表示的JL^酸序列进行编码的磁基序列；
b) 相对于由编码序列编号1所示的M酸序列的磁J^序列构成的DNA具有至少卯％序列同源性的DNA的M序列，并且是对如下所述蛋白质的氨基酸序列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；
c) 在严;fMHf下与由编码序列编号1所示的JtJ^酸序列的M序列构成的DNA杂交的DNA的g序列，并且是对如下所述蛋白质的氨基酸序列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和
d) 用序列编号2表示的磁基序列。
3. —种重组载体，其特征在于，包含上述第1或2项所述的DNA。
4. 一种转化体，其特征在于，通过将上述第2项所述的DNA或上述第3项所述的重组载体导入宿主细胞而形成。
5. 根据上述第4项所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为微生物。
6. 根据上述第4项所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌。
7. —种转化体，其特征在于，包含具有下述的任何^序列的DNA:
a) 对用序列编号1表示的M酸序列进行编码的a序列；
b) 相对于由编码序列编号1所示的M酸序列的磁Jjf列构成的DNA具有至少卯％序列同源性的DNA的M序列，并且是对如下所述蛋白质的Jl&酸序列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；
c) 在严^H^下与由编码序列编号1所示的M酸序列的磁基序列构成的DNA杂交的DNA的M序列，并且是对如下所述蛋白质的^J^^列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙眵酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和
8d)用序列编号2表示的碱J^序列。
8. —种转化体的制造方法，其特征在于，包括将上述第3项所述的重组载体导入宿主细胞的步骤。
9. 一种蛋白质，具有下述的任何M酸序列
a) 用序列编号l表示的M酸序列；和
b) 用序列编号1表示的M酸序列中缺失或附加1个或多个氨基酸的M酸序列，并且是由具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力的蛋白质的JL^酸序列构成的JLi^列。
10. —种重组载体，其特征在于，包含1)由下述&)~3)中的任何>1*^序列构成的DNA和ii)具有对如下所述蛋白质的M酸序列进行编码的^序列的DNA，所述蛋白质具有将氧化型P-烟酖胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型p-烟酰胺腺噪呤二核普酸磷酸转换为还原型的能力
a) 对用序列编号1表示的JL^酸序列进行编码的M序列；
b) 相对于由对序列编号1所示的JL^酸序列进行编码的磁基序列构成的DNA具有至少90%序列同源性的DNA的碱J^序列，并且是对如下所述蛋白质的M酸序列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；
c) 在严;^件下与由编码序列编号1所示的M酸序列的磁基序列构成的DNA杂交的DNA的M序列，并Jol对如下所述蛋白质的^^^列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和
d) 用序列编号2表示的磁Jjf列。
11. 根据上述第10项所述的重组载体，其特征在于，具有将氧化型p-烟酰胺腺噪呤二核普酸或氧化型l3-烟酖胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力的蛋白质，为葡萄糖脱氢酶。
12. 根据上述第11项所述的重组载体，其中，具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的葡萄糖脱氢酶。
13. 将上述第10 ~ 12项所述的重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。
14. 根据上述第13项所述的转化体，其中，宿主细胞为微生物。15. 才艮据上述第13项所述的转化体，其中，宿主细胞为大肠杆菌。
16. —种转化体，其特征在于，包含由下述8)~"中的任何>^^序列
的DNA，所述蛋白质具有将氧化型|3-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型|3-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力，
a) 编码用序列编号1表示的M酸序列的磁基序列；
b) 相对于由对序列编号1所示的M酸序列进行编码的碱基序列构成的DNA具有至少90%序列同源性的DNA的磁J^序列，并且是对如下所述蛋白质的JL^,列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；
c) 在严^MHf下与由编码序列编号1所示的Jl^酸序列的4^序列构成的DNA杂交的DNA的M序列，并且是对如下所述蛋白质的M,列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和
d) 用序列编号2表示的磁基序列。
17. —种光学活性的醇化合物的制造方法，其特征在于，使上述第9项所述的蛋白质、或上述第4~7、 13~16项中任一项所述的转化体、或其处理物，与前手性g化合物接触。
18. 式(2)所示的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的制造方法，其特征在于，使式(l)所示的邻位取代的苯乙醛酸化合物，与具有将式(l)的化合物不对称还原为光学活性的式(2)的化合物的能力且由下述a) f)中的任何M^列构成的蛋白质接触，
■COR,
(1)
式(1)中，&表示可被取代的氨基或可被取代的烷氧基，R2表示可被取代的Cl國8烷基，
10<formula>formula see original document page 11</formula>(2)
式(2)中，&和R2表示与上i^目同的含义，带*标记的碳原子为不对称碳 原子，
所述M,列为
a) 用序列编号1表示的M酸序列；
b) 相对于由序列编号2所示的磁Jjf列构成的DNA具有至少卯％ DNA的序列同源性的磁基序列所编码的"ltj^酸序列；
。在严*件下与由序列编号2所示的g序列构成的DNA杂交的 DNA的磁J^序列所编码的M酸序列；
d) 用序列编号1表示的M酸序列中缺失、置换或附加1个或多个氨 基酸的Jl^酸序列；
e) 在严^Hf下与由编码序列编号1所示的^酸序列的4序列构 成的DNA杂交的DNA的4^序列所编码的M酸序列；和
f) 用序列编号l表示的JL^酸序列中缺失、置换或附加l个或多个氨 基酸的M酸序列。
19.根据上述第17项所述的制造方法，其中，所述前手性m匕合物 为式(l)所示的邻位取代苯乙醛酸化合物，所述光学活性的醇化合物为式 (2)所示的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物，
(i)
式(l)中，&表示可被取代的^J^或可被取代的烷IL^， R2表示可被取代 的Cl-8烷基，<formula>formula see original document page 12</formula>
式(2)中，Ri和R2表示与上i^目同的含义，带*标记的碳原子为手性碳原 子。
根据本发明，能够以良好的光学收率制造以(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯H^ 甲基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙跣胺为代表的、有用的光学活性的邻位取代的 苯乙醇酸化合物。
具体实施例方式
首先，对本发明DNA进行说明，本发明DNA可以是天然的DNA, 或者也可以是通过在天然的DNA中导入变异(位点定向诱变法、突变处理 等)而制成的DNA。在对天然的DNA进行检索时，以具有将邻位取代的苯 乙醛酸化合物、例如邻位取代的苯乙醛酸化合物的酖胺或酯化合物不对称 还原为对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物、具体为光学活性的 邻位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物的能力的微生物为对象即可，更具 体而言，以具有例如将2-(2-(2,5-二甲基苯氡基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙 酰胺不对称还原而产生(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氡基甲基)苯基)-N-甲基-2-羟 基乙酰胺的能力的微生物为对象即可，例如可以从野油菜黄单胞菌 (Xanthomonas campestris)IF013551菌林等归属于黄单胞菌属的微生物中 获得。本发明的DNA可以是所述天然的DNA，或者也可以是通过以下说 明的方法在所述天然的DNA中导入变异(位点定向诱变法、突变处理等) 而制成的DNA。
在本发明DNA中，"在严^ft下与由编码序列编号1所示的氨基酸 序列的减基序列构成的DNA杂交的DNA"，是指下述DNA:例如在"克 隆与序列"(cloning and sequence)(渡边格主编，杉浦昌弘编辑，1989年， M文化公司发行)等中记载的Southern杂交法中，(1)通it^高离子浓度 下[例如可以举出6xSSC(900mM的氯化钠、卯mM的柠檬酸钠)、65〔下 进行杂交，与由 码序列编号1所示的JL^酸序列的M序列构成的DNA形成DNA-DNA杂交体，(2)即使在低离子浓度下例如可以举出 0.1xSSC(15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠)]、65C下保温30分钟后， 该杂交体仍能维持。
具体而言，例如可以举出由编码序列编号1所示的JL^酸序列的M 序列构成的DNA、由编码序列编号1所示的M酸序列的磁基序列中一部 分4^S^缺失、置换或附加的碱J^序列构成的DNA、相对于由编码序列编号 1所示的#^酸序列的磁基序列构成的DNA具有至少90%序列同源性、 优选至少95%序列同源性、更优选至少99%序列同源性的DNA等。
所述DNA可以是从自然界中存在的DNA中克隆的DNA，可以是在 该克隆的DNA的碱基序列中人工导入部分碱基的缺失、置换或附加而得 到的DNA，也可以是人工合成的DNA。序列同源性可以使用例如带有 UWGCG软件包的BESTFIT程序(Devereux等(1984)，核酸研究12， 387-395页)、PILEUP或BLAST算法(Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36: 290-300; Altschul S. F.(1990) JMol Biol 215: 403-10)等序列分析用工具算 出。
本发明的DNA例如可以如下制备。
从野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)等归属于黄单胞菌属的 微生物等中，按照通常的基因工程的方法(例如，"新细胞工程实验方法"(东 京大学医科学研究所制癌研究部编，秀润公司，1993年)中记载的方法)， 制备DNA文库，以制备的DNA文库作为模板，并且使用适当的引物进行 PCR，由此能够扩增由编码序列编号1所示的JL^酸序列的磁基序列构成 的DNA、由对序列编号1所示的M酸序列中缺失、置换或附加1个或多 个氨基酸的M酸序列进行编码的g序列构成的DNA和/或具有序列编 号2所示的磁基序列的DNA等，从而制备本发明的DNA。另外，通过以 所述DNA文库作为;^板，并且4吏用具有序列编号6所示的^序列的寡 核苷酸和具有序列编号7所示的磁J^序列的寡核普酸作为引物进行PCR， 能够扩增由序列编号2所示的磁Jjf列构成的DNA,从而制备本发明的 DNA。
作为该PCR的^ff，例如可以举出下述^ft:将4种dNTP各2(HiM、 2种寡核苷酸引物各15pmo1、 Taq聚合酶1.3U及作为;^板的DNA文库混
13合而成反应液，94X:加热该反应液2分钟后，以94t:(10秒)-65"C(30秒)-72 n(卯秒)为1个循环进行10个循环，接着以94匸(10秒)-65"C(30秒)-72t: (1分钟+ 5秒/循环)为1个循环进行20个循环，再在72匸下保持7分钟。 另外，该PCR中使用的引物的5，末端侧和/或3，末端侧可以附加限制性 内切酶识别序列等。
另外，通过以所述DNA文库作为模板，^J1具有从编码序列编号1 所示的M酸序列的碱基序列中选择的部分M序列的寡核苷酸等(例如， 由编码序列编号1所示的M酸序列的5，末端侧的约14个威基以上的碱 基序列构成的寡核苷酸)和由与DNA文库构建中使用的载体的DNA插入 位点附近的g序列互补的磁基序列构成的约14个威基以上的寡核苷酸 作为引物进行PCR，由此能够扩增具有对序列编号1所示的M酸序列进 行编码的磁J^序列的DNA、具有对序列编号1所示的M酸序列中缺失、 置换或附加1个或多个M酸(优选1个M酸)的Jl^酸序列进行编码的 >5*Jjf列的DNA等，来制备本发明的DNA。
将如上所述扩增的DNA，按照"分子克隆实验室手册第二版"(1989), 冷泉港实验室出版社，"最新分子生物学实验方法汇编"(1987)，约翰'威 利父子公司，ISBNO-471-50338-X等中记载的方法克隆到载体中，能够得 到本发明的载体。作为所用的载体，具体例如可以举出pUC119(宝酒造/〉 司制)、pTV118N(宝酒造7〉司制)、pBluescript II( +、洋纺乂>司制)、 pCR2.1-TOPO(英杰公司制)、pTrc99A(法玛西亚公司制)、pKK223-3(法玛 西亚公司制)等。
另外，本发明的DNA也可以通过下述方法获得例如，以由具有从 编码序列编号1所示的JtJ^^列的磁基序列中选择的部分4^^序列的约 15个威基以上的磁-^序列构成的DNA作为探针，4吏其在后述的务ff下与 向微生物或噬菌体来源的载体中插入的DNA文库杂交，检测该探针特异 性结合的DNA，由此获得。作为使探针与染色体DNA或DNA文库杂交 的方法，例如可以举出菌落杂交或噬菌斑杂交，可以根据在文库的制作中 使用的载体的种类来选择方法。在所用文库是使用质粒载体制作而成的情 况下，可以利用菌落杂交。具体而言，通过将文库DNA导入宿主微生物， 得到转化体，对所得转化体进##释后，将该稀释物接种到琼脂培养基上， 培养到出现菌落为止。在所用的文库是使用噬菌体载体制作而成的情况下，可以利用噬菌斑杂交。具体而言，将宿主微生物和文库的噬菌体在能 够感染的条件下混合，进一步与软琼脂培养基混合后，将该混合物接种在 琼脂培养基上，培养到出现噬菌斑为止。
接着，无论在何种杂交的情况下，在进行了所述培养的琼脂培养基上 铺设膜，使转化体或噬菌体吸附、转印到该膜上。对该膜进行碱处理后，
进行中和处理，接着进行将DNA固定在该膜上的处理。更具体而言，例 如，在噬菌斑杂交的情况下，在所述琼脂培养基上铺设硝酸纤维素膜或尼 龙膜(例如，Hybond-N+(安玛西亚公司注册商标))，静置约1分钟，使噬菌 体粒子吸附、转印到膜上。接着，将该膜在碱溶液(例如1.5M氯化钠、0.5M 氢氧化钠)中浸渍约3分钟，使噬菌体粒子溶解，由此将噬菌体DNA从膜 上洗脱下来，然后在中和溶液(例如，1.5M氯化钠、0.5MTris-盐酸緩冲溶 液卩117.5)中浸渍约5分钟。接着用洗涤液(例如，0.3M氯化钠、30mM杼 檬酸、0.2MTris-盐酸緩冲液pH7.5)洗涤该膜约5分钟，然后例如通过在约 80匸下加热约卯分钟而使逸菌体DNA固定在膜上。使用如此制备的膜， 以上述DNA作为探针进行杂交。杂交例如可以按照J.Sambrook， E.F.Frisch， T.Manlatis著"分子克隆实验室手册第二版(1989)"冷泉港 实验室出版社等的记载来进行。用作探针的DNA可以是用放射性同位素 标记的DNA，也可以是用荧光色素标记的DNA。作为用放射性同位素来 标记用作探针的DNA的方法，例如可以举出通过利用随机引物标记试剂 盒(Random Primer Labeling Kit)(宝酒造公司制)等将PCR反应液中的 dCTP替换为(a-32p)dCTP，以用作探针的DNA为模板进行PCR的方法。 另外，在使用荧光色素来标记用作探针的DNA的情况下，例如可以使用 安玛西亚制造的ECL核酸直接标记和检测系统等。
杂交例如可以如下进行。按照相对于1 112如上制作的膜为50 ~200^1 的比例准备预杂交液，所述预杂交液含有450 卯0mM氯化钠及45 ~ 卯mM柠檬酸钠、0.1 ~ 1.0重量。/。浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)、 0~ 200nl/ml浓度的变性非特异DNA，根据情况还可以含有白蛋白、Ficoll、 聚乙烯基吡咯烷酮等各O ~ 0.2重量％浓度，所述预杂交液优选含有900mM 氯化钠、卯mM梓檬酸钠、1.0重量。/。SDS及100pl/ml变性小牛胸腺DNA， 将所述膜浸渍在该预杂交液中，在42 651C保温1~4小时。接着，将例 如含有450 ~卯OmM氯化钠及45 ~卯mM柠檬酸钠、0.1 ~ 1.0重量％浓度 的SDS、 0 ~ 200吗/ml浓度的变性非特异DNA以及根据情况可以含有的白
15蛋白、Ficoll、聚乙烯基吡咯烷酮等各0~0.2重量％浓度的杂交溶液(优选 含有卯OmM氯化钠、卯mM柠檬酸钠、1.0重量。/。SDS及100吗/ml变性 小牛胸腺DNA的杂交溶液)，与通过前述方法制备而得的探针(相当于lcm2 膜为1.0 x 104 ~ 2.0 x 106cpm的量)混合而得到溶液，按照相对于1 112膜为 50 ~ 200^11的比例准备上述溶液，将膜浸渍于该杂交溶液中，在42 651C 保温12 ~ 20小时。该杂交后，将膜取出，用含有15 ~ 300mM氯化钠、1.5 ~ 30mM柠檬酸钠及0.1 ~ 1.0重量％的SDS等的42 ~ 65匸的洗涤液(优选含 有15mM氯化钠、1.5mM杼檬酸钠及1.0重量％的SDS的65匸的洗涤液) 等进行洗涤。洗涤过的膜用2xSSC(300mM氯化钠、30mM柠檬酸钠)轻轻 冲洗后，进行干燥。对该膜进行例如放射自显影等，检测膜上的探针的位 置，由此在原来的琼脂培养基上确定与所用探针杂交的DNA的膜上位置 所对应的克隆，通过对其进行挑菌，分离出具有该DNA的克隆。对如此 得到的克隆进行培养，从得到的培养菌体能够制备本发明的DNA。按照"分 子克隆实验室手册第二版"(1989)，冷泉港实验室出版社，"最新分子 生物学实验方法汇编"(1987),约翰'威利父子公司，ISBNO-471-50338-X 等中记载的方法，将如上所述制备的DNA克隆到栽体中，能够得到本发 明的重组载体。作为使用的载体，具体而言，例如可以举出pUC119(宝酒 造公司制)、pTV118N(宝酒造公司制)、pBluescriptII(东洋纺公司制)、 pCR2.1-TOPO(英杰公司制)、pTrc99A(法玛西亚公司制)、pKK223-3(法玛 西亚公司制)等。另外，所述DNA的^Jjf列可以通过F.Sanger 、 S.Nicklen、 A.R.Coulson著，美国国家科学院院刊(1977)74: 5463-5467页等中记载的 双脱氧终止法(dideoxy terminator method)等进行分析。^J^序列分析 用试样的制备可以使用例如珀金埃尔默公司的ABI PRISM荧光标记终止 物循环测序反应试剂盒等市售的试剂。
如上操作得到的DNA编码的是如下所述的蛋白质的M酸序列，所 述蛋白质具有具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物(例如，2-(2-(2，5-二甲基 苯氧基曱基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)不对称还原而产生光学活性的邻 位取代的苯乙醇酸化合物(例如，(R)隱2-(2画(2,5画二甲基苯ft^曱基)苯基)國N誦 甲基-2-幾基乙酰胺)的能力，这一结果的确认例如可以如下进行。首先，将 如上操作得到的DNA如后所述按照与能在宿主细胞中发挥功能的启动子 的下游连接的方式插入栽体中，将该载体导入宿主细胞中而获得转化体。 接着，使该转化体的培养物与邻位取代的笨乙醛酸化合物(例如，2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)作用。对反应生成物中光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物(例如，(R)-2-(2-(2，5-二曱基苯氧基甲 基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺)的量进行分析，由此能够确认所得DNA编 码的是具有所述能力的蛋白质的Jl^酸序列。
为了使本发明DNA在宿主细胞中表达，例如将能在宿主细胞中发挥 功能的启动子与本发明DNA以能发挥功能的形式连接而成的DNA导入宿 主细胞中。此处，"以能发挥功能的形式"是指在通过将该DNA导入宿 主细胞中来使宿主细胞转化时，本发明DNA处于与启动子结合以便在启 动子的调控下进行表达的状态。作为启动子，可以举出大肠杆菌的乳糖操 纵子的启动子、大肠杆菌的色氨酸操纵子的启动子、或者tac启动子或trc 启动子等能够在大肠杆菌内发挥功能的合成启动子等，也可以利用在野油 菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)中对本发明DNA的表达进g控的 启动子。
一般而言，将以能发挥功能的形式与能在宿主细胞中发挥功能的启动 子连接而成的DNA插入到前述的栽体中而得到重组载体，将所得的重组 载体导入宿主细胞中。另外，作为载体，使用含有筛选标记基因(例如，卡 那霉素抗性基因、新霉素抗性基因等赋予抗生素抗性的基因等)的载体时，
择。作为导入以能发挥功能的形式与能在宿主细胞中发挥功能的启动子连 接而成的本发明DNA、或本发明重组载体等的宿主细胞，例如可以举出归 属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、棒状杆菌 (Corynebacterium )属、葡萄球菌 (Staphylococcus )属、链霉菌 (Streptomyces )属、酵母菌 (Saccharomyces )属、克鲁维酵母 (Kluyveromyces )属、毕赤酵母(Pichia)属、红球菌(Rhodococcus ) 属及曲霉(Aspergillus)属的微生物等。
将以能发挥功能的形式与能在宿主细胞中发挥功能的启动子连接而成 的本发明DNA或本发明重组栽体等导入宿主细胞的方法，根据所用的宿 主细胞采用通常使用的导入方法即可，例如可以举出"分子克隆实验 室手册第二版"(1989)，冷泉港实验室出版社，"最新分子生物学实验方 法汇编，，(1987)，约翰.威利父子公司，ISBNO-471-50338-X等中记载的氯 化钾法、或"电穿孔法基因脉冲/;tM杆菌脉冲系统"伯乐实验室，(1993) 等中记载的电穿孔法等。要筛选导入有以能发挥功能的形式与能在宿主细 胞中发挥功能的启动子连接而成的本发明DNA或本发明重组载体等的转
17化体，例如以前述的栽体中所含的筛选标记基因的表型作为指标进行筛选
即可。该转化体含有本发明DNA这一点，可以通过例如按照"分子克隆 实验室手册第二版"(1989)，冷泉港实验室出版社等中记栽的通常的方法 进行限制性内切酶酶切位点的确认、碱基序列的分析、Southern杂交、 Western杂交等来确认。
下面对本发明蛋白质进行说明。
本发明蛋白质，例如可以通过对包含本发明DNA的转化体进行培养 来制造。作为用于培养该转化体的培养基，例如可以使用在微生物等宿主 细胞的培养中通常使用的适当含有碳源、氮源、有机盐、无机盐等的各种 培养基。作为碳源，例如可以举出葡萄糖、糊精、蔗糖等糖类、甘油等糖 醇、富马酸、柠檬酸、丙酮酸等有机酸、动物油、植物油及糖蜜。关于这 些碳源在培养基中的添加量，相对于培养液通常为约0.1~30%(w/v)。作 为氮源，例如可以举出肉提取物、蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、大 豆粉、玉米浆(Corn Steep Liquor)、棉##、千燥酵母、S^白M酸等 天然有机氮源、氨基酸类、硝酸钠等无机酸的铵盐、氯化铵、硫酸铵、磷 酸铵等无机酸的铵盐、富马酸铵、柠檬酸铵等有机酸的铵盐及尿素。其中， 有机酸的铵盐、天然有机氮源、氨基酸类等在多数情况下也可以作为碳源 使用。关于这些氮源在培养基中的添加量，相对于培养液通常为约0.1 ~ 30%(w/v)。
作为有机盐或无机盐，例如可以举出钾、钠、镁、铁、锰、钴、锌等 的氯化物、硫酸盐、乙酸盐、碳酸盐及磷酸盐。具体而言，例如可以举出 氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、 乙酸钠、碳酸钩、磷酸二氢钾及磷酸氢二钾。关于这些有机盐和/或无机盐 在培养基中的添加量，相对于培养液通常为约0.0001 ~5%(w/v)。
进而，在导入有tac启动子、trc启动子及lac启动子等异乳糖诱导型 的启动子与本发明DNA以能发挥功能的形式连接而成的基因而得的转化 体的情况下，作为用于诱导本发明蛋白质产生的诱导剂，例如也可以在培 养基中少量添加异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)。
含有本发明DNA的转化体的培养，可以按照在微生物等宿主细胞的 培养中通常使用的方法来进行，例如可以举出试管振荡式培养、往返式振 荡培养、摇瓶(JarFermenter)培养、酵罐培养等液体培养及固体培养。
18培养温度可以在该转化体能够生长的范围内适当改变，通常为约15 ~ 40X:。培养基的pH优选为约6 8的范围。培养时间因培养条件而异，通 常优选为约1天~约5天。
作为从含有本发明DNA的转化体的培养物中纯化本发明蛋白质的方 法，可以应用在通常的蛋白质纯化中使用的方法，例如可以举出如下方法。 首先，通过离心分离等从转化体的培养物中收集细胞后，通过超声波处理、 dino mill处理、弗氏压碎处理等物理破碎法或者使用表面活性剂或溶菌酶 等的化学破碎法等将其破碎。通过离心分离、膜滤器过滤等从所得破碎液 中除去杂质，由此制备无细胞抽提液，适当使用阳离子交换层析、阴离子 交换层析、疏7jC层析、凝胶过滤层析、金属螯合层析等分离纯化方法将其 分为不同组分，由此能够纯化本发明蛋白质。
作为层析中使用的载体，例如可以举出导入了羧曱(CM)基、二乙基氨 基乙基(DEAE)、苯基或丁基的纤维素、糊精或琼脂糖等不溶性高分子载体。 也可以使用市售的填充完载体的层析柱，作为所述市售的填充完载体的层 析柱，例如可以举出Q-Sepharose FF、 Phenyl-S印harose HP(商品名，均 为安发玛西亚生物技^^>司制)、TSK-gel G3000SW(商品名，东曹公司制) 等。
另外，要筛选含有本发明蛋白质的组分，以将邻位取代的苯乙醛酸化 合物(例如，2-(2-(2,5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)不对 称还原而优先产生光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物(例如， (R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺)的能力作为 指标进行筛选即可。
对式(l)的邻位取代苯乙醛酸化合物及式(2)的邻位取代苯乙醇酸化合 物中的&进行如下说明。
作为&所示的可被取代的氛基，除了M之外，例如可以例示甲基氨 基、乙基M、丙基M、异丙基M、 丁基M、异丁基M、叔丁基 氨基、戊基氨基、己基JL^等Cl-6烷基M。另外，作为可被取代的烷 例如可以举出甲M、乙M、丙fL&、异丙lL^、 丁lL^、戊氧 基、己氧基、庚氧基和辛氧基等Cl-8烷氧基。
下面，对R2所示的取^RJ^进行如下说明。
作为R2所示的可被取代的Cl-8烷基中的Cl-8烷基，例如可以例示甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基等。
作为所述Cl-8烷基的取M，可以例示可^L取代的烷H基和可^L取代
的芳IL^。
作为R2所示的可被取代的烷lL^烷基，例如可以例示甲氡基曱基、甲 IL^乙基、甲緣丙基、甲猛丁基、甲緣戊基、甲猛己基、甲猛 庚基、甲lL^辛基、乙絲曱基、乙緣乙基、乙猛丙基、乙猛丁基、
乙SJ^戊基、乙Il^己基、乙IL^庚基、乙IL^辛基、丙猛甲基、丙氧 基乙基、丙IL^丙基、丙狄丁基、丙猛戊基、丙IL^己基、丙IL^庚 基、丙氧基辛基、丁氧基甲基、丁氧基乙基、丁氧基丙基、丁氧基丁基、
丁lL&戊基、丁氧基己基、丁SJ^庚基、丁氧基辛基等由Cl-4烷^L&取 代的Cl-8烷基。
作为可被取代的芳氡基，可以例示式(3)所示的芳氡基。
(式中、A、 B和C相同或相互不同，表示氢原子、烷基、烯基、炔基、 环U、环烯基、烷lL^、卣代烷基、羟基烷基、烷IU^烷基、M^、 烷基M烷基、卤原子、硝基、IL^、可被烷^J^代的芳烷基、可被选 自卣原子和烷IL^的取代g代的芳基、烷M基、M、烷基M)
对式(3)中的A、 B或C所示的取4^进行如下说明。
作为烷基，例如可以例示甲基、乙基、丙基、丁基等Cl-4烷基。
作为烯基，例如可以例示乙烯基、烯丙基、丁烯基等C2-4烯基。
作为炔基，例如可以例示乙炔基、丙炔基、丁炔基等C2-4生基。
作为环烷基，例如可以例示环丙基、环戊基、环己基等C3-6环烷基。
作为环烯基，例如可以例示环戊烯基、环己烯基等C5-6环烯基。
作为烷氡基，例如可以例示甲氡基、乙氡基、丙氡基、丁HJ^等Cl-4 烷猛。作为卣代烷基，例如可以例示三氟甲基、三氯甲基、二氟甲基、氯甲
基、2-溴乙基、1，2-二氯丙基等Cl-3卣代烷基。
作为羟基烷基，例如可以例示羟基甲基、l-， 2-羟基乙基等羟基取代 的Cl-2烷基。
作为烷lL^烷基，例如可以例示甲氡基甲基、甲氡基乙基、乙氡基甲 基、乙氧基乙基等Cl-2烷IU^代的Cl-2烷基。
作为JL&烷基，例如可以例示氨基曱基、l-， 2-氨基乙基等单M取 代的Cl-2烷基，或二^J^代的Cl-2烷基。
作为烷基M烷基，例如可以例示甲基氣基甲基、二甲基氣基甲基、 二乙基氨基甲基等单(C1-2)烷基^J^代的Cl-2烷基、或二(Cl-2)烷基氨 基取代的Cl画2烷基。
作为卣原子，例如可以例示氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
作为可被烷氧基取代的芳烷基，例如可以例示苄基、苯乙基、4-甲氧 基苄基等可被Cl-2烷IL^取代的C7-8芳烷基。
作为可被选自卣原子和烷氧基的基团取代的芳基，例如可以例示2-， 3画，4-氯^^基、2-， 3-， 4-曱基^J^、 2-， 3-， 4-甲M^^、苯基、l-萘基、 2-萘基等可被选自卤原子(氟原子、氯原子、溴原子和碘原子)和Cl-2烷氧 基的基团取代的C6-10芳基。
作为烷1A^，例如可以例示甲琉基、乙减基、丙减基等Cl-3烷^i^危基。
作为烷基M,例如可以例示甲基氛基、乙基M、丙基氣基、异丙 基氨基、丁基氨基、异丁基氨基、叔丁基氨基、戊基氨基、己基氨基等Cl-6 烷基絲等，
从具有所述可被取代的芳氡基的用式(l，)表示的邻位取代苯乙醛酸化 合物，能够得到式(2')所示的化合物。
<formula>formula see original document page 21</formula>(式(l，)中、&表示可被取代的#^或可被取代的烷氧基，A、 B和C 相同或相互不同，表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷 緣、卤代U、羟基烷基、烷IL^烷基、#Jj^&、烷^Jl^烷基、卤
原子、硝基、M、可皿IU^代的芳烷基、可被选自卣原子和烷SJ^ 中的取^J^取代的芳基、烷1^&、 M、烷基JLfe
(式(2，)中、Rp A、 B和C表示与上^目同的含义，带*标记的碳原 子为不对称碳原子)
式(i)和(r )的化合物中，作为&所示的可被取代的氨基，优选甲基
氨基，作为可被取代的烷氡基，例如优选甲H^或乙氡基。另夕卜，作为R2 所示的可被取代的Cl-8烷基，优选曱基；作为可被取代的烷fL^烷基， 例如优选曱氧基甲基，另外，作为可被取代的芳H&烷基，例如优选二甲 基苯IL^甲基，更具体而言，可以例示2-(2-甲基苯基)-N-曱基-2-氧代乙酰 胺、2-(2-甲基苯基)-2-氧代乙酸乙酯、2-(2-曱緣甲基苯基)-N-曱基-2-氧代 乙酰胺、2-(2-甲緣曱基苯基)-2-氧代乙酸乙酯、2-(2-(2,5-二甲基苯猛甲 基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺、或2-(2-(2,5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-2-氧代乙酸曱酯。
本发明的方法中，在以所述邻位取代苯乙醛酸化合物为底物的情况下， 能够得到式(2)或式(2')的化合物，作为具体的化合物，可以分别得到2-(2-曱基苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺、2-(2-甲基苯基)-2-羟基乙酸乙酯、2-(2-甲緣甲基苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺、2-(2-甲絲曱基苯基)-2-羟基乙酸 乙酯、2-(2-(2,5-二曱基苯氧基曱基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺、或 2-(2-(2,5-二甲基苯氡基曱基)苯基)-2-羟基乙酸曱酯的光学活性体。
上述方法通常在水及还原型尼克酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸(以下记为 NADPH)等辅酶的存在下进行。此时所用的水可以是緩沖水溶液。作为该 緩冲水溶液中所用的緩冲剂，例如可以举出磷酸钠、磷酸钾等磷酸碱金属 盐、乙酸钠7jC溶液、乙酸钾等乙酸碱金属盐及它们的混合物。
22在上述方法中，除水以外也可以共存有有机溶剂。作为可共存的有机 溶剂，例如可以举出叔丁基甲基醚、二异丙醚、四氢呋喃等醚类，甲酸乙 酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯类，甲苯、
己烷、环己烷、庚烷、异辛烷等烃类，甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇、叔丁 醇等醇类，二甲亚砜等有机硫化合物，丙酮等酮类，乙腈等腈类及它们的 混合物。上述方法中的反应，例如可以在含有本发明蛋白质或产生本发明 蛋白质的转化体或其处理物并且含有水、邻位取代的苯乙醛酸化合物及 NADPH，以及根据需要进一步含有有机溶剂等的状态下，通过搅拌、振 荡等进行混合来进行。上述方法中反应时的pH可以适当选择，但通常为 pH3 10的范围。另外，反应温度可以适当选择，^a^f料及产物的稳定 性、^JI速度的观点考虑，通常为o-6ox:的范围。>^应的终点例如可以 通过利用液相色镨等追踪反应液中邻位取代的苯乙醛酸化合物的量来确 定。反应时间可以适当选择，但通常为0.5小时~10天的范围。从反应液 中回收光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物，通过通常已知的任意方法 进行即可。例如可以举出通过将反应液的有机溶剂萃取操作、浓缩操作等 后处理根据需要与柱层析、蒸馏等组合进行来纯化的方法。
本发明蛋白质、产生该蛋白质的转化体、或其处理物，可以以各种形 态在上述方法中使用。
作为转化体或其处理物的具体形态，例如可以举出包含本发明DNA 的转化体的培养物，作为转化体的处理物，例如可以举出冻干转化体、有 机溶剂处理转化体、干燥转化体、转化体磨碎物、转化体的自消化物、转 化体的超声波处理物、转化⑩提物、转化体的碱处理物、粗纯化蛋白质、 纯化蛋白质和酶蛋白质的固定化物。作为获得固定化物的方法，例如可以 举出运载体结合法(使本发明蛋白质等吸附在硅胶或陶瓷等无机运载体、纤 维素、离子交换树脂等上的方法)及包嚢法(将本发明蛋白质等限制在聚丙 烯酰胺、含硫多糖飽交(例如卡拉胶)、精氨酸凝胶、琼脂凝胶等高分子的 网状结构中的方法)。
另外，如果考虑使用包含本发明DNA的转化体进行工业生产，则与 使用活转化体相比，使用将该转化体灭活的处理物的方法从制造设备的限 制少的观点考虑优选。作为该用于4吏细菌死亡的处理方法，例如可以举出 物理杀菌法(加热、干燥、冷冻、光线、超声波、过滤、通电)或使用化学 药品的杀菌法(碱、酸、卣素、氧化剂、硫、硼、砷、金属、醇、酚、胺、
23硫化物、醚、醛、酮、氰及抗生素)。 一般而言，优选选择这些杀菌法中尽 量不使本发明蛋白质的酶活性失活且在反应体系中残留、污染等的影响小 的处理方法。
另外，本发明的制造方法在NADPH等辅酶的存在下进行，随着邻位 取代的苯乙醛酸化合物的不对称还原反应的进行，该NADPH转换为氧化 型P-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下记为NADP+)。转换生成的NADP +可以通过具有将NADP +转换为还原型(NADPH)的能力的蛋白质恢复为 原来的NADPH，因此，上述方法的反应体系内也可以共存有具有将NADP +转换为NADPH的能力的蛋白质。
作为具有将氧化型P-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下记为NAD + )或 NADP +转换为还原型P-尼克酰胺腺噪呤二核苷酸(以下记为NADH)或 NADPH的能力的蛋白质，例如可以举出葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶、搭脱 氢酶、^^酸脱氢酶及有机脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等。另外，在具有将 NAD +或NADP+转换为NADH或NADPH的能力的蛋白质为葡萄糖脱氢 酶的情况下，通过4^^应体系内共存有葡萄糖等有时可增强该蛋白质的活 性，例如，可以在反应液中添加这些物质。另外，该蛋白质可以是酶本身，
^系内。另外，也可以是包含具有下i^^序列的基因的转化体或其处理 物，所述4^^序列对具有将NAD +或NADP+转换为NADH或NADPH的 能力的蛋白质的M酸序列进行编码。此处，处理物是指与前述的"转化 体的处理物，，相同的处理物。另外，在本发明的光学活性的邻位取代苯乙 醇酸化合物的制造方法中，也可以使用同时包含具有下述v5^^序列的DNA 的转化体来进行，所述^a^序列对葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、 ^J^酸脱氢酶及有机脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等具有将NAD +或NADP +转 换为NADH或NADPH的能力的蛋白质的M酸序列进行编码。
在该转化体中，作为将两种DNA导入宿主细胞的方法，例如可以举 出将包含两种DNA的单一载体导入宿主细胞的方法和利用将两种DNA分 别导入复制起源不同的多种载体而得到的重组载体对宿主细胞进行转化 的方法等。另外，也可以将一种DNA或两种DNA导入到宿主细胞的染色 体中。另外，作为将包含两种DNA的单一载体导入宿主细胞中的方法， 例如，可以将启动子、终止子等参与表达调控的区域分别与两种DNA连 接来构建重组载体，或者构建以像乳糖操纵子那样含有多个顺反子的操纵子的形式进行表达的重组载体。 实施例
以下，通过实施例等更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任 何限制。
参考例l(染色体DNA的制备)
在两个500ml烧瓶中分别"培养基(在水100ml中溶解葡萄糖2g、 聚蛋白胨(K5g、酵母提取物0,3g、肉提取物0,3g、硫酸铵0,2g、磷酸二氢 钾O.lg、七水合硫酸镁0.05g，用2N的HC1调节pH至7)各100ml，在121 1C灭菌15分钟。向其中分别加入在相同组成的培养基中培养(30X:、 48小 时、振荡培养)的野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)IF013551菌林 的培养液各0.31111，在30C振荡培养24小时。然后，将得到的培养液离心 (8000rpm、 4匸、10分钟)，收集产生的沉淀。将该沉淀用0.85%食盐水50ml 洗涤，得到约3g的湿菌体。
使用QIAprep Genomic-tip System(Qiagen乂A司制)，从上述菌体中得 到染色体DNA(以下记为染色体DNA(A))。
实施例l(本发明DNA的获得及其分析)
根据序列编号3所示的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonas campestris pv. Campestris ) ATCC33913菌林的推测还原 酶基因(GenBank登录号AE0UU3(区域2600-3568))，合成具有序列编 号4所示的M序列的寡核香酸引物和具有序列编号5所示的磁JJf列的 寡核普酸引物。
使用具有序列编号4和序列编号5所示的磁J^序列的寡核苷酸引物， 以所述染色体DNA(A)为模板，在下述反应液组成和反应条件下进行 PCR(使用罗氏诊断产品公司制造的高保真PCR扩增系统(Expand High Fidelity PLUS PCR System))。l^因扩增PCR系 统9700中，在94n加热2分钟后，以94匸(10秒)-65C(30秒)-72X:(90秒) 为1个循环进行10个循环，接着以94匸(10秒)-65匸(30秒)-72X:(1分钟+ 5秒/循环)为1个循环进行20个循环，再在721C保持7分钟。
然后，取出一部分PCR反应液，进行琼脂糖^^电泳，结果检测到约 1000bp的DNA片段的条带。将上述约1000bp的DNA片段连接到 pCR2.1-TOPO载体中已有的"PCR产物插入位点"(使用英杰公司制TOPO TA克隆试剂盒)中，用得到的连接糾;t^杆菌TOP10F，进行转化。
在含有50ng/ml氨千青霉素的LB(l。/。细菌用胰蛋白胨、0.5。/。细菌用酵 母提取物、1%氯化钠)琼脂培养基上，涂布5-溴-4-氯-3-吲咮基-P-D-半乳糖 普(以下记为X-gal)4。/o水溶液30^1及0.1M的IPTG 30^1，将其上得到的 转化体接种进行培养。在形成的菌落中杏沐8个白色菌落，将该菌落接种 到含有50照/ml氨千青霉素的无菌LB培养基(2ml)中，在试管中振荡培养 (30t:、 24小时)。4吏用QIAprepSpinMiniprep试剂盒(Qiagen^i^司制)， 从培养菌体中取出质粒。
对向所得质粒中插入的DNA片段的4^J^序列进行分析。根据得到的 4^^序列，确定对如下所述蛋白质的M酸序列进行编码的碱基序列(序列 编号2)，所述蛋白质含于野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris) IF013551菌林中，具有将2-(2-(2,5-二甲基苯縣曱基)苯基)-N-曱基-2-氧 代乙酰胺不对称还原而优先产生(11)-2-(2-(2,5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-]\-甲基-2-羟基乙酰胺的能力。进而根据序列编号2，确定该蛋白质的氨基酸 序列(序列编号l)。另外，质粒中插入的DNA片段的磁基序列的分析，通 过4吏用荧光标记终止物循环测序反应试剂盒(Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit)(珀金埃尔默制)，以各质粒为;^板进行 测序反应，利用DNA测序仪373A(珀金埃尔默制)分析得到的DNA的>5^ 序列来进行。
实施例2(本发明转化体的制it^还原反应例(之一))(l)本发明载体的制备
根据序列编号2所示的磁J^序列，合成具有序列编号6所示的M序 列的寡核苷酸引物和具有序列编号7所示的磁J^序列的寡核苷酸引物。
以具有序列编号6所示的g序列的寡核苷酸引物和序列编号7所示 的寡核苷酸引物为引物，以所述染色体DNA(A)为模板，在下述反应液组 成和反应条件下进行PCR(使用罗氏诊断产品公司制造的高保真PCR扩增 系统)。\-曱基-2-羟基乙酰胺的光学纯度， 结果(R)体为100%e.e.。
(含量分析条件) 柱S丽ICHIRAL ODS A國212
流动相A液0.1%三氟乙酸水溶液，B液含有0.1。/。三氟乙酸的乙腈溶 液
时间(分钟)A液(。/。):B液(％)
0 80:20
20 IO:卯
30 1:99
30.1 80:20
流量0.5ml/分钟 柱温40*C 检测290nm
28(光学纯度测定条件)
柱CHIRALCEL OD画H 流动相己烷:2-丙醇=9:1 分才斤时间50分钟 流量0.5ml/分钟 柱温40t: 检测230腿
实施例3(本发明转化体的制造^L还原反应例(之二))
(1) 为制备具有编码具有将氧化型P-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸转换为 还原型的能力的蛋白质的M,列的M序列的基因进行的准备
将巨大芽孢杆菌IFO12108菌林在无菌的LB培养基100ml中培养， 得到菌体0.4g。使用Qiagen Genomic Tip(Qiagen公司制)，按照其附带的 手册中记载的方法从该菌体中纯化染色体DNA(以下记为染色体 DNA(B))。
(2) 具有编码具有将氧化型P-尼克酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸转换为还原 型的能力的蛋白质的Jl^紗列的M序列的基因的制备
根据生物化学杂志第264巻，第11期，6381-6385页(1989)中记栽的 巨大芽孢杆菌IWG3来源的葡萄糖脱氢酶的序列，合成具有序列编号8所 示的磁^^序列的寡核苷酸引物和具有序列编号9所示的磁基序列的寡核苷 酸引物。
使用具有序列编号8所示的M序列的寡核苷酸引物和具有序列编号 9所示的M序列的寡核普酸引物作为引物，以所述染色体DNA(B)为模 板，在下述反应液组成、反应^下进行PCR(使用罗氏诊断产品公司制 造的高保真PCR扩增系统)。\-甲基-2-氧代乙酰胺的残留量和(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-曱 基-2-羟基乙酰胺的生成量，求出还原酶活性。
(含量分析彿 柱SUMICHIRAL ODS A誦212
流动相A液0.1。/。三氟乙酸水溶液，B液含有0.1%三氟乙酸的乙腈溶 液
时间(分钟)A液(。/。):B液(％) 0 80:20 20 10:90 30 1:9930.1 80:20
流量0.5ml/分钟
柱温40"C
检测290nm
工业上的可利用性
根据本发明，能够将苯乙醛酸化合物不对称还原而有效地得到光学 活性的苯乙醇酸化合物。
序列表纯文本
序列编号4
为PCR设计的寡核苷酸引物 序列编号5
为PCR设计的寡核苷酸引物 序列编号6
为PCR设计的寡核苷酸引物 序列编号7
为PCR设计的寡核苷酸引物 序列编号8
为PCR设计的寡核普酸引物 序列编号9
为PCR设计的寡核苦酸引物 序列编号ll
为PCR设计的寡核普酸引物 序列编号12
为PCR设计的寡核普酸引物 序列编号13
为PCR设计的寡核普酸引物
权利要求
1.一种由下述的任何碱基序列构成的DNA，a)编码用序列编号1表示的氨基酸序列的碱基序列；b)用序列编号2表示的碱基序列。
2. —种DNA，其特征在于，以能够发挥功能的形式将能够在宿主细 胞内发挥功能的启动子与由下述a) d)中任何M序列构成的DNA连接而 形成，a) 编码用序列编号1表示的M酸序列的磁基序列；b) 相对于由编码序列编号1所示的Jl^酸序列的M序列构成的DNA 具有至少卯％序列同源性的DNA的g序列，并且是对如下所述蛋白质 的氨基酸序列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙 醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸 化合物的能力；c) 在严^Hf下与由编码序列编号1所示的M酸序列的磁J^序列构 成的DNA杂交的DNA的磁基序列，并且是对如下所述蛋白质的氨基酸 序列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合 物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的 能力；和d) 用序列编号2表示的M序列。
3. —种重组载体，其特征在于，包含权利要求1或2所述的DNA。
4. 一种转化体，其特征在于，通过将权利要求2所述的DNA或权利 要求3所述的重组载体导入宿主细胞而形成。
5. 根据权利要求4所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为微生物。
6. 根据权利要求4所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌。
7. —种转化体，其特征在于，包含具有下述的任何4序列的DNA，a) 编码用序列编号1表示的JL^酸序列的磁基序列；b) 相对于由编码序列编号1所示的M酸序列的M序列构成的DNA 具有至少90%序列同源性的DNA的磁基序列，并且是对如下所述蛋白质 的JL^酸序列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙 醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸 化合物的能力；c) 在严^Ht下与由编码序列编号1所示的^酸序列的g序列构 成的DNA杂交的DNA的4^序列，并且是对如下所述蛋白质的"IL^, 列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和d)用序列编号2表示的磁J^序列。
8. —种转化体的制造方法，其特征在于，包括将权利要求3所述的重 组栽体导入宿主细胞的步骤。
9. 一种蛋白质，具有下述的任何M,列，a) 用序列编号l表示的M酸序列；和b) 用序列编号1表示的Jl^酸序列中缺失或附加1个或多个氨基酸的 M酸序列，并且是由具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来 生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力的蛋白质的 M^列构成的Jl&^列。
10. —种重组载体，其特征在于，包含1)由下述8) (1)中的任何>^^序列构成的DNA和ii)具有对如下所述蛋白质的^J^酸序列进行编码的^ 序列的DNA，所述蛋白质具有将氧化型P-烟酰胺腺噪呤二核苷酸或氧化型 p-烟酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力，a) 编码用序列编号1表示的JL^酸序列的碱J^序列；b) 相对于由对序列编号1所示的M酸序列进行编码的磁基序列构成 的DNA具有至少90%序列同源性的DNA的磁Jjf列，并且是对如下所 述蛋白质的M^列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取 代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的 苯乙醇酸化合物的能力；c) 在严^Hf下与由编码序列编号1所示的^J^酸序列的g序列构 成的DNA杂交的DNA的碱基序列，并且是对如下所述蛋白质的"l1^^ 列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物 不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能 力；和d) 用序列编号2表示的4^^序列。
11. 根据权利要求10所述的重组载体，其特征在于，具有将氧化型p-烟酰胺腺噪呤二核普酸或氧化型P-烟酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸转换为还原 型的能力的蛋白质为葡萄糖脱氢酶。
12. 根据权利要求11所述的重组载体，其中，具有葡萄糖脱氢酶活 性的蛋白质为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium )来源的葡萄糖脱氬酶。
13. 将权利要求10 ~ 12所述的重组载体导入宿主细胞而得到的转化体
14. 根据权利要求13所述的转化体，其中，宿主细胞为微生物。
15. 根据权利要求13所述的转化体，其中，宿主细胞为大肠杆菌。
16. —种转化体，其特征在于，包含由下述a) d)中的任何M序列的DNA，所述蛋白质具有将氧化型|3-烟酰胺腺噪呤二核苷酸或氧化型卩-烟酖胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力，a) 编码用序列编号1表示的^^酸序列的碱基序列；b) 相对于由编码序列编号1所示的M酸序列的磁基序列构成的DNA 具有至少卯％序列同源性的DNA的磁基序列，并且是对如下所述蛋白质 的Jl^酸序列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙 醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸 化合物的能力；c) 在严;fMHf下与由编码序列编号1所示的Jl&酸序列的M序列构 成的DNA杂交的DNA的碱基序列，并Jbl对如下所述蛋白质的M^ 列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物 不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能 力；和d) 用序列编号2表示的M序列。
17. —种光学活性的醇化合物的制造方法，其特征在于，使权利要求 9所述的蛋白质、或权利要求4~7、 13~16中任一项所述的转化体、或其 处理物，与前手性J^^化合物接触。
18. —种式(2)所示的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的制造 方法，其特征在于，使式(l)所示的邻位取代的苯乙醛酸化合物，与具有 将式(1)的化合物不对称还原为光学活性的式(2)的化合物的能力且由下述 a) f)中的任何JL^^f列构成的蛋白质接触，<formula>formula see original document page 4</formula>式(l)中，&表示可被取代的氨基或可被取代的烷氧基，R2表示可被取代的Cl-8烷基，<formula>formula see original document page 5</formula>(2)式(2)中，Ri和R2表示与上i^目同的含义，带*标记的碳原子为手性^^、 子，a) 用序列编号1表示的M酸序列；b) 相对于由序列编号2所示的磁^^序列构成的DNA具有至少卯％ DNA的序列同源性的磁基序列所编码的M酸序列；c) 在严^MHf下与由序列编号2所示的磁J^序列构成的DNA杂交的 DNA的M序列所编码的M酸序列；d) 相对于由编码序列编号1所示的M酸序列的g序列构成的DNA 具有至少90%DNA的序列同源性的磁基序列所编码的M酸序列；e) 在严^Hf下与由编码序列编号1所示的^^酸序列的g序列构 成的DNA杂交的DNA的碱基序列所编码的^J^酸序列；和f) 用序列编号l表示的M酸序列中缺失、置换或附加l个或多个氨 基酸的JtJ^酸序列。
19.根据权利要求17所述的制造方法，其中，所述前手性g化合物 为式(l)所示的邻位取代苯乙醛酸化合物，光学活性的醇化合物为式(2)所 示的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物，式(1)中，&表示可被取代的Jl^或可被取代的烷氧基，R2表示可被取代 的Cl-8烷基，<formula>formula see original document page 6</formula>式(2)中，&和R2表示与上i^目同的含义，带*标记的碳原子为手性碳原子。
全文摘要
本发明提供能够将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原并以良好的光学收率制造光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的蛋白质、编码该蛋白质的DNA、从该DNA制造该蛋白质的方法以及使用该蛋白质来将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原从而制造对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的方法等。
文档编号C12P7/02GK101679967SQ20088001665
公开日2010年3月24日 申请日期2008年3月24日 优先权日2007年3月22日
发明者朝子弘之 申请人:住友化学株式会社