还原酶、其基因及其利用方法

专利名称：还原酶、其基因及其利用方法
技术领域：
本发明涉及新型还原酶和编码该还原酶的DNA、包含该DNA的重组载体、和用该重组载体进行转化的转化体等。本发明还涉及使用了新型还原酶或该转化体的作为光学活性 醇的光学活性的苯乙醇酸化合物等的制造方法。
背景技术：
光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物是在医农药等的制造中有用的化合物，迄 今为止提出了使用不对称还原试剂的制造方法等，在国际公开编号W00210101号记载的方 法中，为了提高光学纯度在反应后进一步进行重结晶等，在有机快报(Organic Letters), 2005，第7卷，24号，5425-5427页中记载的反应中，反应的光学收率也未必可以称为充分。 另外，迄今为止还不知道使用微生物等将邻位上具有取代基的立体上处于复杂环境的苯乙 醛酸化合物的酮基还原，从而不对称还原为光学活性的苯乙醇酸化合物的方法。

发明内容
本发明提供以良好的光学收率将邻位上具有取代基的苯乙醛酸化合物还原为光 学活性的苯乙醇酸化合物的方法。更具体而言，本发明提供能够将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原并在工业 上有利地制造对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物的蛋白质、编码该 蛋白质的DNA(以下简称为本发明DNA)、包含该DNA的转化体、从该DNA制造该蛋白质的方 法、以及使用该蛋白质来将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原从而制造对应的光学活 性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的方法。S卩，本发明提供1.由下述a) d)中的任何碱基序列构成的DNA，a)编码用序列编号1表示的氨基酸序列的碱基序列；b)i)相对于由编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA具有至少 90%序列同源性的DNA的碱基序列，并且ii)是对如下所述蛋白质的氨基酸序列进行编码 的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学 活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；c)i)在严格条件下与由编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA 杂交的DNA的碱基序列，并且ii)是对如下所述蛋白质的氨基酸序列进行编码的碱基序列， 所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位 取代的苯乙醇酸化合物的能力；和d)用序列编号2表示的碱基序列。2. 一种DNA，其特征在于，以能够发挥功能的形式将能够在宿主细胞内发挥功能 的启动子与权利要求1所述的DNA连接而形成。3. 一种重组载体，其特征在于，包含上述第1或2项所述的DNA。
4. 一种转化体，其特征在于，通过将上述第2项所述的DNA或上述第3项所述的重 组载体导入宿主细胞而形成。5.根据上述第4项所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为微生物。6.根据上述第4项所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌。7. 一种转化体，其特征在于，包含上述第1项所述的DNA。8. 一种转化体的制造方法，其特征在于，包括将上述第3项所述的重组载体导入宿主细胞的步骤。9.由下述a) e)中的任何氨基酸序列构成的蛋白质，a)用序列编号1表示的氨基酸序列；b) i)相对于由序列编号2所示的碱基序列构成的DNA具有至少90%序列同源性 的DNA的碱基序列所编码的氨基酸序列，并且ii)是如下所述的蛋白质的氨基酸序列，所述 蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代 的苯乙醇酸化合物的能力；c) i)在严格条件下与由序列编号2所示的碱基序列构成的DNA杂交的DNA的碱基 序列所编码的氨基酸序列，并且ii)是如下所述的蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质具有 将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸 化合物的能力；d) i)用序列编号1表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或多个氨基酸的氨 基酸序列，并且ii)是如下所述的蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯 乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和e) i)与序列编号1所示的氨基酸序列的序列同源性至少为90%的氨基酸序列，并 且ii)是如下所述的蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物 不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力。10. 一种重组载体，其特征在于，包含上述第1项所述的DNA和具有对如下所述蛋 白质的氨基酸序列进行编码的碱基序列的DNA，所述蛋白质具有将氧化型β -烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸或氧化型β“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力。11.根据上述第10项所述的重组载体，其特征在于，具有将氧化型β -烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力的蛋白质，为葡 萄糖脱氢酶。12.根据上述第11项所述的重组载体，其特征在于，具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋 白质为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的葡萄糖脱氢酶。13. 一种转化体，其特征在于，通过将上述第10 12项所述的重组载体导入宿主 细胞而得到。14.根据上述第13项所述的转化体，其中，宿主细胞为微生物。15.根据上述第13项所述的转化体，其中，宿主细胞为大肠杆菌。16. 一种转化体，其特征在于，包含上述第1项所述的DNA和具有对如下所述蛋白 质的氨基酸序列进行编码的碱基序列的DNA，所述蛋白质具有将氧化型β -烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸或氧化型β“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力。17. 一种光学活性醇的制造方法，其特征在于，使上述第9项所述的蛋白质、或上述第4 7、13 16项中任一项所述的转化体、或其处理物，与前手性羰基化合物反应。18.根据上述第17项所述的制造方法，其中，前手性羰基化合物为邻位取代的苯 乙醛酸的酰胺或酯化合物，对应的光学活性的醇化合物为光学活性的邻位取代的苯乙醇酸 的酰胺或酯化合物。19.根据上述第18项所述的制造方法，其中，邻位取代的苯乙醛酸的酰胺或酯化 合物为式(1)所示的化合物，光学活性的邻位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物为式(2) 所示的光学活性化合物，
(1)式(1)中，R1表示可被取代的氨基或可被取代的烷氧基，R2表示可被取代的C1-8
烧基，
(2)式(2)中，R1和R2表示与上述相同的含义，带*标记的碳原子为手性碳原子。20.寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) SC-I (FERM BP-10785)。根据本发明，能够以良好的光学纯度制造作为医农药或其制造中间体等有用的光 学活性的邻位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物。
具体实施例方式首先，对本发明DNA进行说明。本发明DNA可以从具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原为对应的 光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力的微生物中获得，例如从寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.) SC-1菌株(FERM BP-10785)等归属于寡养单胞菌属的微生物中获 得。本发明的DNA可以是所述天然的DNA，或者也可以是通过以下说明的方法在所述天然的 DNA中导入变异(位点定向诱变法、突变处理等)而制成的DNA。寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. ) SC-I菌株保藏于独立行政法人产业技术综 合研究所专利生物保藏中心，邮编305-8566，日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第 6，授予的保藏编号的为FERM BP-10785 (原保藏日2007年2月21日)。细菌学特性如下。1.菌落形态(30°C、24小时)(1)细胞形态杆菌，0. 7 0. 8 X 1. 5 2. O μ m(2)革兰氏染色阴性
(3)有无孢子无(4)有无运动性有2.营养琼脂上的菌落形态菌落的颜色淡黄色菌落的形状圆形 菌落的边缘整个边缘光滑菌落的隆起透镜状透明度不透明3.生理学性质(1)过氧化氢酶阳性(2)氧化酶阴性(3) OF实验阳性/阴性4.编码16S核糖体RNA的DNA的碱基序列利用PCR从寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. ) SC-I菌株中扩增16S核糖体DNA 的碱基序列约500bp，对碱基序列进行分析。使用所得的16S核糖体DNA的碱基序列，通过 BLAST进行同源性性检索，结果同源率为99. 6%，相对于Stenotrophomonas rhizophila 标准菌株的16S核糖体DNA，显示出最高的同源性。即便在使用了国际核酸序列数据库的 BLAST检索中，也示出与寡养单胞菌(Stenotrophomonas)属来源的16S核糖体DNA的高同 源性。根据以上的细菌学性质，本细菌鉴定为寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)。在本发明DNA中，“在严格条件下与由编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序 列构成的DNA杂交的DNA”，是指下述DNA 例如在“克隆与序列”(cloning and sequence) (渡边格主编，杉浦昌弘编辑，1989年，农村文化公司发行)等中记载的Southern杂交法 中，(1)通过在高离子浓度下[例如可以举出6xSSC(900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠)]、 65°C下进行杂交，与由编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA形成 DNA-DNA杂交体，(2)即使在低离子浓度下[例如可以举出0. IxSSC(15mM的氯化钠、1. 5mM 的柠檬酸钠)]、65°C下保温30分钟后，该杂交体仍能维持。具体而言，例如可以举出由编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的 DNA、由编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序列中一部分碱基缺失、置换或附加的碱 基序列构成的DNA、相对于由编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA具有 至少90%序列同源性、优选至少95%序列同源性、更优选至少99%序列同源性的DNA等。所述DNA可以是从自然界中存在的DNA中克隆的DNA，可以是在该克隆的DNA的碱 基序列中人工导入部分碱基的缺失、置换或附加而得到的DNA，也可以是人工合成的DNA。 序列同源性可以使用例如带有UWGCG软件包的BESTFIT程序(Devereux等(1984)，核酸 研究 12，387-395 页)、或者 PILEUP 或 BLAST 算法(Altschul S. F. (1993) J Mol Evol36 290-300 ；Altschul S. F. (1990) J Mol Biol 215:403-10)等序列分析用工具算出。本发明的DNA例如可以如下制备。从寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)等归属于寡养单胞菌属的微生物等中，按 照通常的基因工程的方法(例如，“新细胞工程实验方法”(东京大学医科学研究所制癌研究部编，秀润公司，1993年)中记载的方法)制备DNA文库，以制备的DNA文库作为模板，并 且使用适当的引物进行PCR，由此能够扩增由编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序 列构成的DNA、由编码序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或多个氨基酸 的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA和/或具有序列编号2所示的碱基序列的DNA等，从 而制备本发明的DNA。
另外，通过以所述DNA文库作为模板，并且使用具有序列编号12所示的碱基序列 的寡核苷酸和具有序列编号13所示的碱基序列的寡核苷酸作为引物进行PCR，能够扩增由 序列编号2所示的碱基序列构成的DNA，从而制备本发明的DNA。作为该PCR的条件，例如可以举出下述条件将4种dNTP各20 μ M、2种寡核苷酸 引物各15pmol、Taq聚合酶1. 3U及作为模板的DNA文库混合而成反应液，94°C加热该反应 液2分钟后，以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (90秒)为1个循环进行10个循环，接着 以94°C (10秒)-650C (30秒)-72°C (1分钟+5秒/循环)为1个循环进行20个循环，再 在72 °C保持7分钟。需要说明的是，该PCR中使用的引物的5’末端侧和/或3’末端侧可以附加限制 性内切酶识别序列等。另外，通过以所述DNA文库作为模板，使用具有从编码序列编号1所示的氨基酸序 列的碱基序列中选择的部分碱基序列的寡核苷酸等(例如，由编码序列编号1所示的氨基 酸序列的5’末端侧的约14个碱基以上的碱基序列构成的寡核苷酸)和由与DNA文库构建 中使用的载体的DNA插入位点附近的碱基序列互补的碱基序列构成的约14个碱基以上的 寡核苷酸作为引物进行PCR，也能够扩增具有编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序 列的DNA、具有对序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或多个氨基酸的氨 基酸序列进行编码的碱基序列的DNA等，从而制备本发明的DNA。将如上所述扩增的DNA按照“分子克隆实验室手册第二版”(1989)，冷泉 港实验室出版社，“最新分子生物学实验方法汇编”(1987)，约翰·威利父子公司， ISBN0-471-50338-X等中记载的方法克隆到载体中，能够得到本发明的载体。作为所 用的载体，具体例如可以举出pUC119(宝酒造公司制)、pTV118N(宝酒造公司制)、 pBluescriptII(东洋纺公司制)、pCR2. 1-T0P0(英杰公司制)、pTrc99A(法玛西亚公司 制)、pKK223-3 (法玛西亚公司制)等。另外，本发明的DNA也可以通过下述方法获得例如，以由具有从编码序列编号1 所示的氨基酸序列的碱基序列中选择的部分碱基序列的约15个碱基以上的碱基序列构成 的DNA作为探针，使其在后述的条件下与微生物或噬菌体来源的载体中插入的DNA文库杂 交，检测该探针特异性结合的DNA，由此获得。作为使探针与染色体DNA或DNA文库杂交的方法，例如可以举出菌落杂交或噬菌 斑杂交，可以根据文库的制作中使用的载体的种类来选择方法。在所用文库是使用质粒载体制作而成的情况下，可以利用菌落杂交。具体而言，通 过将文库DNA导入宿主微生物，得到转化体，对所得转化体进行稀释后，将该稀释物接种到 琼脂培养基上，培养到出现菌落为止。在所用文库是使用噬菌体载体制作而成的情况下，可以利用噬菌斑杂交。具体而 言，将宿主微生物和文库的噬菌体在能够感染的条件下混合，进一步与软琼脂培养基混合后，将该混合物接种到琼脂培养基上，培养到出现噬菌斑为止。
接着，无论在何种杂交的情况下，在进行了所述培养的琼脂培养基上铺设膜，使转 化体或噬菌体吸附、转印到该膜上。对该膜进行碱处理后，进行中和处理，接着进行将DNA 固定在该膜上的处理。更具体而言，例如，在噬菌斑杂交的情况下，在所述琼脂培养基上铺 设硝酸纤维素膜或尼龙膜(例如Hybond-N^安玛西亚公司注册商标))，静置约1分钟，使 噬菌体粒子吸附、转印到膜上。接着，将该膜在碱溶液(例如1.5M氯化钠、0. 5M氢氧化钠) 中浸渍约3分钟，使噬菌体粒子溶解，由此将噬菌体DNA从膜上洗脱下来，然后在中和溶液 (例如1. 5M氯化钠、0. 5MTris-盐酸缓冲溶液pH7. 5)中浸渍约5分钟。接着用洗涤液(例 如0. 3M氯化钠、30mM柠檬酸、0. 2MTris-盐酸缓冲液pH7. 5)洗涤该膜约5分钟，然后通过 例如在约80°C下加热约90分钟使噬菌体DNA固定在膜上。使用如此制备的膜，以上述DNA作为探针进行杂交。杂交例如可以按照 J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Manlatis著“分子克隆实验室手册第二版(1989) ”冷泉港实 验室出版社等的记载来进行。用作探针的DNA可以是用放射性同位素标记的DNA，也可以是用荧光色素标记的 DNA。作为用放射性同位素标记用作探针的DNA的方法，例如可以举出通过利用随机引 物标记试剂盒(宝酒造公司制)等将PCR反应液中的dCTP替换为(a-32P)dCTP，以用作探 针的DNA为模板进行PCR的方法。另外，在使用荧光色素标记用作探针的DNA的情况下，例如可以使用安玛西亚制 造的ECL核酸直接标记和检测系统等。杂交例如可以如下进行。按照相对于Icm2如上制作的膜为50 200 μ 1的比例准备预杂交液，所述预杂交 液含有450 900mM氯化钠、45 90mM柠檬酸钠、0. 1 1. 0重量％浓度的十二烷基硫酸 钠(SDS)、0 200μ 1/ml浓度的变性非特异DNA，根据情况还可以含有白蛋白、Ficoll、聚 乙烯基吡咯烷酮等各0 0. 2重量％浓度，所述预杂交液优选含有900mM氯化钠、90mM柠 檬酸钠、1. 0重量％ SDS及100 μ 1/ml变性小牛胸腺DNA，将所述膜浸渍在该预杂交液中，在 42 65°C保温1 4小时。接着，将例如含有450 900mM氯化钠、45 90mM柠檬酸钠、0. 1 1.0重量％浓 度的SDS、0 200μ g/ml浓度的变性非特异DNA以及根据情况可以含有的白蛋白、Ficoll、 聚乙烯基吡咯烷酮等各0 0. 2重量％浓度的杂交溶液(优选含有900mM氯化钠、90mM柠 檬酸钠、1. 0重量％ SDS及100 μ g/ml变性小牛胸腺DNA的杂交溶液)，与通过前述方法制 备而得的探针(相当于Icm2膜为1. OX IO4 2. OX IO6Cpm的量)混合而得到溶液，按照相 对于Icm2膜为50 200 μ 1的比例准备该溶液，将膜浸渍于该杂交溶液中，在42 65°C保 温12 20小时。该杂交后，将膜取出，用含有15 300mM氯化钠、1. 5 30mM柠檬酸钠及0. 1 1. 0重量％的SDS等的42 65 °C的洗涤液(优选含有15mM氯化钠、1. 5mM柠檬酸钠及1. 0 重量％的SDS的65 °C的洗涤液)等进行洗涤。洗涤过的膜用2xSSC(300mM氯化钠、30mM柠 檬酸钠)轻轻冲洗后，进行干燥。对该膜进行例如放射自显影等，检测膜上的探针的位置， 由此在原来的琼脂培养基上确定与所用探针杂交的DNA的膜上位置所对应的克隆，通过对其进行挑菌，分离出具有该DNA的克隆。
对如此得到的克隆进行培养，从得到的培养菌体能够制备本发明的DNA。将如上所述制备的DNA按照“分子克隆实验室手册第二版”(1989)，冷泉 港实验室出版社，“最新分子生物学实验方法汇编”(1987)，约翰·威利父子公司， ISBN0-471-50338-X等中记载的方法克隆到载体中，能够得到本发明的重组载体。作为使 用的载体，具体而言，例如可以举出pUC119(宝酒造公司制)、pTV118N(宝酒造公司制)、 pBluescriptII(东洋纺公司制)、pCR2. 1-T0P0(英杰公司制)、pTrc99A(法玛西亚公司 制)、pKK223-3 (法玛西亚公司制)等。另外，所述DNA的碱基序列可以通过F. Sanger、S. Nicklen、A. R. Coulson著，美国 国家科学院院刊(1977)74 :5463-5467页等中记载的双脱氧终止法(dideoxy terminator method)等进行分析。碱基序列分析用试样的制备可以使用例如珀金埃尔默公司的ABI PRISM荧光标记终止物循环测序反应试剂盒等市售的试剂。如上操作得到的DNA编码的是如下所述的蛋白质的氨基酸序列，所述的蛋白质具 有将邻位取代的苯乙醛酸化合物、典型而言是其酰胺或酯化物(例如2-(2-(2，5_ 二甲基 苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)不对称还原而产生对应的光学活性的邻位 取代的苯乙醇酸化合物、典型而言是其酰胺或酯化物(例如(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基 甲基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺)的能力，这一结果的确认例如可以如下进行。首先，将如上操作得到的DNA如后所述按照与能在宿主细胞中发挥功能的启动子 的下游连接的方式插入载体中，将该载体导入宿主细胞中而获得转化体。接着，使该转化 体的培养物与邻位取代的苯乙醛酸化合物(例如该化合物的酰胺或酯化合物，作为其具体 例，例如2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)作用。对反应 生成物中对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物(例如其酰胺或酯化合物，具体而 言，例如(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺)的量进行 分析，由此能够确认所得DNA编码的是具有所述能力的蛋白质的氨基酸序列。为了使本发明DNA在宿主细胞中表达，例如将能在宿主细胞中发挥功能的启动子 与本发明DNA以能发挥功能的形式连接而成的DNA导入宿主细胞中。此处，“以能发挥功能的形式”是指在通过将该DNA导入宿主细胞中来使宿主细 胞转化时，本发明DNA处于与启动子结合以便在启动子的调控下进行表达的状态。作为启 动子，可以举出大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子、大肠杆菌的色氨酸操纵子的启动子、或者 tac启动子或trc启动子等能够在大肠杆菌内发挥功能的合成启动子等，也可以利用寡养 单胞菌中对本发明DNA的表达进行调控的启动子。一般而言，将以能发挥功能的形式与能在宿主细胞中发挥功能的启动子连接而成 的DNA插入到前述的载体中而得到重组载体，将所得的重组载体导入宿主细胞中。另外，作 为载体，使用含有筛选标记基因(例如，卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因等赋予抗生素 抗性的基因等)的载体时，可以以该筛选标记基因的表型等作为指标对导入该载体的转化 体进行选择。作为导入以能发挥功能的形式与能在宿主细胞中发挥功能的启动子连接 而成的本发明DNA、或本发明重组载体等的宿主细胞，例如可以举出归属于埃希氏菌 (Escherichia)属、芽 包杆菌(Bacillus)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属、酵母菌(Saccharomyces)属、克鲁 维酵母(Kluyveromyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、红球菌(Rhodococcus)属及曲霉 (Aspergillus)属的微生物等。
将以能发挥功能的形式与能在宿主细胞中发挥功能的启动子连接而成的本发明 DNA或本发明重组载体等导入宿主细胞的方法，根据所用的宿主细胞采用通常使用的导入 方法即可，例如可以举出“分子克隆实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社，“最 新分子生物学实验方法汇编”(1987)，约翰·威利父子公司，ISBN0-471-50338-X等中记载 的氯化钙法、或“电穿孔法基因脉冲/大肠杆菌脉冲系统”伯乐实验室，(1993)等中记载 的电穿孔法等。要筛选导入有以能发挥功能的形式与能在宿主细胞中发挥功能的启动子连接而 成的本发明DNA或本发明重组载体等的转化体，例如以前述的载体中所含的筛选标记基因 的表型作为指标进行筛选即可。该转化体含有本发明DNA这一点，可以通过例如按照“分子克隆实验室手册第二 版”(1989)，冷泉港实验室出版社等中记载的通常的方法进行限制性内切酶酶切位点的确 认、碱基序列的分析、Southern杂交、Western杂交等来确认。下面对本发明蛋白质进行说明。作为“用序列编号1表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或多个氨基酸的氨 基酸序列”，优选用序列编号1表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个氨基酸的氨基酸 序列。本发明蛋白质，例如可以通过对包含本发明DNA的转化体进行培养来制造。作为用于培养该转化体的培养基，例如可以使用在微生物等宿主细胞的培养中通 常使用的适当含有碳源、氮源、有机盐、无机盐等的各种培养基。作为碳源，例如可以举出葡萄糖、糊精、蔗糖等糖类、甘油等糖醇、富马酸、柠檬酸、 丙酮酸等有机酸、动物油、植物油及糖蜜。关于这些碳源在培养基中的添加量，相对于培养 液通常为约0.1 30% (w/v) O作为氮源，例如可以举出肉提取物、蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、大豆粉、玉 米浆(Corn Steep Liquor)、棉籽粉、干燥酵母、酪蛋白氨基酸等天然有机氮源、氨基酸类、 硝酸钠等无机酸的铵盐、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等无机酸的铵盐、富马酸铵、柠檬酸铵等有 机酸的铵盐及尿素。其中，有机酸的铵盐、天然有机氮源、氨基酸类等在多数情况下也可以 作为碳源使用。关于这些氮源在培养基中的添加量，相对于培养液通常为约0. 1 30% (w/
ν) O作为有机盐或无机盐，例如可以举出钾、钠、镁、铁、锰、钴、锌等的氯化物、硫酸盐、 乙酸盐、碳酸盐及磷酸盐。具体而言，例如可以举出氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸 锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、乙酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钾及磷酸氢钾。关于这些有机盐和/ 或无机盐在培养基中的添加量，相对于培养液通常为约0. 0001 5% (w/v)。进而，在导入有tac启动子、trc启动子及Iac启动子等异乳糖诱导型的启动子与 本发明DNA以能发挥功能的形式连接而成的基因而得的转化体的情况下，作为用于诱导本 发明蛋白质产生的诱导剂，例如也可以在培养基中少量添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)。
含有本发明DNA的转化体的培养，可以按照微生物等宿主细胞的培养中通常使用 的方法来进行，例如可以举出试管振荡式培养、往返式振荡培养、摇瓶(JarFermenter)培 养、酵罐培养等液体培养及固体培养。 培养温度可以在该转化体能够生长的范围内适当改变，通常为约15 40°C。培养 基的PH优选为约6 8的范围。培养时间因培养条件而异，通常优选为约1天 约5天。作为从含有本发明DNA的转化体的培养物中纯化本发明蛋白质的方法，可以应用 在通常的蛋白质纯化中使用的方法，例如可以举出如下方法。首先，通过离心分离等从转化体的培养物中收集细胞后，通过超声波处理、dino mill处理、弗氏压碎处理等物理破碎法或者使用表面活性剂或溶菌酶等的化学破碎法等将 其破碎。通过离心分离、膜滤器过滤等从所得破碎液中除去杂质，由此制备无细胞抽提液， 适当使用阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、金属螯合层析等分 离纯化方法将其分为不同组分，由此能够纯化本发明蛋白质。作为层析中使用的载体，例如可以举出导入了羧甲(CM)基、二乙基氨基乙基 (DEAE)、苯基或丁基的纤维素、糊精或琼脂糖等不溶性高分子载体。也可以使用市售的填 充完载体的层析柱，作为所述市售的填充完载体的层析柱，例如可以举出Q-Si5Phar0se FF、 Phenyl-Sepharose HP(商品名，均为安发玛西亚生物技术公司制)、TSK-gel G3000SW(商 品名，东曹公司制)等。另外，要筛选含有本发明蛋白质的组分，以将2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯 基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)不对称还原而优先产生(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲 基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺的能力作为指标进行筛选即可。本发明的转化体及其处理物，可以用于将作为前手性羰基化合物的式(1)所示的 邻位取代苯乙醛酸化合物(例如其酯或酰胺化合物)不对称还原来制造作为光学活性醇化 合物的式(2)所示的光学活性的邻位取代苯乙醇酸化合物(例如其酰胺或酯化合物)。对式(1)的邻位取代苯乙醛酸化合物及式(2)的邻位取代苯乙醇酸化合物中队所 示的取代基进行如下说明。作为R1所示的可被取代的氨基，除了氨基之外，例如可以例示甲基氨基、乙基氨 基、丙基氨基、异丙基氨基、丁基氨基、异丁基氨基、叔丁基氨基、戊基氨基、己基氨基等C1-6 烷基氨基。另外，作为可被取代的烷氧基，例如可以举出甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、 丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基和辛氧基等C1-8烷氧基。下面，对R2所示的取代基进行如下说明。作为R2所示的可被取代的C1-8烷基中的C1-8烷基，例如可以例示甲基、乙基、丙
基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基等。作为所述C1-8烷基的取代基，可以例示可被取代的烷氧基和可被取代的芳氧基。作为R2所示的可被取代的烷氧基烷基，例如可以例示甲氧基甲基、甲氧基乙基、甲
氧基丙基、甲氧基丁基、甲氧基戊基、甲氧基己基、甲氧基庚基、甲氧基辛基、乙氧基甲基、乙 氧基乙基、乙氧基丙基、乙氧基丁基、乙氧基戊基、乙氧基己基、乙氧基庚基、乙氧基辛基、丙 氧基甲基、丙氧基乙基、丙氧基丙基、丙氧基丁基、丙氧基戊基、丙氧基己基、丙氧基庚基、丙 氧基辛基、丁氧基甲基、丁氧基乙基、丁氧基丙基、丁氧基丁基、丁氧基戊基、丁氧基己基、丁 氧基庚基、丁氧基辛基等C1-4烷氧基取代的C1-8烷基。
作为可被取代的芳氧基，可以例示式(3)所示的芳氧基。 (式中、Α、Β和C相同或相互不同，表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、 烷氧基、商代烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、商原子、硝基、氰基、可 被烷氧基取代的芳烷基、可被选自卤原子和烷氧基的取代基取代的芳基、烷基硫基、氨基、 烷基氨基)对式(3)中的Α、Β或C所示的取代基进行如下说明。作为烷基，例如可以例示甲基、乙基、丙基、丁基等C1-4烷基。作为烯基，例如可以例示乙烯基、烯丙基、丁烯基等C2-4烯基。作为炔基，例如可以例示乙炔基、丙炔基、丁炔基等C2-4炔基。作为环烷基，例如可以例示环丙基、环戊基、环己基等C3-6环烷基。作为环烯基，例如可以例示环戊烯基、环己烯基等C5-6环烯基。作为烷氧基，例如可以例示甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等C1-4烷氧基。作为卤代烷基，例如可以例示三氟甲基、三氯甲基、二氟甲基、氯甲基、2-溴乙基、 1，2_ 二氯丙基等C1-3卤代烷基。作为羟基烷基，例如可以例示羟基甲基、1-，2-羟基乙基等羟基取代的C1-2烷基。作为烷氧基烷基，例如可以例示甲氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基甲基、乙氧基乙 基等C1-2烷氧基取代的C1-2烷基。作为氨基烷基，例如可以例示氨基甲基、1-，2-氨基乙基等单氨基取代的C1-2烷 基、或二氨基取代的C1-2烷基。作为烷基氨基烷基，例如可以例示甲基氨基甲基、二甲基氨基甲基、二乙基氨基甲 基等单(C1-2)烷基氨基取代的C1-2烷基、或二(C1-2)烷基氨基取代的C1-2烷基。作为卤原子，例如可以例示氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。作为可被烷氧基取代的芳烷基，例如可以例示苄基、苯乙基、4-甲氧基苄基等可被 C1-2烷氧基取代的C7-8芳烷基。作为可被选自卤原子和烷氧基的基团取代的芳基，例如可以例示2-，3-，4_氯苯 基、2-，3-，4_甲基苯基、2-，3-，4_甲氧基苯基、苯基、1-萘基、2-萘基等可被从卤原子(氟 原子、氯原子、溴原子和碘原子)和C1-2烷氧基中选择的基团取代的C6-10芳基。作为烷基硫基，例如可以例示甲硫基、乙硫基、丙硫基等C1-3烷基硫基。作为烷基氨基，例如可以例示甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、丁基氨 基、异丁基氨基、叔丁基氨基、戊基氨基、己基氨基等C1-6烷基氨基等。从所述具有可被取代的芳氧基的用式(1’ )表示的邻位取代苯乙醛酸化合物能 够，得到式(2’ )所示的化合物。 (式(1’)中、礼表示可被取代的氨基或可被取代的烷氧基，A、B和C相同或相互 不同，表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、烷氧基、商代烷基、羟基烷基、烷氧基 烧基、氨基烷基、烷基氨基烷基、商原子、硝基、氰基、可被烷氧基取代的芳烷基、可被选自商 原子和烷氧基中的取代基取代的芳基、烷基硫基、氨基、烷基氨基) (式(2’)中、Ri、A、B和C表示与上述相同的含义，带*标记的碳原子为手性碳原 子)式(1)和(1’)的化合物中，作为札所示的可被取代的氨基，优选甲基氨基，作为可 被取代的烷氧基，例如优选甲氧基或乙氧基。另外，作为R2所示的可被取代的C1-8烷基，优 选甲基；作为可被取代的烷氧基烷基，例如优选甲氧基甲基，另外，作为可被取代的芳氧基 烧基，例如优选二甲基苯氧基甲基，更具体而言，可以例示2- (2-甲基苯基)-N-甲基-2-氧 代乙酰胺、2_(2_甲基苯基)_2_氧代乙酸乙酯、2-(2_甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-氧代 乙酰胺、2-(2_甲氧基甲基苯基)_2_氧代乙酸乙酯、2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯 基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺或2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)_2_氧代乙酸甲酯。本发明的方法中，在以所述邻位取代苯乙醛酸化合物为底物的情况下，能够得到 式(2)或式(2’)的化合物，作为具体的化合物，可以分别得到2-(2_甲基苯基)-N-甲 基-2-羟基乙酰胺、2-(2_甲基苯基)_2_羟基乙酸乙酯、2-(2_甲氧基甲基苯基)-N-甲 基-2-羟基乙酰胺、2-(2_甲氧基甲基苯基)_2_羟基乙酸乙酯、2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基 甲基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺或2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-2_羟基 乙酸甲酯的光学活性体。上述方法通常在水及还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下记为NADPH)等 辅酶的存在下进行。此时所用的水可以是缓冲水溶液。作为该缓冲水溶液中所用的缓冲剂， 例如可以举出磷酸钠、磷酸钾等磷酸碱金属盐、乙酸钠水溶液、乙酸钾等乙酸碱金属盐及它 们的混合物。在上述方法中，除水以外也可以共存有有机溶剂。作为可共存的有机溶剂，例如可 以举出叔丁基甲基醚、二异丙醚、四氢呋喃等醚类，甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁 酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯类，甲苯、己烷、环己烷、庚烷、异辛烷等烃类，甲醇、乙醇、2-丙 醇、丁醇、叔丁醇等醇类，二甲亚砜等有机硫化合物，丙酮等酮类，乙腈等腈类及它们的混合 物。
上述方法中的反应，例如可以在含有本发明蛋白质或产生本发明蛋白质的转化体 或其处理物并且含有水、邻位取代的苯乙醛酸的酰胺或酯化合物(例如2-(2-(2，5_二甲基 苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)及NADPH，以及根据需要进一步含有有机溶 剂等的状态下，通过搅拌、振荡等进行混合来进行。上述方法中反应时的pH可以适当选择，但通常为pH3 10的范围。另外，反应 温度可以适当选择，但从原料及产物的稳定性、反应速度的观点考虑，通常为0 60°C的范 围。反应的终点例如可以通过利用液相色谱等追踪反应液中邻位取代的苯乙醛酸的 酰胺或酯化合物(例如2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺) 的量来确定。反应时间可以适当选择，但通常为0. 5小时 10天的范围。从反应液中回收邻位取代的光学活性的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物(例如 (R) -2- (2- (2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺)，通过通常已知的任 意方法进行即可。例如可以举出通过将反应液的有机溶剂萃取操作、浓缩操作等后处理根据需要与 柱层析、蒸馏等组合进行来纯化的方法。本发明蛋白质、产生该蛋白质的转化体、或其处理物，可以以各种形态在上述方法 中使用。关于具体的形态，例如作为包含本发明DNA的转化体的培养物、所述转化体的处 理物，可以举出无细胞抽提液、粗纯化蛋白质、纯化蛋白质等及它们的固定化物。此处，作 为转化体的处理物，例如可以举出冻干转化体、有机溶剂处理转化体、干燥转化体、转化体 磨碎物、转化体的自消化物、转化体的超声波处理物、转化体抽提物、转化体的碱处理物。另 外，作为获得固定化物的方法，例如可以举出运载体结合法(使本发明蛋白质等吸附在硅 胶或陶瓷等无机运载体、纤维素、离子交换树脂等上的方法)及包囊法(将本发明蛋白质等 限制在聚丙烯酰胺、含硫多糖凝胶(例如卡拉胶)、精氨酸凝胶、琼脂凝胶等高分子的网状 结构中的方法)。另外，如果考虑使用包含本发明DNA的转化体进行工业生产，则与使用活转化体 相比，使用将该转化体灭活的处理物的方法从制造设备的限制少的观点考虑优选。作为该 用于使细菌死亡的处理方法，例如可以举出物理杀菌法(加热、干燥、冷冻、光线、超声波、 过滤、通电)或使用化学药品的杀菌法(碱、酸、卤素、氧化剂、硫、硼、砷、金属、醇、酚、胺、硫 化物、醚、醛、酮、氰及抗生素)。一般而言，优选选择这些杀菌法中尽量不使本发明蛋白质的 酶活性失活且在反应体系中残留、污染等影响小的处理方法。另外，本发明的光学活性的邻位取代苯乙醇酸酰胺或酯化合物的制造方法，在 NADPH等辅酶的存在下进行，就该邻位取代苯乙醛酸酰胺或酯化合物(例如2-(2-(2，5_ 二 甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)而言，随着不对称还原反应的进行，该 NADPH转换为氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下记为NADP+)。转换生成的 NADP+可以通过具有将NADP+转换为还原型(NADPH)的能力的蛋白质恢复为原来的NADPH， 因此，上述方法的反应体系内也可以共存有具有将NADP+转换为NADPH的能力的蛋白质。作为具有将氧化型0 -尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下记为NAD+)或NADP+转换
15为还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下记为NADH)或NADPH的能力的蛋白质，例如 可以举出葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、氨基酸脱氢酶及有机脱氢酶(苹果酸脱氢酶
寸J寸°另外，在具有将NAD+或NADP+转换为NADH或NADPH的能力的蛋白质为葡萄糖脱氢 酶的情况下，通过使反应体系内共存有葡萄糖等而有时可增强该蛋白质的活性，例如，可以 在反应液中添加这些物质。另外，该蛋白质可以是酶本身，或者也可以以具有该酶的微生物或该微生物的处 理物的形态共存于反应体系内。进而，也可以是包含具有对如下所述的蛋白质的氨基酸序 列进行编码的碱基序列的基因的转化体或其处理物，所述蛋白质具有将NAD+或NADP+转换 为NADH或NADPH的能力。此处，处理物是指与前述的“转化体的处理物”等同的处理物。另外，在本发明的邻位取代的光学活性苯乙醇酸酰胺或酯化合物的制造方法中， 也可以使用同时包含具有对如下所述的蛋白质的氨基酸序列进行编码的碱基序列的DNA 的转化体来进行，所述的蛋白质是葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、氨基酸脱氢酶及有 机脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等具有将NAD+或NADP+转换为NADH或NADPH的能力的蛋白 质。在该转化体中，作为将两种DNA导入宿主细胞的方法，例如可以举出将包含两种 DNA的单一载体导入宿主细胞的方法和利用将两种DNA分别导入复制起源不同的多种载体 而得到的重组载体对宿主细胞进行转化的方法等。另外，也可以将一种DNA或两种DNA导 入到宿主细胞的染色体中。另外，作为将包含两种DNA的单一载体导入宿主细胞中的方法，例如，可以将启动 子、终止子等参与表达调控的区域分别与两种DNA连接来构建重组载体，或者构建以像乳 糖操纵子那样含有多个顺反子的操纵子的形式进行表达的重组载体。实施例以下，通过实施例等更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限制。参考例1 (染色体DNA的制备)在两个500ml烧瓶中分别装入培养基(在水100ml中溶解葡萄糖2g、聚蛋白 胨0. 5g、酵母提取物0. 3g、肉提取物0. 3g、硫酸铵0. 2g、磷酸二氢钾0. lg、七水合硫酸镁 0.05g，用2N的HC1调节pH至6)各100ml，在121°C灭菌15分钟。向其中分别加入在相同 组成的培养基中培养(30°C、48小时、振荡培养)的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) SC-1菌株(FERMBP-10785)的培养液各0. 3ml，在30°C振荡培养24小时。然后，将得到的 培养液离心(8000rpm、4°C、10分钟)，收集产生的沉淀。将该沉淀用0. 85%食盐水50ml洗 涤，得到3. 5g的湿菌体。使用QIApr印Genomic-tip System(Qiagen公司制)从上述菌体中得到染色体 DNA (以下记为染色体DNA (A))。实施例1 (本发明DNA的获得及其分析)(1)(本发明蛋白质的制备)将在与参考例同样的条件下制备的寡养单胞菌(Stenotrophomonassp. ) SC-1菌 株(FERM BP-10785)的湿菌体约7. 5g，悬浮于添加有ImMPMSF (苯甲基磺酰氟)的20mM磷 酸钾缓冲液(pH7. 0) 10ml中，用Multi-Beads Shocker (安井器械公司制，玻璃珠0. ImmO,
162500rpm，20分钟)破碎。在所得破碎液中添加硫酸鱼精蛋白38mg后，离心分离(8000rpm、 4°C、10分钟)，再将上清用过滤器(0.45i!m)过滤，得到离心上清液约8ml。重复进行同样 的操作，得到离心上清液约40ml。使得到的离心上清液约10ml在亲和层析柱[HiTrap BlueHP (安发玛西亚生物技 术公司制)][用20mM磷酸钾缓冲液(pH7. 0)平衡]上展开，以溶解有氯化钠的磷酸钾缓冲 液(氯化钠浓度0 — 1. 0M的浓度梯度)作为流动相进行洗脱，作为具有还原酶活性的组分， 得到氯化钠浓度0. 5 0. 8M的组分2ml。重复进行同样的操作，得到活性组分约10ml。使用Amicon Ultra-4 (MILLIP0RE 公司制)浓缩该洗脱组分，并用 20mM Tris-HCl 缓冲液(PH7.5)进行缓冲交换。将该浓缩液在离子交换层析柱[HiTrap DEAE Sepharose FF(安发玛西亚生物技术公司制)][用Tris-HCl缓冲液(20mM、pH7. 5)平衡]上展开，以 溶解有氯化钠的Tris-HCl缓冲液(氯化钠浓度0 — 0. 5M的浓度梯度)作为流动相进行洗 脱，作为具有还原酶活性的组分，得到氯化钠浓度0. 1 0. 2M的活性组分2ml。重复进行同 样的操作，得到活性组分约6ml。使用Amicon Ultra-4 (MILLIP0RE公司制)浓缩该洗脱组分，并用含有0. 15M氯化 钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH7. 0)进行缓冲交换。使该浓缩液通过凝胶过滤柱[Superdex200 10/300GL(安发玛西亚生物技术公司制)][流动相含有0. 15M氯化钠的50mM磷酸钠缓冲 液(PH7. 0)]，作为具有还原酶活性的组分，得到分子量约35000道尔顿的洗脱组分1ml (以 下记为活性组分(A))。对于在层析等中得到的组分，通过以下操作来测定还原酶活性。将2- (2- (2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基_2_氧代乙酰胺3mg、通过层 析等得到的洗脱组分0. 2ml、NADPH 9mg、乙酸丁酯0. 15ml、100mM磷酸缓冲液(pH7. 0) 1. 5ml 混合，在30°C搅拌18小时。然后，在反应液中添加乙酸乙酯2ml后，离心分离，得到有机层。 在下述条件下通过液相色谱对该有机层进行含量分析测定。由2-(2-(2，5-二甲基苯氧基 甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺的残留量和(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯 基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺的生成量，求出还原酶活性。(含量分析条件)柱SUMICHIRAL0DS A-212流动相A液0. 三氟乙酸水溶液，B液含有0. 三氟乙酸的乙腈溶液时间(分钟) A液(％ ) B液(％ )080 202010 90301 9930. 180 20流量0.5ml/分钟柱温40°C检测290nm(2)来自本发明蛋白质的部分肽所具有的氨基酸序列的分析将通过上述操作得到的活性组分(A)按照Laemmli，U. K.，自然杂志，(1970)227，
17(伯乐公司制)染色，切出染色后的一部分凝胶。将该凝胶洗涤后，进行胰蛋白酶处理，从 凝胶中抽提肽。抽提出的肽通过HPLC (柱TSK gel 0DS_80Ts，2. OmmX 250mm(东曹株式会 社)，移动相A液(0. 三氟乙酸水)、B液(含有0. 09%三氟乙酸的90%乙腈水溶液)、 A/B = 100/0 — 0/100的浓度梯度)分段回收。利用蛋白质测序仪(Procise494HT型蛋白 测序系统)确定分段回收的各组分中每2个组分的氨基酸序列。已确定的氨基酸序列如序 列编号3或序列编号4所示。(3)来自本发明DNA的部分碱基序列的分析(之一))根据序列编号3所示的氨基酸序列，合成具有序列编号5所示的碱基序列的寡核 苷酸引物。另外，根据序列编号4所示的氨基酸序列，合成具有序列编号6所示的碱基序列 的寡核苷酸引物。 使用具有序列编号5及序列编号6所示的碱基序列的寡核苷酸引物，以所述染色 体DNA (A)为模板，在下述反应液组成和反应条件下进行PCR (使用罗氏诊断产品公司制造 的高保真 PCR 扩增系统(Expand HighFidelity PLUS PCR System))。[反应液组成]
染色体DNA(A)溶液2u 1
dNTP (各2. 5mM混合物)1 u 1
引物(50pmol/u 1)各 0. 4ii 1
5x缓冲液(含MgCl)10 u 1
expandHiFi 酶(5U/u 1)0. 5u 1
超纯水35. 7u 1
[反应条件]
将装有上述组成的反应液的容器设置于珀金埃尔默基因扩增PCR系统9700中，在
94°C加热2分钟后，以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (90秒)为1个循环进行10个循 环，接着以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (1分钟+5秒/循环)为1个循环进行20个 循环，再在72 °C保持7分钟。然后，取出一部分PCR反应液，进行琼脂糖凝胶电泳，结果检测到约600bp的DNA 片段的条带。将上述约600bp的DNA片段连接到pCR2. 1-T0P0载体中已有的“PCR产物插入位 点”(使用英杰公司制TOPO TA克隆试剂盒)中，用得到的连接液对大肠杆菌T0P10F’进行转化。在含有50y g/ml氨苄青霉素的LB(1 %细菌用胰蛋白胨、0. 5%细菌用酵母提取 物、氯化钠)琼脂培养基上，涂布5-溴-4-氯-3-吲哚基-3-D-半乳糖苷(以下记为 父飞￡11)4%水溶液30111及0.说的0^6 30 iil，将其上得到的转化体接种进行培养。在 形成的菌落中挑取1个白色菌落，将该菌落接种到含有50y g/ml氨苄青霉素的无菌LB培 养基(2ml)中，在试管中振荡培养(30°C、24小时)。使用QIApr印Spin Minipr印试剂盒 (Qiagen公司制)从培养菌体中取出质粒。对所得质粒中插入的DNA片段的碱基序列进行分析，确定了序列编号7所示的碱 基序列。需要说明的是，质粒中插入的DNA片段的碱基序列的分析，通过使用荧光标记终止物循环测序反应试齐ll盒(Dye Terminator Cycle sequencingFS ready Reaction Kit) (珀金埃尔默制)，以各质粒为模板进行测序反应，利用DNA测序仪373A(珀金埃尔默制) 分析得到的DNA的碱基序列来进行。(4)来自本发明DNA的部分碱基序列的分析(之二))根据序列编号7所示的碱基序列，合成了具有序列编号8所示的碱基序列的寡核 苷酸引物及具有序列编号9所示的碱基序列的寡核苷酸引物。另外，根据序列编号7所示 的碱基序列，合成了具有序列编号10所示的碱基序列的寡核苷酸引物及具有序列编号11 所示的碱基序列的寡核苷酸引物。使用具有序列编号8及序列编号9所示的碱基序列的寡核苷酸引物，以所述染色 体DNA(A)经限制性内切酶EcoRI处理后通过T4DNA连接酶进行自连接而成的DNA为模板， 在下述反应液组成和反应条件下进行PCR。另外，使用具有序列编号10及序列编号11所 示的碱基序列的寡核苷酸引物，以所述染色体DNA(A)经限制性内切酶EcoRV处理后通过 T4DNA连接酶进行自连接而成的DNA为模板，在下述反应液组成和反应条件下进行PCR(使
用罗氏诊断产品公司制造的高保真PCR扩增系统)。
[反应液组成]
染色体DNA(A)溶液2u 1
dNTP (各2. 5mM混合物)1 u 1
引物(50pmol/u 1)各 0. 4ii 1
5x缓冲液(含MgCl)10 u 1
expandHiFi 酶(5U/u 1)0. 5u 1
超纯水35. 7u 1
[反应条件]
将装有上述组成的反应液的容器设置于珀金埃尔默基因扩增PCR系统9700中，在
94°C加热2分钟后，以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (90秒)为1个循环进行10个循 环，接着以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (1分钟+5秒/循环)为1个循环进行20个 循环，再在72°C保持7分钟。然后，取出一部分PCR反应液，进行琼脂糖凝胶电泳，结果，在使用具有序列编号8 及序列编号9所示的碱基序列的寡核苷酸引物进行PCR后，检测到约600bp的DNA片段的 条带。另外，在使用具有序列编号10及序列编号11所示的碱基序列的寡核苷酸引物进行 PCR后，检测到约1300bp的DNA片段的条带。将上述约600bp、或约1300bp的DNA片段连接到pCR2. 1-T0P0载体中已有的“PCR 产物插入位点”(使用英杰公司制T0P0TM TA克隆试剂盒)中，用该连接液对大肠杆菌 TOP 1 OF，进行转化。在含有50 u g/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上涂布X_gal 4 %水溶液30 yl及 0. 1M的IPTG 30 yl，将其上得到的转化体接种进行培养。在形成的菌落中挑取1个白色菌 落，将该菌落接种到含有50 y g/ml氨苄青霉素的无菌LB培养基(2ml)中，在试管中振荡培 养(30°C、24小时)。使用QIApr印Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司制)，从各培养菌 体中取出质粒。对所得质粒中插入的DNA片段的碱基序列进行分析。根据所得碱基序列，确定对
19如下所述的蛋白质的氨基酸序列进行编码的碱基序列(序列编号2)，所述蛋白质为寡养单 胞菌(Stenotrophomonas sp.)SC_l 菌株(FERMBP-10785)所有，且其具有将 2-(2-(2，5-二 甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)不对称还原而优先产生(R)-2-(2-(2， 5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺的能力。进而根据该序列编号2确 定了该蛋白质的氨基酸序列(序列编号1)。需要说明的是，将序列编号1与序列编号3或序列编号4进行比较，结果可知，序 列编号3或序列编号4所示的氨基酸序列与序列编号1所示的氨基酸序列的一部分一致。
需要说明的是，质粒中插入的DNA片段的碱基序列的分析，通过使用荧光标记终 止物循环测序反应试剂盒(珀金埃尔默制)，以各质粒为模板进行测序反应，利用DNA测序 仪373A(珀金埃尔默制)分析得到的DNA的碱基序列来进行。实施例2 (本发明转化体的制造及还原反应例(之一))(1)本发明载体的制备根据序列编号2所示的碱基序列，合成了具有序列编号12所示的碱基序列的寡核 苷酸引物和具有序列编号13所示的碱基序列的寡核苷酸引物。以具有序列编号12所示的碱基序列的寡核苷酸引物和序列编号13所示的寡核苷 酸引物为引物，以所述染色体DNA(A)为模板，在下述反应液组成和反应条件下进行PCR(使 用罗氏诊断产品公司制造的高保真PCR扩增系统)。[反应液组成]染色体DNA (A)溶液2 μ 1dNTP (各 2. 5mM 混合物)1 μ 1引物(50ρπιο1/μ 1)各 0·4μ1
5χ 缓冲液(含 MgCl) 10 μ 1expandHiFi 酶(5U/ μ 1)0. 5 μ 1超纯水35. 7 μ 1将装有上述组成的反应液的容器设置于珀金埃尔默基因扩增PCR系统9700中，在 94°C加热2分钟后，以94°C (10秒)_65°C (30秒)_72°C (90秒)为1个循环进行10个循 环，接着以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (1分钟+5秒/循环)为1个循环进行20个 循环，再在72°C保持7分钟。然后，取出一部分PCR反应液，进行琼脂糖凝胶电泳，结果检测到约IOOObp的DNA 片段的条带。在剩余的PCR反应液中加入2种限制性内切酶(NcoI及XbaI)，对约IOOObp的DNA 片段进行双酶切，接着对酶消化后的DNA片段进行纯化。另一方面，将质粒载体pTrc99A(法玛西亚制)用2种限制性内切酶(NcoI及XbaI) 进行双酶切，对酶消化后的DNA片段进行纯化。将这些酶消化后的DNA片段混合，用T4DNA连接酶连接，用得到的连接液对大肠杆 菌DH5ci进行转化。得到的转化体用含有50μ g/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从长出的菌落 中随机挑选8个菌落。将该选出的菌落分别接种到含有50 μ g/ml氨苄青霉素的无菌LB培 养基(2ml)中，在试管中振荡培养(37°C、17小时)。使用QIApr印Spin Minipr印试剂盒(Qiagen公司制)，从各培养菌体中取出质粒。从已取出的质粒各取一部分，经NcoI和XbaI 2种限制性内切酶双酶切后，进行电泳，确认取出的6个质粒中插入有所述约IOOObp的DNA 片段(以下将该质粒记为质粒PTrcRs)。(2)本发明转化体的制备及还原反应例
使用质粒pTrcRs对大肠杆菌HBlOl进行转化。得到的转化体接种于含有0. 2mM的 IPTG和50 μ g/ml氨苄青霉素的无菌LB培养基(9ml)中，振荡培养(37°C、15小时)。离心分 离所得培养液，得到湿菌体约0. 12g。在得到的湿菌体中混合2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲 基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺1. 5mg、NADPH 6. 9mg、IOOmM磷酸缓冲液(ρΗ7· 0) 1. 5ml、 葡萄糖2. 7mg、乙酸丁酯0. 075ml，在30°C搅拌23小时。然后，在反应液中添加乙酸乙酯2ml 后进行离心分离，得到有机层。在下述条件下通过液相色谱对该有机层进行含量分析，结果 可知，生成了 2- (2- (2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺，其生成量相 对于反应中使用的2- (2- (2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺的量为 97.9%。另外，在下述条件下测定有机层中2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N_甲 基-2-羟基乙酰胺的光学纯度，结果(R)体为100% e. e.。(含量分析条件)柱SUMICHIRALODS A-212流动相A液0. 三氟乙酸水溶液，B液含有0. 三氟乙酸的乙腈溶液时间(分钟) A液(％ ) B液(％ )080 202010 90301 9930. 180 20流量0.5ml/ 分钟柱温40°C检测290nm(光学纯度测定条件)柱CHIRALCELOD-H流动相己烷2-丙醇=9 1分析时间50分钟流量0.5ml/ 分钟柱温40°C检测230nm实施例3 (本发明转化体的制造及还原反应例(之二))(1)为制备具有编码具有将氧化型β -尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸转换为还原型的 能力的蛋白质的氨基酸序列的碱基序列的基因进行的准备将巨大芽孢杆菌IF012108菌株在无菌的LB培养基IOOml中培养，得到菌体0. 4g。 使用Qiagen Genomic Tip (Qiagen公司制)，按照其附带的手册中记载的方法从该菌体中纯 化染色体DNA (以下记为染色体DNA (B))。(2)具有编码具有将氧化型β -尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力的蛋白质的氨基酸序列的碱基序列的基因的制备 根据生物化学杂志第264卷，第11期，6381-6385页(1989)中记载的巨大芽孢杆 菌IWG3来源的葡萄糖脱氢酶的序列，合成了具有序列编号14所示的碱基序列的寡核苷酸 引物和具有序列编号15所示的碱基序列的寡核苷酸引物。使用具有序列编号14所示的碱基序列的寡核苷酸引物和具有序列编号15所示的 碱基序列的寡核苷酸引物作为引物，以所述染色体DNA(B)为模板，在下述反应液组成、反 应条件下进行PCR(使用罗氏诊断产品公司制造的高保真PCR扩增系统)。[反应液组成]染色体DNA (B)原液Ιμ dNTP (各 2. 5mM 混合物) 0. 4 μ 1引物(20ρπιο1/μ 1)各 0·75μ1IOx 缓冲液(含 MgCl)5 μ 1
expandHiFi 酶(3. 5 X 103U/ml) 0. 375 μ 1超纯水41. 725 μ 1[PCR反应条件]将装有上述组成的反应液的容器设置于珀金埃尔默基因扩增PCR系统2400中，在 97°C加热2分钟后，以97V (15秒)_55°C (30秒)_72°C (1. 5分钟)为1个循环进行10个 循环，接着以97°C (15秒)-55°C (30秒)_72°C (1分钟+5秒/循环)为1个循环进行20 个循环，再在72 °C保持7分钟。然后，取出一部分PCR反应液，进行琼脂糖凝胶电泳，结果检测到约950bp的DNA 片段的条带。使用所得PCR反应液和英杰公司制造的TOPO TA克隆试剂盒Ver. E，将通过PCR而 得到的约950bp的DNA片段连接到pCR2. 1-T0P0载体中已有的“PCR产物插入位点”中，用 该连接液对大肠杆菌DH5 α进行转化。在含有50 μ g/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，涂布X_gal 4 %水溶液3. 0 μ 1 及0. IM的IPTG 30μ 1，将其上得到的转化体接种进行培养。在形成的菌落中挑取1个白色 菌落，将该菌落接种到含有50 μ g/ml氨苄青霉素的无菌LB培养基(2ml)中，在试管中振荡 培养(300C >24小时)。接着使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen公司制)从培养 菌体中取出质粒。将取出的质粒的一部分用限制性内切酶(EcoRI)消化，并进行电泳，由此 确认该质粒中插入有约950bp的DNA片段(以下将该质粒记为质粒pSD⑶H12)。对质粒pSDGDH12中插入的DNA片段的碱基序列进行分析。其结果如序列编号16 所示。需要说明的是，质粒中插入的DNA片段的碱基序列的分析，通过使用荧光标记终 止物循环测序反应试剂盒(珀金埃尔默制)以质粒PSDGDH12为模板进行测序反应，利用 DNA测序仪373A(珀金埃尔默制)分析得到的DNA的碱基序列来进行。接着，根据序列编号16所示的碱基序列，合成了具有序列编号17和序列编号18 所示的碱基序列的寡核苷酸引物。使用具有序列编号17和序列编号18所示的碱基序列的寡核苷酸引物，以所述染 色体DNA (B)为模板，在下述反应液组成和反应条件下进行PCR (使用罗氏诊断产品公司制造的高保真PCR扩增系统)。[反应液组成]染色体DNA (B)原液Ιμ dNTP (各 2. 5mM 混合物)0.4 μ 1引物(20ρπιο1/μ 1)各 0·75μ1IOx 缓冲液(含 MgCl)5 μ 1expandHiFi 酶(3. 5 X 103U/ml) 0. 375 μ 1超纯水41. 725 μ 1[PCR反应条件]将装有上述组成的反应液的容器设置于珀金埃尔默基因扩增PCR系统2400中，在 97°C加热2分钟后，以97V (15秒)_55°C (30秒)_72°C (1. 5分钟)为1个循环进行10个 循环，接着以97°C (15秒)-55°C (30秒)_72°C (1分钟+5秒/循环)为1个循环进行20 个循环，再在72 °C保持7分钟。然后，取出一部分PCR反应液，进行琼脂糖凝胶电泳，结果检测到约SOObp的DNA 片段的条带。在剩余的PCR反应液中2种限制性内切酶(NcoI及BamHI)，对约800bp的DNA片 段进行双酶切，接着对酶消化后的DNA片段进行纯化。另一方面，将质粒载体pTrc99A(法玛西亚制)用2种限制性内切酶(NcoI及 BamHI)进行双酶切，对酶消化后的DNA片段进行纯化。将这些酶消化后的DNA片段混合，用T4DNA连接酶连接，用得到的连接液对大肠杆 菌DH5ci进行转化。得到的转化体用含有50μ g/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从长出的菌落 中随机挑选10个菌落。将该选出的菌落分别接种到含有50 μ g/ml氨苄青霉素的无菌LB 培养基(2ml)中，在试管中振荡培养(37°C、17小时)。使用QIApr印Spin Minipr印试 剂盒(Qiagen公司制)从各培养菌体中取出质粒。对取出的质粒各取一部分，经NcoI和 BamHI 2种限制性内切酶双酶切后进行电泳，确认已取出的质粒中有4个质粒中插入有所 述约800bp的DNA片段(以下将该质粒记为质粒pTrc⑶H)。(3)本发明载体的制备以具有序列编号19所示的碱基序列的寡核苷酸引物和序列编号12所示的寡核苷 酸引物作为引物，以质粒PTrcRs为模板，在下述反应液组成和反应条件下进行PCR(使用罗 氏诊断产品公司制造的高保真PCR扩增系统)。[反应液组成]质粒 pTrcRs2 μ 1dNTP (各 2. 5mM 混合物)1 μ 1引物(50ρπιο1/μ 1)各 0·4μ15χ 缓冲液(含 MgCl)10 μ 1高保真扩增Taq PLUS聚合酶 0. 5 μ 1 (2. 5U)超纯水35. 7 μ 1[反应条件]
将装有上述组成的反应液的容器设置于珀金埃尔默基因扩增PCR系统9700中，在 94°C加热2分钟后，以94°C (10秒)_65°C (30秒)_72°C (90秒)为1个循环进行10个循 环，接着以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (1分钟+5秒/循环)为1个循环进行20个 循环，再在72°C保持7分钟。然后，取出一部分PCR反应液，进行琼脂糖凝胶电泳，结果检测到约IOOObp的DNA 片段的条带。在剩余的PCR反应液中加入2种限制性内切酶(BamHI和XbaI)，对约IOOObp的 DNA片段进行双酶切，接着对酶消化后的DNA片段进行纯化。另一方面，将质粒pTrc⑶H用2种限制性内切酶(BamHI和XbaI)进行双酶切，对酶消化后的DNA片段进行纯化。将分别经酶消化的DNA片段用T4DNA连接酶连接，用该连接液对大肠杆菌DH5 α 进行转化。得到的转化体用含有50 μ g/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，从长出的菌落 中随机挑选6个菌落。将该选出的菌落分别接种到含有50 μ g/ml氨苄青霉素的无菌LB培 养基(2ml)中，在试管中振荡培养(30°C、17小时)。使用QIApr印Spin Minipr印试剂盒 (Qiagen公司制)从各培养菌体中取出质粒。从已取出的质粒各取一部分，经BamHI和XbaI 2种限制性内切酶双酶切后，进行电泳，由此确认已取出的质粒中全部插入有约IOOObp的 目标DNA片段(以下将该质粒记为质粒pTrcGSRs)。(4)本发明转化体的制备及还原反应例使用质粒pTrcGSRs对大肠杆菌HBlOl进行转化。得到的转化体接种于含有0. 2mM 的IPTG和50 μ g/ml氨苄青霉素的无菌LB培养基(5ml)中，振荡培养(30°C、24小时)。离 心分离所得培养液，得到湿菌体约0. Igo在得到的湿菌体中混合2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基 甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺3mg、NADP+L 8mg、IOOmM磷酸缓冲液(ρΗ7· 0) 1. 5ml、 葡萄糖2.8mg、四氢呋喃0. 15ml，在30°C搅拌24小时。然后，在反应液中添加乙酸乙酯2ml 后进行离心分离，得到有机层。在下述条件下通过液相色谱对该有机层进行含量分析，结果 可知，生成了相对于反应中使用的2-(2-(2，5_二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代 乙酰胺的量为96. 8%的2-(2-(2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)_N_甲基-2-羟基乙酰胺。 另外，在下述条件下测定有机层中2-(2-(2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羟 基乙酰胺的光学纯度，结果(R)体为100% e. e.。(含量分析条件)柱SUMICHIRALODS A-212流动相A液0. 三氟乙酸水溶液，B液含有0. 三氟乙酸的乙腈溶液时间(分钟) A液(％ ) B液(％ )080 202010 90301 9930. 180 20流量0.5ml/分钟柱温40°C检测290nm
(光学纯度测定条件)柱CHIRALCELOD-H流动相己烷2-丙醇=9 1分析时间50分钟流量0.5ml/ 分钟
柱温40°C检测:230nm实施例4 (本发明转化体的还原反应例(之三))使用质粒pTrcRs对大肠杆菌HBlOl进行转化。得到的转化体接种于含有0. ImM 的IPTG和50 μ g/ml氨苄青霉素的无菌LB培养基(5ml)中，振荡培养(371、15小时)。离 心分离所得培养液，得到湿菌体约0. Igo在得到的湿菌体中混合2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基 甲基)苯基)-2-氧代乙酸甲酯3mg、NADPH 13. 5mg、IOOmM磷酸缓冲液(ρΗ7· 0) 1. 5ml、乙酸 丁酯0. 15ml，在30°C搅拌24小时。然后，在反应液中添加乙酸乙酯2ml后进行离心分离， 得到有机层。在下述条件下通过液相色谱对该有机层进行含量分析，结果可知，生成了相对 于反应中使用的2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-2_氧代乙酸甲酯的量为28.8% 的2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-2_羟基乙酸甲酯。另外，在下述条件下测定有 机层中2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-2_羟基乙酸甲酯的光学纯度，结果(R)体 为 100% e. e.。(含量分析条件)柱SUMICHIRALODS A-212流动相A液0. 三氟乙酸水溶液，B液含有0. 三氟乙酸的乙腈溶液时间(分钟) A液(％ ) B液(％ )080 202010 90301 9930. 180 20流量0.5ml/分钟柱温40°C检测290nm(光学纯度测定条件)柱CHIRALCELOD-H流动相己烷2-丙醇=9 1分析时间50分钟流量0.5ml/ 分钟柱温40°C检测:230nm实施例5 (本发明蛋白质的各种性质)(1)本发明蛋白质的制备使用质粒pTrcRs对大肠杆菌HBlOl进行转化。得到的转化体接种于含有0. ImM的IPTG和SOyg/ml氨苄青霉素的无菌LB培养基(100mlX8)中，振荡培养(37 °C、 13.5小时)。离心分离所得培养液，得到湿菌体约5. 4g。将湿菌体约5.4g悬浮于20mM 磷酸钾缓冲液(PH7. 0) 20ml中，用Multi-Beads Shocker (安井器械公司制，玻璃珠 0. Imm0,2500rpm,20分钟)破碎。离心分离(8000rpm、4°C、10分钟)所得破碎液，再将 上清用过滤器(0.45μπι)过滤，得到离心上清液约18ml。所得离心上清液使用Amicon Ultra-4(MILLIP0RE公司制)浓缩，得到约4ml的离心上清浓缩液。使得到的离心上清浓缩液约4ml在亲和层析柱[HiTrap BlueHP (安发玛西亚生物 技术公司制)][用20mM磷酸钾缓冲液(pH7. 0)平衡]上展开，以溶解有氯化钠的磷酸钾缓 冲液(氯化钠浓度0 — 1. 2M的浓度梯度)作为流动相进行洗脱，作为具有还原酶活性的组 分，得到氯化钠浓度0. 01 0. 34M的组分约6ml。使用Amicon Ultra-4 (MILLIP0RE 公司制)浓缩该洗脱组分，并用20mM Tris-HCl 缓冲液(PH7. 5)进行缓冲交换。将该浓缩液在离子交换层析柱[HiTrap DEAE Sepharose FF(安发玛西亚生物技术公司制)][用Tris-HCl缓冲液(20mM、pH7. 5)平衡]上展开，以 溶解有氯化钠的Tris-HCl缓冲液(氯化钠浓度O — 0. 5M的浓度梯度)作为流动相进行洗 脱，作为具有还原酶活性的组分，得到氯化钠浓度0. 1 0. 2M的活性组分2ml。使用Amicon Ultra-4(MILLIP0RE公司制)浓缩该洗脱组分，并用含有0. 15M 氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)进行缓冲交换。使该浓缩液通过凝胶过滤柱 [SuperdeX20010/300GL(安发玛西亚生物技术公司制)][流动相含有0. 15M氯化钠的 50mM磷酸钠缓冲液(ρΗ7. 0)]，作为具有还原酶活性的组分，得到分子量约32200道尔顿的 洗脱组分Iml (以下记为活性组分(C))。另外，关于在层析等中得到的组分，通过以下操作来测定还原酶活性。将2-(2-(2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)_N_甲基_2_氧代乙酰胺3mg、通过层 析等得到的洗脱组分0. 2ml,NADPH 9mg、乙酸丁酯0. 15ml、IOOmM磷酸缓冲液(ρΗ7. 0) 1. 5ml 混合，在30°C搅拌18小时。然后，在反应液中添加乙酸乙酯2ml后，离心分离，得到有机层。 在下述条件下通过液相色谱对该有机层进行含量分析测定。由2-(2-(2，5-二甲基苯氧基 甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺的残留量和(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯 基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺的生成量，求出还原酶活性。(含量分析条件)柱SUMICHIRALODS A-212流动相A液0. 三氟乙酸水溶液，B液含有0. 三氟乙酸的乙腈溶液时间(分钟)A液(％ ) B液(％ )080 202010 90301 9930. 180 2流量0.5ml/ 分钟柱温40°C检测290nm(2)本发明蛋白质的酶化学性质
使用活性组分(C)考察本发明蛋白质的酶化学性质。(1)作用以NADPH为辅酶，作用于2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯基)_N_甲基_2_氧 代乙酰胺，将其还原成光学纯度为100% e.e.的(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯 基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺。(2)最适 pH为考察作用最适pH，测定了 pH5.5 pHIO下的苯甲酰甲酸乙酯还原活性。作为 缓冲液，使用IOOmM磷酸缓冲液(pH5. 5 8)、100mM Tris-HCl缓冲液(pH7 9)和IOOmM Tris-甘氨酸缓冲液(pH9 10)。关于相对于苯甲酰甲酸乙酯的还原活性，在各种缓冲液 中溶解底物苯甲酰甲酸乙酯和辅酶NADPH，并使其终浓度分别为IOmM和0. 5mM，再添加已纯 化的本发明蛋白质(活性组分(C))，在30°C进行反应1分钟，从此时该反应液在波长340nm 下吸光度的减小速度算出对苯甲酰甲酸乙酯的还原活性。在本反应条件中，将1分钟内使 1 μ mol的NADPH氧化为NADP的活性定义为1个单位。结果，最适pH为7. 0。(3)底物特异性在IOOmM磷酸缓冲液(pH7)中溶解作为底物的羰基化合物和辅酶NADPH，并使其终 浓度分别为ImM和0.5mM。在其中添加已纯化的本发明蛋白质(活性组分(C))适当量，在 30°C进行反应5分钟。从该反应液在波长340nm下吸光度的减小速度算出对各羰基化合物 的还原活性，以对苯甲酰甲酸乙酯的活性为100%，将各还原活性的相对值示于表1。表 1 实施例6 (本发明转化体的还原反应例(之四))(1)2-(2-甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯的合成在四氢呋喃50g和镁7. 3g的混合液中添加2_溴甲苯4. 4g，使镁活化。升温到 40°C，滴加2-溴甲苯45g的四氢呋喃(130g)溶液，一直滴加到确认2-溴甲苯消失。然后，冷却到室温，制备Grignard试剂。将草酸二乙酯83g的甲苯(170g)溶液冷却到_40°C以下。在_40°C以下滴加上述 制备的Grignard试剂后，进一步在_40°C下保温2小时。在反应混合物中添加10%硫酸 234g后，回收有机层。将得到的有机层用水134g洗涤后，用硫酸镁干燥。用蒸发器浓缩后，进一步在高真空下蒸馏，并进行硅胶柱纯化，得到33. Ig的2-(2-甲基苯基)-2-氧代乙酸乙酯。1H-NMR (300MHz, CDCl3) δ ppm 1. 41 (t、J = 7. 2Hz、3H)、2. 61 (s、3H)、
4.39-4. 47 (m、2H)、7. 26-7. 70 (m、4H)(2) 2-(2-甲基苯基)-N-甲基_2_氧代乙酰胺的合成将(1)中得到的2-(2_甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯18.化与甲苯728、甲醇368 混合，保温于25°C的同时添加40%甲胺水溶液23. 2g，在25°C下保温1小时。然后，添加水 36. 2g后，回收有机层。分别用5%盐酸143g、饱和碳酸氢钠水溶液36g、水36g洗涤后，用硫 酸镁干燥。用蒸发器浓缩后，进一步进行硅胶柱纯化，得到11. 4g的2-(2_甲基苯基)-N-甲 基-2-氧代乙酰胺。1H-NMR (300MHz、CDCl3) δ ppm 2. 48 (s、3H)、2. 96 (d、J = 5· 13Ηζ、3Η)、7· 1 (6s、 1H)、7. 25-7. 93(m、4H)(3)使用本发明转化体的2-(2-甲基苯基)-N-甲基_2_氧代乙酰胺的不对称还原使用质粒pTrcGSRs对大肠杆菌HBlOl进行转化。得到的转化体接种于含有0. ImM 的IPTG和50 μ g/ml氨苄青霉素的无菌LB培养基(IOOml)中，振荡培养(37°C、15小时)。离 心分离所得培养液，得到湿菌体约0. 5g。在反应管中添加2-(2-甲基苯基)-N-甲基-2-氧 代乙酰胺30mg、所述湿菌体约0. 5g、NADP+30mg、葡萄糖45mg、IOOmM磷酸缓冲液(pH7) 5ml, 以IOOOrpm的搅拌速度在30°C下反应24小时。反应结束后，在反应液中添加乙酸乙酯 5ml，然后离心分离(1000Xg、5分钟)，由此回收有机层。蒸馏除去该有机层，得到油状的 2- (2-甲基苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺22. 5mg。得到的2- (2-甲基苯基)-N-甲基-2-羟 基乙酰胺的1H-NMR分析结果如下所示。1H-NMR(300MHz、CDCl3) σ 2. 37 (S、3H)、2. 79 (d、J = 4. 96Hz、3H)、3· 87 (IH)、
5.15 (SUH) ,6. 21(S、1H)、7. 15-7. 26(m、4H)在得到的2-(2_甲基苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺中添加含有2_丙醇10%的 己烷，在下述条件下通过液相色谱进行光学纯度分析，结果光学纯度为100% e. e.(洗脱时 间22· 5分钟)。需要说明的是，外消旋体的2-(2_甲基苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺，通过将 2-(2-甲基苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺在甲醇中用NaBH4还原而合成。(光学异构体分析条件)柱CHIRALPAKOD-H(Daieel 化学工业公司制)流动相己烷/2-丙醇=90/10流量0.5ml/ 分钟柱温40°C检测230nm洗脱时间
2-(2-甲基苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺16. 0分钟2-(2-甲基苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺18. 5分钟、22. 4分钟实施例7 (本发明转化体的还原反应例(之五)) 除使用2-(2_甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯作为底物以外，通过与实施例6(3)中 记载的方法相同的方法进行反应。结果，得到油状的2-(2_甲基苯基)-2_羟基乙酸乙酯 26. 5mg。得到的2-(2-甲基苯基)-2-羟基乙酸乙酯的1H-NMR分析结果如下所示。1H-Wr(SoomHzJDCI3) σ 1. 21 (t、J = 7. 2Ηζ、3Η)、2· 43 (S、3H)、3· 56 (d、J = 7. 7Hz、 1Η)、4. 13-4. 29(m、2H)、5. 35 (SUH)、7. 15-7. 30(m、4H)在得到的2- (2-甲基苯基)-2-羟基乙酸乙酯中，添加含有2-丙醇10 %的己烷，在 下述条件下通过液相色谱进行光学纯度分析，结果光学纯度为99% e. e.(洗脱时间13.3 分钟)。需要说明的是，外消旋体的2-(2_甲基苯基)-2_羟基乙酸乙酯，通过将2-(2_甲 基苯基)-2-氧代乙酸乙酯在甲醇中用NaBH4还原而合成。(光学异构体分析条件)柱CHIRALPAKOD-H(Daieel 化学工业公司制)流动相己烷/2-丙醇=90/10流量0.5ml/分钟柱温40°C检测230nm洗脱时间2-(2-甲基苯基)-2-氧代乙酸乙酯8.9分钟2-(2-甲基苯基)-2-羟基乙酸乙酯11.6分钟、13. 3分钟实施例8 (本发明转化体的还原反应例(之六))(1)2-(2-甲氧基甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯的合成将28 %甲醇钠的甲醇溶液59. 8g升温至60 V，滴加邻溴苄基溴70. 4g和甲醇 70. 4g的混合液，在60°C保温2小时。冷却到室温后，添加甲苯211g和水211g并搅拌，分 液后回收有机层。水层用甲苯211g萃取3次，加入回收的有机层和水211g，洗涤后浓缩，得 到55. 3g的1-甲氧基甲基-2-溴苯。在四氢呋喃46. 4g和镁5. 4g的混合液中添加1_甲氧基甲基_2_溴苯4. 6g，使镁 活化。升温至40°C，滴加1-甲氧基甲基-2-溴苯41. 7g的四氢呋喃(139g)溶液，一直滴加 到确认1-甲氧基甲基-2-溴苯消失。然后，冷却到室温，制备Grignard试剂。将草酸二乙酯64. 4g的甲苯(177g)溶液冷却到_40°C以下。在_40°C以下滴加上 述制备的Grignard试剂后，进一步在_40°C保温4小时。在反应混合物中添加10%硫酸 211g后，回收有机层。得到的有机层用水133g洗涤后，用硫酸镁干燥。用蒸发器浓缩后，进 行硅胶柱纯化，进一步在高真空下蒸馏，得到38. 5g的2-(2-甲氧基甲基苯基)-2-氧代乙 酸乙酯。1H-NMR(300MHz, CDCl3) δ ppm 1. 41 (t, J = 7. 08Hz、3H)、3. 44 (s、3H)、4. 41 (q、 2H)、4. 75 (s、2H)、7. 55-7. 69 (m、4H)(2) 2-(2-甲氧基甲基苯基)-N-甲基_2_氧代乙酰胺的合成
将(1)中得到的2-(2_甲氧基甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯28.3g与甲苯109g、 甲醇54. 4g混合，保温于25°C的同时添加40%甲胺水溶液28. 6g，在25°C保温2小时。然 后，添加水54. 4g后，补充添加甲苯80g，静置后回收有机层。分别用5%盐酸178g、饱和碳 酸氢钠水溶液54. 4g、水54. 4g洗涤后，用蒸发器浓缩，得到12. Og的2_(2_甲氧基甲基苯 基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺。 1H-NMR(300MHz、CDCl3) δ ppm 2. 95 (d、J = 5. 14Ηζ、3Η)、3· 28(s、3H)、4· 66 (s、 2H)、7. 04 (s、1H)、7. 36-7. 72 (m、4H)(3)使用本发明转化体的2-(2-甲氧基甲基苯基)-N-甲基_2_氧代乙酰胺的不对 称还原除使用2-(2_甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺作为底物以外，通过与 实施例6(3)中记载的方法相同的方法进行反应。结果，得到油状的2-(2_甲氧基甲基苯 基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺19. 5mg。得到的2- (2-甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-羟基乙 酰胺的1H-NMR分析结果如下所示。1H-NMR (300MHz、CDCl3) σ 2. 77 (d、J = 4· 85Ηζ、3Η)、3· 47 (S、3H)、4· 38 (d、 J = 10. 6Ηζ、1Η)、4· 73(d、J = 10. 6Hz、1Η)、4· 81 (S、1Η)、5· 23 (S、1Η)、7· 16 (S、1Η)、 7. 26-7. 43(m、4H)在得到的2-(2-甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺中，添加含有2-丙 醇10 %的己烷，在下述条件下通过液相色谱进行光学纯度分析，结果光学纯度为100 % e. e.(洗脱时间20. 3分钟)。需要说明的是，外消旋体的2-(2_甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺，通 过将2-(2_甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺在甲醇中用NaBH4还原而合成。(光学异构体分析条件)柱CHIRALPAKOD-H(Daieel 化学工业公司制)流动相己烷/2-丙醇=90/10流量0·5ml/ 分钟柱温40°C检测:230nm洗脱时间2-(2-甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺18. 5分钟2_(2_甲氧基甲基苯 基)-N-甲基-2-羟基乙酰胺20. 4分钟、21. 0分钟实施例9 (本发明转化体的还原反应例(之七))除使用2-(2_甲氧基甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯作为底物以外，通过与实施例 6(3)中记载的方法相同的方法进行反应。结果，得到油状的2-(2_甲氧基甲基苯基)-2_羟 基乙酸乙酯27. 6mg。得到的2-(2_甲氧基甲基苯基)_2_羟基乙酸乙酯的1H-NMR分析结果 如下所示。1H-NMR(300MHz, CDCl3) σ 1. 21 (t, J = 7· 09Ηζ、3Η)、3· 39 (S、3H)、4· 16-4. 26 (m、 2H)、4. 59 (d、J = 6. 36Hz、2H)、5. 39 (SUH)、7. 31-7. 37(m、4H)在得到的2-(2-甲氧基甲基苯基)-2_羟基乙酸乙酯中添加含有2-丙醇10%的 己烷，在下述条件下通过液相色谱进行光学纯度分析，结果光学纯度为100% e. e.(洗脱时间13. 6分钟)。需要说明的是，外消旋体的2-(2_甲氧基甲基苯基)-2_羟基乙酸乙酯，通过将 2-(2-甲氧基甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯在甲醇中用NaBH4还原而合成。
(光学异构体分析条件)柱CHIRALPAKOD-H(Daieel 化学工业公司制)流动相己烷/2-丙醇=90/10流量0·5ml/ 分钟柱温40°C检测:230nm洗脱时间2-(2-甲氧基甲基苯基)-2-氧代乙酸乙酯9. 3分钟2-(2-甲氧基甲基苯基)-2_羟基乙酸乙酯12. 8分钟、13. 6分钟工业上的可利用性根据本发明，能够容易地得到光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物。序列表纯文本序列编号5为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号6为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号8为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号9为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号10为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号11为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号12为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号I3为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号14为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号I5为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号I7为PCR设计的寡核苷酸引物序列编号I8为PCR设计的寡核苷酸引物
序列编号I9 为PCR设计的寡核苷酸引物
权利要求
一种由下述a)～d)中的任何碱基序列构成的DNA，a)编码用序列编号1表示的氨基酸序列的碱基序列；b)i)相对于由编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA具有至少90％序列同源性的DNA的碱基序列，并且ii)是对如下所述蛋白质的氨基酸序列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物的能力；c)i)在严格条件下与由编码序列编号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA杂交的DNA的碱基序列，并且ii)是对如下所述蛋白质的氨基酸序列进行编码的碱基序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸的酰胺或酯化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物的能力；和d)用序列编号2表示的碱基序列。
2.—种DNA，其特征在于，以能够发挥功能的形式将能够在宿主细胞内发挥功能的启 动子与权利要求1所述的DNA连接而形成。
3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1或2所述的DNA。
4.一种转化体，其特征在于，通过将权利要求2所述的DNA或权利要求3所述的重组载 体导入宿主细胞而形成。
5.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为微生物。
6.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌。
7.一种转化体，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA。
8.一种转化体的制造方法，其特征在于，包括将权利要求3所述的重组载体导入宿主 细胞的步骤。
9.一种由下述a) e)中的任何氨基酸序列构成的蛋白质，a)用序列编号1表示的氨基酸序列；b)i)相对于由序列编号2所示的碱基序列构成的DNA具有至少90%序列同源性的DNA 的碱基序列所编码的氨基酸序列，并且ii)是如下所述的蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白 质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯 乙醇酸化合物的能力；c)i)在严格条件下与由序列编号2所示的碱基序列构成的DNA杂交的DNA的碱基序列 所编码的氨基酸序列，并且ii)是如下所述的蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质具有将邻 位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合 物的能力；d)i)用序列编号1表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加1个或多个氨基酸的氨基酸 序列，并且ii)是如下所述的蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛 酸化合物不对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和e)i)与序列编号1所示的氨基酸序列的序列同源性至少为90%的氨基酸序列，并且 ii)是如下所述的蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质具有将邻位取代的苯乙醛酸化合物不 对称还原来生产对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的能力。
10.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA和具有对如下所述蛋白质 的氨基酸序列进行编码的碱基序列的DNA，所述蛋白质具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力。
11.根据权利要求10所述的重组载体，其特征在于，所述具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸或氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力的蛋白质为葡 萄糖脱氢酶。
12.根据权利要求11所述的重组载体，其中，所述具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质为 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的葡萄糖脱氢酶。
13.一种转化体，其特征在于，通过将权利要求10 12所述的重组载体导入宿主细胞 而得到。
14.根据权利要求13所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为微生物。
15.根据权利要求13所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌。
16.一种转化体，其特征在于，包含权利要求1所述的DNA和具有对如下所述蛋白质的 氨基酸序列进行编码的碱基序列的DNA，所述蛋白质具有将氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸或氧化型β“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸转换为还原型的能力。
17.一种光学活性醇的制造方法，其特征在于，使权利要求9所述的蛋白质、或权利要 求4 7、13 16中任一项所述的转化体、或其处理物，与前手性羰基化合物反应。
18.根据权利要求17所述的制造方法，其中，前手性羰基化合物为邻位取代的苯乙醛 酸的酰胺或酯化合物，对应的光学活性的醇化合物为光学活性的邻位取代的苯乙醇酸的酰 胺或酯化合物。
19.根据权利要求18所述的制造方法，其中，邻位取代的苯乙醛酸的酰胺或酯化合物 为式(1)所示的化合物，光学活性的邻位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物为式(2)所示 的光学活性化合物， 式(1)中，R1表示可被取代的氨基或可被取代的烷氧基，R2表示可被取代的C1-8烷基， 式(2)中，礼和1 2表示与上述相同的含义，带*标记的碳原子为手性碳原子。
20.寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.) SC-I (FERM BP-10785)。
全文摘要
本发明提供能够将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原而在工业上有利地制造对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物的蛋白质、编码该蛋白质的DNA、从该DNA制造该蛋白质的方法以及使用该蛋白质将邻位取代的苯乙醛酸化合物不对称还原从而制造对应的光学活性的邻位取代的苯乙醇酸化合物的方法等。
文档编号C12N1/19GK101849000SQ200880016678
公开日2010年9月29日 申请日期2008年3月24日 优先权日2007年3月22日
发明者朝子弘之 申请人:住友化学株式会社