专利名称：一种快速检测微生物的测试片及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品微生物学安全检验检测领域，具体地说，涉及一种快速检测微生物的测 试片及其制备方法和应用。
背景技术：
现行国家食品卫生微生物检测标准方法的操作步骤繁琐，在检测微生物前后，需要配置 培养基、清洗培养器皿、灭菌、增菌、培养时间长等，同时对实验员和实验室的要求高。在 当今日益加快的商业贸易步伐下,传统检测方法已不能满足食品生产经营企业、进出口商检、 政府管理部门的检测需要。
测试片以纸片、冷水可凝凝胶和无纺布等作为培养基载体来测定食品中微生物的含量， 与国标方法比较，最大优点是省却了繁重的准备工作；检样不需要增菌，直接接种测试片， 适宜温度培养后计数，使用后经灭菌便可弃置，简单方便，縮短检测时间。
然而，测试片的培养基载体对检测效果有重要影响，目前滤纸、凝胶和无纺布是三种主 流载体。以滤纸为载体的测试片制作工艺简单，材料便宜，但滤孔过大，容易双面有菌落生 长而无法准确计数；对检测有油脂食品，滤纸吸收较慢，难以扩散使样品液分布均匀；以无 纺布为载体的测试片，具有使样液迅速地均匀扩散优点，但因其不透明且无纺布层较厚，载 体下层菌落不能计数导致回收率稍低。美国3M公司的petrifilm的凝胶测试片，因片上层覆 盖一层薄膜，当细菌产气、产粘液过多时会出现菌落扩散、融合的现象、影响计数；另因凝 胶吸水速度较慢，样液易溢出培养基范围外，影响回收率。目前市场上的测试片均不透明， 不能正反两面数菌以免遗漏，并且难通过自动数菌器计数；此外，除3M公司的petrifilm测 试片外，各类产品均不能进行下一步挑菌鉴定。
因此，研发快速，准确，简便，能进行分离鉴定的微生物测试片，对我国的快速检测食 品微生物安全具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方便携带、使用简便、测试时间短、结果准确、可双面数菌， 用于微生物检测的一次性测试片，并提供所述测试片的制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案一种快速检测微生物的测试片，该测试片包括底板、中间镂空的胶片和塑料膜，中间镂 空的胶片的底面与底板粘合，胶片中间镂空部分形成凹槽培养区，所述凹槽培养区内置有显 色培养基；所述塑料膜的底面粘合有冷水可凝的凝胶剂，所述塑料膜的底面与胶片的上表面 在一侧边缘粘合。
优选的，所述底板和胶片长宽一致；优选的，所述塑料膜与所述胶片的宽度一致，所述 塑料膜的长度大于所述胶片的长度。
为了分辨不同的检验样品，明确检验时间，最好在所述塑料膜上粘合一张标签，标签上 留有样品名和检验时间的填写栏。
所述塑料膜和底板均由防水透气、透明、无毒的聚乙烯塑料薄膜制备而成。塑料膜厚度 为0.03~0.1 mm，长度为9~13 cm，宽度为7.0~11.0 cm。底板厚度为0.03—0.25 mm，长度为 8.CM2.0cm,宽度为7.0~11.0 cm。
所述胶片由透明、防渗透、质量轻的聚对苯二甲酸类塑料制备而成。厚度为0.3~0.5 mm， 长度为8.0 12.0 cm，宽度为7.0~11.0 cm，中间凹槽培养区是直径为4 7 cm的圆形。
所述显色培养基是待测菌相应的商品培养基，由营养物质、诱导剂和显色剂组成，用量 为1.5~4.0xl0-3g/cm2。
所述冷水可凝的凝胶剂为多糖类，用量为1.0~4.0xl0—3g/cm2。
本发明测试片底板和胶片、胶片和塑料膜、显色培养基和冷水可凝的凝胶剂都采用聚丙 烯酸树脂压敏胶进行粘合。
一种制备快速检测微生物的测试片的方法，包括以下步骤
1) 按要求剪裁底板、中间镂空的胶片和塑料膜；
2) 粘合底板和胶片的底面得到凹槽培养区，将显色培养基粘合在凹槽培养区内；
3) 将冷水可凝的凝胶剂粘合在塑料膜的底面；
4) 将胶片的上表面与塑料膜的底面在一侧边缘粘合；
5) 辐照灭菌，封装。
所述辐照采用Co-60Y射线，辐射剂量3K 5KGy。
本发明所述测试片在检测食源性致病微生物中的应用，包括测定菌落总数、检测大肠杆 菌、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌等。 本发明所述的测试片的使用步骤为
1) 翻开上层塑料膜；
2) 滴加lml样品液于中间圆形镂空凹槽培养区；
43) 盖上塑料膜；如样品液未能均匀分散，可用手把样品液推平；
4) 经过合适温度培养，根据菌落显示颜色，选取跟菌落颜色对比较大的计数板组件作 为背景，置于测试片的任一面计数，或直接置于自动菌落计数器中计数。
其中计数板组件为铜版纸材料，有黄、白、黑三种颜色。网格大小为lxlcm,厚度为 0.03~0.25 mm，长度为9~13 cm，宽度为7.0~11.0 cm。
本发明所述的快速检测微生物的测试片，具有以下有益效果
操作简单，适用缺少专业检验人员的单位携带方便，不受环境条件限制；培养时占空 间小；全片透明，可双面数菌避免菌落遗漏；可用于自动数菌器计数，省时高效。
图1是本发明快速检测微生物的测试片的示意图； 图2是图l测试片的侧视图3是本发明快速检测微生物的测试片配套计数板的示意图； 图4是图3计数板的侧视附图标记1:标签；2:塑料膜；3胶片；4:底板。
具体实施例方式
以下通过具体实施例来说明本发明。 实施例l:本发明快速测定微生物菌落总数测试片的制备 包括以下步骤
1) 剪裁各部件，塑料膜长宽为10.5x7.5 cm;底板和胶片长宽均为9.5x7.5 cm;中间镂空 的胶片底面与底板粘合形成直径为6cm的圆形凹槽培养区；
2) 把微生物生长需要的营养琼脂粉末6g和0.2gTTC混合，将0.06g混合粉末通过压敏胶 粘合在凹槽培养区内；
3) 把聚丙烯酸树脂压敏胶加热成液体，均匀喷在塑料膜的底面，将0.3g冷水可凝的凝胶 剂粉末粘合在塑料膜的底面；
4) 将塑料膜的底面与胶片的上表面在一侧边缘通过压敏胶粘合，粘合面积为7.5xl.0cm;
5) Co-60y射线，辐照剂量为5KGy灭菌；
6) 包装备用。
5实施例2:利用实施例l测试片测定菌落总数，并和国际平板倾注法比较
1) 制备混合菌液挑取大肠杆菌(&c/2er/cWa co// 8099)、鼠伤寒沙门氏菌(SWwo"e/Zfl 0^"' CMCC 50115)、金黄色葡萄球菌(Sto/ / ;;/ococcM awe肌ATCC 6538)、金黄色葡萄球菌 (S啤ty/ococcw az/re船CMCC 26003)、铜绿假单胞菌(i^eMffo附owos aerag/wora ATCC 9027) 菌苔分别接种到5ml营养肉汤中，37'C培养18-24h后，各取lml于一支无菌试管中得到 混合菌液，调整浓度约为10Scell/ml并用生理盐水进行10倍梯度稀释到104、 103、 102、 101、 10°和10"cell/ml，每个浓度梯度设置三个重复，备用。
2) 翻开测试片上层塑料膜，滴加各浓度梯度混合菌液lml于凹槽培养区内，盖上塑料膜， 观察样液是否已经均匀分散于测试片中央，静置卜2min，待凝胶固化后，37t:培养24h， 同时使用国标平板倾注法作对比；
3) 观察红色点为菌落，选取跟菌落色差较大的计数板组件(黄、白、黑)作为背景，置于测试 片的任一面计数，或直接置于自动菌落计数器中计数。对测试片和倾注法的菌落总数进 行统计和均值t检验，结果表明，两者生长菌落数量无显著差异(^0.0397,p-0.8516X).05)。
表1两种方法测定混合菌液的菌落总数(^ ±S， n=3)
菌液浓度(cell/ml)空白10410310210110。10"
测试片-菌落总数0不能计数不能计数315±842±25±10
倾注法-菌落总数0不能计数不能计数338±1644±64±0.60
实施例3:利用实施例l测试片目测不同菌种菌落数，并和自动菌落计数器测定结果比较
1) 制备菌液取各菌苔大肠杆菌(&cten'c/n'a co/z' 8099)、鼠伤寒沙门氏菌(&// 0恥//" CMCC 50115)、金黄色葡萄球菌(Sto/7/ y/ococcMS awews ATCC 6538)、金黄色葡萄球菌 OSto/ /^/ococcus CMCC 26003)、铜绿假单胞菌(i^etw/omo"(xy aerag/"ora ATCC 9027) 接种到5ml营养肉汤中，37。C培养18-24h后，各取lml于无菌试管中，用生理盐水10 倍梯度稀释至各菌液浓度为10'Cell/ml，每株菌液设置两个重复，备用。
2) 取五个测试片，分别测定步骤l)五种菌液。翻开测试片上层塑料膜，滴加浓度1(/cell/ml 的菌液lml于下层镂空凹槽位置，盖上塑料膜，观察样液是否已经均匀分散于测试片中 央，静置l-2min，待凝胶固化后，37。C培养24h;
3) 观察红色点为菌落，选取跟菌落色差较大的计数板组件(黄、白、黑)作为背景，置于测试 片的任一面目测计数，之后直接置于自动菌落计数器中计数。对测试片目测和自动菌落 计数器的菌落数进行统计和均值t检验，结果表明，两者无显著差异(1=0.0739，表2各菌株测试片目测和自动菌落计数器的菌落数(5±S， n=2)
视!l试菌株大肠杆菌 8099鼠伤寒沙门氏菌 CMCC 50115金葡菌 ATCC6538金葡菌 CMCC26003铜绿假单胞菌 ATCC卯27
目测菌落数715575955
自动数菌器菌落数716566058
实施例4:利用本发明的测试片与倾注法对金黄色葡萄球菌菌株的回收率测定比较
1) 按实施例1的测试片制备方法制备金黄色葡萄球菌测试片，所不同的是凹槽培养区内粘 合的是购买的0.06g金黄色葡萄球菌显色培养基；
2) 制备菌液挑取金黄色葡萄球菌(StapAj&cocc附ATCC 6538)、金黄色葡萄球菌 (&aMy/ocwc附CMCC 26003)菌苔分别接种到5ml营养肉汤中，37'C培养18-24h 后，各取lml用生理盐水IO倍梯度稀释至金黄色葡萄球菌菌液浓度为102Cell/ml，每株 菌设置三个重复，备用。
3) 翻开测试片t层塑料膜，滴加步骤2)菌液lml于下层镂空凹槽培养区位置，盖上塑料膜， 观察样液是否已经均匀分散于测试片中央，静置l-2min,待凝胶固化后，37'C培养24h， 计数；以lml菌液倾注金黄色葡萄球菌显色平板，37'C培养24h，作为对照，按照国标倾 注法规范步骤进行操作计数。
4) 以紫色和粉红色的菌落为阳性菌落，计算回收率。对比在测试片和倾注法中的回收率， 金黄色葡萄球菌ATCC6538， CMCC26003回收率均为100%。
回收率=(测试片菌落数/倾注法菌落数)><100% ，若数值大于100%计为100%。 表3各菌株用测试片和倾注法测定的回收率 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 平均
测试菌株
ATCC6538 CMCC26003 回收率(％)
倾注法
198 206
菌落数
测试片 198 220
96.5
菌落数 (100) (100)
7注表中数据为各测试菌株用测试片和倾注法测定的菌落数平均值(cfW片或cfu/皿)，括号中 为回收率(％)。
实施例5:利用本发明的测试片与倾注法对沙门氏菌菌株的回收率测定比较
1) 按实施例1的测试片制备方法制备沙门氏菌测试片，所不同的是凹槽培养区内粘合的是 购买的0.06g沙门氏菌显色培养基；
2) 制备菌液挑取鼠伤寒沙门氏菌(5Wm朋e〃a CMCC 50115)菌苔接种到5ml营养肉汤 中，37X:培养18-24h后，取lml用生理盐水10倍梯度稀释至沙门氏菌菌液浓度为 102Cell/ml，设置三个重复，备用。
3) 翻开测试片上层塑料膜，滴加步骤2)菌液lml于下层镂空凹槽培养区位置，盖上塑料膜， 观察样液是否已经均匀分散于测试片中央，静置l-2min，待凝胶固化后，37'C培养24h， 计数；以lml菌液倾注沙门氏菌显色平板，37'C培养24h,作为对照，按照国标倾注法规 范步骤进行操作计数。
4) 以紫色和粉红色的菌落为阳性菌落，计算回收率。对比在测试片和倾注法中的回收率， 伤寒沙门氏菌CMCC50115回收率为88.5%。
回收率=(测试片菌落数/倾注法菌落数)><100% ，若数值大于100%计为100%。 表4沙门氏菌用测试片和倾注法测定的回收率
测试菌株鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115
倾注法菌落数226
测试片菌落数200(88.5)
注表中数据为各测试菌株用测试片和倾注法测定的菌落数平均值(cfu/片或cfo/皿)，括号中
为回收率(％)。
实施例6:利用本发明的测试片与倾注法对大肠杆菌菌株的回收率测定比较
1) 按实施例1的测试片制备方法制备大肠菌群测试片，所不同的是凹槽培养区内粘合的是
购买的0.06g大肠菌群显色培养基；
2) 制备菌液挑取大肠杆菌(五"/^/cM7 co// 8099)、大肠杆菌C&c/^r/c/2,'" co//J7UC 25922) 菌苔分别接种到5ml营养肉汤中，37。C培养18-24h后，各取lml用生理盐水10倍梯度 稀释至大肠杆菌菌液浓度为102Cell/ml,每株菌设置三个重复，备用。
3) 翻开测试片上层塑料膜，滴加步骤2)菌液lml于下层镂空凹槽培养区位置，盖上塑料膜，
8观察样液是否已经均匀分散于测试片中央，静置l-2min，待凝胶固化后，37'C培养24h, 计数；以lml菌液倾注大肠菌群显色平板，37'C培养24h,作为对照，按照国标倾注法规 范步骤进行操作计数。
4)以蓝色和绿色的菌落为阳性菌落，计算回收率。对比在测试片和倾注法中的回收率，大 肠杆菌8099回收率为93.8%，大肠杆菌ATCC 25922回收率为98.1%，相对倾注法菌落 数平均回收率为96%。
回收率=(测试片菌落数/倾注法菌落数)><100% ，若数值大于100%计为100%。 表5大肠杆菌用测试片和倾注法测定的回收率 大肠杆菌 大肠杆菌 平均
测试菌株
ATCC 259228099 回收率(％)
倾注法
105 160
菌落数
测试片 103 150
96
菌落数 (98.1) (93.8)
注表中数据为各测试菌株用测试片和倾注法测定的菌落数平均值(cfu/片或cftl/皿)，括号中 为回收率(％)。
权利要求
1. 一种快速检测微生物的测试片，其特征在于该测试片包括底板、中间镂空的胶片和塑料膜，中间镂空的胶片的底面与底板粘合，胶片中间镂空部分形成凹槽培养区，所述凹槽培养区内置有显色培养基；所述塑料膜的底面粘合有冷水可凝的凝胶剂，所述塑料膜的底面与胶片的上表面在一侧边缘粘合。
2. 根据权利要求1所述的测试片，其特征在于所述底板和胶片长宽一致。
3. 根据权利要求2所述的测试片，其特征在于所述塑料膜与所述胶片的宽度一致，所述 塑料膜的长度大于所述胶片的长度。
4. 根据权利要求l-3任一项所述的测试片，其特征在于所述塑料膜的上表面设有标签层。
5. 根据权利要求1所述的测试片，其特征在于所述底板、塑料膜由聚乙烯塑料薄膜制备而成，所述胶片由聚对苯二甲酸类塑料制备而成，所述胶片厚度为0.3 0.5 mm。
6. 根据权利要求1所述的测试片，其特征在于所述胶片中间镂空部分为直径4 7cm的圆 形。
7. 根据权利要求1所述的测试片，其特征在于所述显色培养基由待测菌相应的营养物质、 诱导剂和显色剂组成，用量为1.5~4.0xl(T3g/cni2;所述冷水可凝的凝胶剂为多糖，用量为 1.0~4.0xl0-3g/cm2。
8. —种制备如权利要求1所述的快速检测微生物的测试片的方法，其特征在于包括以下 步骤1) 按要求剪裁底板、中间镂空的胶片和塑料膜；2) 粘合底板和胶片的底面得到凹槽培养区，将显色培养基粘合在凹槽培养区内；3) 将冷水可凝的凝胶剂粘合在塑料膜的底面；4) 将胶片的上表面与塑料膜的底面在一侧边缘粘合；5) 辐照灭菌，封装。
9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述辐照采用Co-60y射线，辐射剂量 3K 5KGy。
10. 权利要求1所述的测试片在检测食源性致病微生物中的应用。
11. 根据权利要求IO所述的应用，其特征在于所述食源性致病微生物为大肠杆菌、大肠菌 群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌中的一种或几种。
全文摘要
本发明公开了一种快速测定微生物的测试片及其制备方法和应用，该测试片包括底板、中间镂空的胶片和塑料膜，中间镂空的胶片的底面与底板粘合，胶片中间镂空部分形成凹槽培养区，所述凹槽培养区内置有显色培养基；所述塑料膜的底面粘合有冷水可凝的凝胶剂，所述塑料膜的底面与胶片的上表面在一侧边缘粘合。本发明测试片上下层粘合后辐照灭菌包装备用。本发明所述测试片能应用于菌落总数、大肠杆菌、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌等食源性致病微生物检测，操作简单，携带方便，测试时间短、结果准确、可双面数菌。
文档编号C12R1/42GK101497914SQ20091000791
公开日2009年8月5日 申请日期2009年2月26日 优先权日2008年12月30日
发明者吴清平, 吴许文, 张菊梅, 蔡芷荷, 郭伟鹏, 黄汝添 申请人:广东省微生物研究所