专利名称：降解木质纤维素的方法及其专用纤维素分解菌系的制作方法
技术领域：
本发明涉及降解木质纤维素的方法及其专用纤维素分解菌系。
背景技术：
木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三种成分组成，它们相互结 合形成复杂的超分子复合物。木质纤维素是我国最丰富的生物质资源，包括大 量的农作物秸秆、工业与林业废弃物以及城市固体废弃物等。目前木质纤维素 资源大部分未能被充分利用。尤其是农作物秸秆，它具有产量大、分布广和品 种多的特点，应用潜力巨大。木质纤维素被分解为小分子有机物后，可用作肥 料以改善和保持土壤肥力，可用作畜禽词料以促进畜牧业发展，可用作沼气发 酵以及乙醇生产的原料而获得清洁能源。因此，分离培养具有纤维素分解能力 的微生物，将廉价的可再生植物纤维素资源转化为对环境友好的产品，变废为 宝，是解决我国能源与环境问题、实现我国农业的可持续发展的有效途径之一。
研究人员在分离筛选具有分解纤维素能力的细菌时发现，实验中分离到的 具有纤维素分解能力的细菌都是两种或两种以上的细菌组成的复合菌系，单独 的细菌很难或只能微弱分解纤维素。也就是说，细菌对纤维素的高效分解是由 两种或多种细菌混合发酵完成的。为了更好地研究细菌分解纤维素的机理，分 析复合菌系中细菌的种群组成是必要且重要的。
过去对微生物多样性以及微生物种群组成的研究大多采用传统的分离培养方 法，但是有些种类的微生物难以实现纯培养，因而难以利用传统的微生物分离培 养技术获得样品中完整的微生物种群信息。分子生物学技术的发展为不依赖于传 统培养的微生物种群组成的研究提供了强有力的支持。应用于微生物种群结构研
究的分子生物学技术主要包括变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ， DGGE)技术、单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism, SSCP)技术、荧光原位杂交(Fluorescent In Situ Hybridization, FISH)技术以及16S rDNA克隆文库技术等。其中，16S rDNA 克隆文库技术已广泛应用于环境微生物多样性的研究中，它既可以分析样品微 生物的种类，又可以相对定量地反映样品中各种微生物的相对比例，最重要的是通过这种技术可检测到不能在实验室条件下获得纯培养的微生物。16S rDNA 克隆文库的构建与分析包括以下几步首先提取样品总DNA，通过PCR技术扩增 16SrRNA基因；将扩增后的16S rDNA片段与载体相连，然后将之转入大肠杆菌； 通过挑选阳性克隆建立克隆文库；将阳性克隆的插入片段测序，利用Blast软 件将经测序得到的16S rDNA序列与NCBI中已知的16S rDNA序列进行比较，并利 用其它软件进行分析，就可知道文库中的菌种种群组成及相对数量。
发明内容
本发明的目的是提供降解木质纤维素的方法及其专用纤维素分解菌系。 本发明所提供的纤维素分解菌系"/ ox7力a"7^s取)，名称为L-C，已于2008
年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为武汉大学)，
保藏号为CCTCC NO: M208165。
该纤维素分解菌系L-C对木质纤维素具有高效的分解能力。 本发明还提供了一种用于培养纤维素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165的培养
基，该培养基可按如下方法配制酵母提取物，1-3g;胰蛋白胨，l-3g; NaCl， 10-25g;
KC1， 0. 3—1.5g; MgS04' 7H20， 3—9g; MgCl2 *6H20, 2-6g; CaCl2 H20， 0. 5—2. 5g;
NaHC03， 0.2-lg;用水定容至1升。
所述培养基的pH可为6.8-8.0，具体可为7.2。
本发明还保护纤维素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165在降解木质纤维素中的 应用。
木质纤维素是我国最丰富的生物质资源，包括大量的农作物秸秆、工业与 林业废弃物以及城市固体废弃物等。本发明的纤维素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165可应用于木质纤维素的降解，如农作物秸秆、稻草、甘蔗、木薯等，为了 促进降解充分，可将木质纤维素先进行破碎处理，使其成为丝或渣。
所述应用中，降解木质纤维素的温度可为30-55°C，优选为40-50°C。 本发明还保护一种降解木质纤维素的方法，是在含有木质纤维素的培养基中培 养所述纤维素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165。
所述含有木质纤维素的培养基是在所述用于培养纤维素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165的培养基中加入木质纤维素得到的。
所述木质纤维素可为农作物秸秆、稻草、甘蔗、木薯等。 所述降解木质纤维素的方法中，培养所述纤维素分解菌系L-C的培养温度为
430-55°C，优选为40-50°C。
培养所述纤维素分解菌系L-C或应用所述纤维素分解菌系L-C时，可采用 150-200rpm的转速。
本发明有助于解决木质纤维素资源不能被充分利用的现状。采用本发明的 纤维素分解菌系L-C将木质纤维素进行初步降解后，可将其用作肥料以改善和保 持土壤肥力，可用作畜禽词料以促进畜牧业发展，可用作沼气发酵以及乙醇生 产的原料而获得清洁能源。本发明将廉价的可再生植物纤维素资源转化为对环 境友好的产品，变废为宝，具有重大的经济价值和社会意义。
图1为纤维素分解菌系L-C中细菌种群组成的分析流程图。 图2为纤维素分解菌系L-C对稻草的分解。 图3为纤维素分解菌系L-C对甘蔗渣的分解。 图4为纤维素分解菌系L-C对木薯渣的分解。
具体实施例方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实 验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊 说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例l、纤维素分解菌系L-C的获得
每升培养基含有如下组分酵母提取物，2g;胰蛋白胨，2g; NaCl， 18g; KC1， lg; MgS04' 7H20， 6g; MgCL 6 H20， 4g; CaCl2 H20， 1. 5g; NaHCO" 0. 7g; pH7.2。
按比例称取剩余相应药品倒入事先装有部分自来水的烧杯中，药品充分溶解后 用自来水定容至990ml，调pH至7.2，最后定容到1000ml。
将每10ml培养基分装到18X 180mm的普通试管(预先放置12X IOO咖的滤纸 条)中。
一、纤维素分解菌系L-C的获得
将O. 2-0. 6采自广西木薯酒精废液UASB-TLP处理系统的厌氧活性污泥样品接 种到装有培养基的试管中。将试管在40-5(TC的温度条件下以150-200rpm的转速振 荡培养进行富集筛选。72小时后，将试管中的培养液以5% (体积百分比)的接种量 接种到新的装有培养基的试管中。接种后在40-5(TC温度下进行振荡培养直至滤纸完全崩解。按相同方法重复转接多次，得到可以在18-24小时内完全崩解滤纸的性 能稳定的纤维素分解菌系。
二、纤维素分解菌系L-C中细菌种群组成的分析
分析流程图见图1。
1、 总DNA的提取
将步骤一得到的纤维素分解菌系接种至培养基中，接种量为5%(体积百分比)， 40-50。C培养20小时。
将lml培养液放入1. 5ml E卯endorf管中，12000rpm， 4。C离心5分钟收集菌 体，用1XTES洗涤菌体2-3次。将菌体重新悬浮于435W TES中打散菌体，加入 溶菌酶(20mg/ml) 12514，蛋白酶K (10mg/ml) 2. 5W， 37。C水浴轻振保温4小时， 加入50W20XSDS，于37。C水浴轻振保温30分钟，加入5M NaC104 1 25W，用等体 积(560W)酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提3-4次至界面无蛋白膜出现。吸取上 层水相置于冰浴中加入1/10体积的3M NaAc-EDTA-Na2，加入2倍体积冷无水乙醇， 翻转混匀，冰浴5分钟。12000rpm离心20分钟沉淀DNA。加入70%乙醇脱盐，4°C 过夜放置，7000rpm离心IO分钟，吸出乙醇。风干，加二次蒸馏水溶解。电泳检测 后调DNA浓度为25Pg/ml。
2、 PCR扩增16S rDNA部分序列
通用引物530F (5' -GTG CCA GCA/G GCC GCG G-3') 1490R (5' -GTG CCA GCA/G GCC GCG G-3')
PCR反应体系(50W):
5X缓冲液10. OW
Mg2+ (25mM)3. OW
d證(lOraM)l潜l
530F (50I4O0.
1490R (50MM)0.
模板DNAl.OW
GoTaq DNA聚合酶0.
ddH2033.
PCR反应条件
预变性95°C 5 min;循环 95°C 1 min， 55°C 2 min， 72°C 1 min; 30个循环； 延伸 72°C 5 min。
经电泳检测，证明得到大约lOOObp的PCR产物。
3、 PCR产物纯化
采用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-叩System (产品目录号 A9281)纯化。具体操作为经凝胶电泳后将所需条带切下放入1.5ml离心管。称 量胶条的重量，并以lW/mg的量加入膜结合溶液，在50-65'C保温溶解。将溶解后 的混合物倒入柱子室温放置1分钟后以16000转速离心1分钟。加入700W洗膜溶 液以同样转速离心1分钟后再加入500W洗膜溶液离心5分钟。将柱子轻轻转移到 干净的离心管中加入50W无核酸酶水，离心1分钟后置4°。保存。
4、 PCR产物与载体连接
连接载体选用Promega公司的pGEM T-easy载体(产品目录号A1360)，连 接体系如下表
名称反应阳性对照阴性对照
2X缓冲液2.5142.2. 514
pGEM-T Easy载体(50ngM)0.0. 5140.
PCR产物1.——
Control DNA "ng/W)—l"l一
T4 DNA连接酶(3U/W)0. 5140.0.
补去离子水至5W5W
混匀后4'C过夜放置。
Control DNA为Promega公司的pGEM T-easy载体中提供的。 5、转化
将步骤4的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5 a (北京博大泰恒生物技术 有限责任公司)。分别取5(mi， 100W， 200)4涂平板，于37。C温箱培养12-16小时。 依据蓝白斑筛选的原理挑取白色菌落点种在平板上，每个平板点种50个菌落，每 个菌落的位置标记数码(1-50)， 37'C培养12小时。
6、阳性克隆的筛选
采用菌落PCR技术。用牙签挑取少许不同菌落的菌体分别加入事先装有50W 无菌水的PCR管中，做好标记(与平板上的标记号码相同)。将PCR管于95。C加热
75分钟，冷至室温后，15000rpm离心5分钟。取IOS王清为模板进狞PCR，引物为 SP6 (5' -CAT ACGATTTAGGTGACACTATAG-3')和T7 (5' -TAA TAC GAC TCA CTA TAGGG-3')。菌落PCR体系组成以及反应条件与上述16S rDNA扩增条件相同。取 10W PCR产物经凝胶检测确定阳性克隆。
7、 用限制性内切酶I对30个阳性克隆的菌落PCR扩增产物进行酶切分析 酶切体系(20W)如下
Nuclease-Free Water 7. 5Ml
菌落PCR产物 10W 10 XBuffer Tango with BSA I (10U/W) 0. 混合后置37r水浴保温2-5小时。
酶切完成后在60-7(TC放置30分钟终止酶切。取酶切产物进行电泳检测 证明有4种不同的酶切带型，即有4个0TU (Operational Taxonomic Unit)。
8、 阳性克隆测序和系统发育分析
挑取代表4个不同带型的阳性克隆菌落接种于LB平板上，37t过夜培养后送 测序公司进行测序。将所得序列输入NCBI网站用Blast程序与Genbank中已有的 序列进行比较。
结果表明纤维素分解菌系的细菌种群由四种细菌(细菌A、细菌B、细菌C 和细菌D)组成。细菌A属于厌氧芽孢杆菌属""o^力3cj77ws)，与^2o;ry力acj77^ /7aw'Wei7z^同源性极高，相似性达到98-99%，占细菌总数的60%。细菌B、细菌 C和细菌D属于芽孢杆菌属(Saci77us)。细菌B与万acj'Uws AsycArocfera"s的同 源性达99%，细菌C与5aciJ7〃s i^fl^/s的同源性达96%，细菌D与"ac/7勿s 7ic/ e"i/br肌's的同源性达95%。细菌C占细菌总数的20%，细菌D占细菌总数的 15%，细菌B占细菌总数的5呢。
将步骤一得到的纤维素分解菌系命名为L-C，于2008年10月17日将其保存于 中国典型培养物保藏中心(地址武汉大学内)，保藏登记号为CCTCCN0: M208165。
实施例2、纤维素分解菌系L-C的培养温度优化
每升培养基含有如下组分酵母提取物，2g;胰蛋白胨，2g; NaCl， 18g; KC1， lg; MgS04' 7H20， 6g; MgCl2 '61120， 4g; CaCl2 H20， 1. 5g; NaHCO" 0. 7g; pH7. 2。培养基的配制方法为按比例称取剩余相应药品倒入事先装有部分自染水的烧 杯中，药品充分溶解后用自来水定容至990ml，调pH至7.2，最后定容到lOOOml。
将每10ml培养基分装到18X 180誦的普通试管(预先放置12X 100mm的滤纸 条)中。
将实施例1的步骤一得到的纤维素分解菌系L-C接种至含有培养基的试管中， 接种量为5% (体积百分比)，接种40个试管。40个样本分成四组，每组10个样 本。将四组样本分别在30-40°C、40-50°C、50-55°C、60-7(TC的温度条件下以180rpm 的转速振荡培养。
在40-5(TC条件下培养的试管中的滤纸条上首先长出黄色菌落并逐渐消解，除 60-7(TC外，其它温度条件下，滤纸条上也先后长出黄色菌落并逐渐消解。表明纤 维素分解菌系L-C在30-55'C均可生长，最适宜的生长温度为40-5(TC。
实施例3、纤维素分解菌系L-C降解木质纤维素
每升培养基含有如下组分酵母提取物，lg;胰蛋白胨，lg; NaCl， 10g; KC1， 0. 3g; MgS047H20， 3g; MgCl2 6 H20， 2g; CaCl2 H20， 0. 5g; NaHCO" 0. 2g。
培养基的配制方法为按比例称取剩余相应药品倒入事先装有部分自来水的烧
杯中，药品充分溶解后用自来水定容至990ml ，调pH至6.8，最后定容到lOOOml。 将每10ml培养基分装到18X 180mm的普通试管中。
取60个装有培养基的试管，分成六组，每组10支。在第一组和第二组试管中 加入烘干稻草(每个试管中加入0.1g烘干稻草)，在第三组和第四组试管中加入 烘干甘蔗渣(每个试管中加入0.3g烘干甘蔗渣)，在第五组和第六组试管中放置 0. 3g的木薯渣。
将实施例1的步骤一得到的纤维素分解菌系L-C接种至第一组、第三组和第五组 的每个试管中，接种量为5% (体积百分含量)；第二组、第四组和第六组试管中分 别加入5% (体积百分含量)的无菌水，作为对照；40°C、 150rpm振荡培养。结果表 明第一组的试管中的稻草在三周内大部分分解，第二组的试管中的稻草没有崩解; 第三组试管中的甘蔗渣在三周后大部分分解，第四组试管中的甘蔗渣没有变化；第 五组试管中的木薯渣在三周后大部分分解，第六组试管中的木薯渣没有变化。
图2为纤维素分解菌系L-C对稻草的分解；A:没有接种纤维素分解菌系L-C培养 三周的稻草(第二组)；B:接种纤维素分解菌系L-C后培养17天的稻草(第一组)。图3为纤维素分解菌系L-C对甘蔗渣的分解；A:没有接种纤维素分解菌系L-C培 养三周的甘蔗渣(第四组)；B:接种纤维素分解菌系L-C培养24天的甘蔗渣(第三 组)。
图4为纤维素分解菌系L-C对木薯渣的分解；A:没有接种纤维素分解菌系L-C培 养三周的木薯渣(第六组)；B:接种纤维素分解菌系L-C培养24天的木薯渣(第五 组)。
结果表明纤维素分解菌系L-C对木薯渣、稻草和甘蔗渣分解明显。 将加入的稻草重量减去分解后经过滤得到的渣滓的干重，即为稻草重量的减少 量(木薯渣、甘蔗渣同)。
接种纤维素分解菌系L-C，培养17天后，稻草的重量减少82%。接种纤维素分 解菌系L-C，培养24天后，甘蔗渣的重量减少64%。接种纤维素分解菌系L-C，培 养24天后，木薯渣的重量减少71%。以上数据均为每组十个试管的平均值。
实施例4、纤维素分解菌系L-C降解木质纤维素
每升培养基含有如下组分酵母提取物，3g;胰蛋白胨，3g; NaCl， 25g; KC1， 1. 5g; MgS047H20， 9g; MgCl2 6 H20， 6g; CaCl2 H20， 2. 5g; NaHC0" lg。
培养基的配制方法为按比例称取剩余相应药品倒入事先装有部分自来水的烧 杯中，药品充分溶解后用自来水定容至990ml，调pH至8.0，最后定容到lOOOml。
将每10ml培养基分装到18X180mm的普通试管中。
取60个装有培养基的试管，分成六组，每组10支。在第一组和第二组试管中 加入烘干稻草(每个试管中加入0.1g烘干稻草)，在第三组和第四组试管中加入 烘干甘蔗渣(每个试管中加入0.3g烘干甘蔗渣)，在第五组和第六组试管中放置 0. 3g的木薯渣。
将实施例1的步骤一得到的纤维素分解菌系L-C接种至第一组、第三组和第五组 的每个试管中，接种量为5% (体积百分含量)；第二组、第四组和第六组试管中分 别加入5% (体积百分含量)的无菌水，作为对照；40°C、 150rpm振荡培养。结果表 明第一组的试管中的稻草在三周内大部分分解，第二组的试管中的稻草没有崩解; 第三组试管中的甘蔗渣在三周后大部分分解，第四组试管中的甘蔗渣没有变化；第 五组试管中的木薯渣在三周后大部分分解，第六组试管中的木薯渣没有变化。
结果表明纤维素分解菌系L-C对木薯渣、稻草和甘蔗渣分解明显。
10将加入的稻草重量减去分解后经过滤得到的渣滓的干重，即为稻草重l:的减少 量(木薯渣、甘蔗渣同)。
接种纤维素分解菌系L-C，培养17天后，稻草的重量减少76%。接种纤维素分 解菌系L-C，培养24天后，甘蔗渣的重量减少61%。接种纤维素分解菌系L-C，培 养24天后，木薯渣的重量减少73%。以上数据均为每组十个试管的平均值。
权利要求
1、纤维素分解菌系L-C CCTCC NOM208165。
2、 一种用于培养纤维素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165的培养基，该培养基 的配制方法如下酵母提取物，卜3g;胰蛋白胨，1-3g; NaCl， 10-25g; KCl， 0.3-1.5g; MgS04 7H20， 3—9g; MgCl2 6 H20， 2-6g; CaCl2 H20， 0. 5—2. 5g; NaHC03， 0. 2-lg; 用水定容至1升。
3、 如权利要求2所述的培养基，其特征在于所述培养基的pH为6. 8-8. 0，优 选为7.2。
4、 纤维素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165在降解木质纤维素中的应用。
5、 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述木质纤维素为稻草、甘蔗或木薯。
6、 如权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述应用中，降解木质纤维素 的温度为30-55。C。
7、 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用中，降解木质纤维素的温 度为40-5(TC。
8、 一种降解木质纤维素的方法，是在含有木质纤维素的培养基中培养权利要求1 所述纤维素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165。
9、 如权利要求8所述的方法，其特征在于所述含有木质纤维素的培养基是在 权利要求2或3所述的用于培养纤维素分解菌系L-C CCTCC NO: M208165的培养基中 加入木质纤维素得到的。
10、 如权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述木质纤维素为稻草、甘蔗 或木薯；所述方法中，培养所述纤维素分解菌系L-C的培养温度为30-55'C，优选为 40—50°C。
全文摘要
本发明公开了降解木质纤维素的方法及其专用纤维素分解菌系。本发明提供了纤维素分解菌系L-C CCTCC NOM208165。本发明还提供了一种用于培养纤维素分解菌系L-C CCTCC NOM208165的培养基。本发明还提供了纤维素分解菌系L-C CCTCC NOM208165在降解木质纤维素中的应用。本发明有助于解决木质纤维素资源不能被充分利用的现状。采用本发明的纤维素分解菌系将木质纤维素进行初步降解后，可将其用作肥料以改善和保持土壤肥力，可用作畜禽饲料以促进畜牧业发展，可用作沼气发酵以及乙醇生产的原料而获得清洁能源。本发明将廉价的可再生植物纤维素资源转化为对环境友好的产品，变废为宝，具有重大的经济价值和社会意义。
文档编号C12R1/07GK101597580SQ20091008578
公开日2009年12月9日 申请日期2009年6月1日 优先权日2009年6月1日
发明者刘文彦, 朱万斌, 杨苏声, 梁近光, 序 程 申请人:中国农业大学