专利名称：分支杆菌培养基及制备方法及培养、鉴定和药敏测定方法
技术领域：
本发明涉及一种分支杆菌培养、鉴定和药敏培养基及其制备方
法，以及同时进行分支杆菌培养、鉴定和药敏测定的方法。
背景技术：
分支杆菌(也称"分枝杆菌")种类多达100余种，广泛分布于
自然界，多为腐生菌，少数为人类和动物致病菌。国内外报道，分支 (枝)杆菌感染日益增多，结核分支(枝)杆菌感染疫情和耐药情况 相当严重，非结核分支(枝)杆菌感染的发生率也呈逐年上升趋势。
而涂片染色检查分支(枝)杆菌需标本中含107ml条分支(枝)杆 菌方能检出，敏感性低，鉴别结核和非结核分支(枝)杆菌特异性差。 因此，分支(枝)杆菌培养、鉴定在诊断分支(枝)杆菌感染过程中 起着决定性作用。
目前，分支(枝)杆菌培养基种类主要有固体培养基和液体培养 基，固体培养基有改良罗一琼(Lowenstein-Jensen, J-L)培养基、酸 性L-J培养基、丙酮酸钠培养基和Middlebrook系列固体培养基等。 液体培养基有变色液体培养基，Middlebrook7液体培养基等，如放 射性检测系统(Bactec460系统)、荧光感应器检测系统(Bactec960 系统)和C02感应检测系统(MB/Bact系统)。它们仅适用于临床上分
4离培养分支(枝)杆菌，待培养出分支(枝)杆菌后，再分别进行结 核分支(枝)杆菌和非结核分支(枝)杆菌鉴定及药物敏感性试验， 其所需时间长，培养阳性后再进行结核分支(枝)杆菌和非结核分支
(枝)杆菌的鉴定和药敏， 一般要3 6个月才能出结果。由于现有 常用分支(枝)杆菌鉴定方法实用性差，导致绝大多数实验室不进行 结核分支(枝)杆菌和非结核分支(枝)杆菌鉴定。传统生化反应鉴 定和药物敏感性试验操作烦琐、费时，需4 8周时间，影响因素多， 如菌量、菌龄，尤其是菌量控制无客观标准，重复性差。因此，急需 快速、简便、准确同时进行分支(枝)杆菌培养、鉴定和药敏测定方 法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有分支杆菌培养、鉴定和药物敏感性试 验须分步进行的不足，提供一种分支杆菌培养、鉴定和药敏培养基， 及该培养基的制备方法，及使用该培养基同时进行分支杆菌培养、鉴 定和药敏测定的方法。
本发明的分支杆菌培养、鉴定和药敏培养基，由如下组分组成
1 GrT1Gcr —
枸椽酸钠0,4g ，硫酸铵0. 5g，
MgS040. 05g ，谷氨酸钠0.5g ，
生物素0. 5g ，枸椽酸铁铵0, 04g ，
氯化钙0.05g ，盐酸吡眵醇O.Olg ，
ZnS04O.Olg ，泛酸钙O.Olg ，CuS04 0. Olg ， 丙三醇 5ml ，
变色剂噻唑兰10-30mg， 白蛋白-油酸-葡萄糖液 100-200ml， 两性霉素 5-10mg， 柰啶酸 5-10mg,
氨节青霉素 25-50mg， 甲氧苄嘧啶5-10mg ，
蒸馏水 定容至1000 ml。
本发明的分支杆菌培养、鉴定和药敏培养基的制备方法，包括如 下步骤按配方取KH2P0" Na2HP04、枸椽酸钠、硫酸铵、MgS04、谷氨 酸钠、生物素、枸椽酸铁铵、氯化钙、盐酸吡哆醇、ZnS04、泛酸钙、 CuS04、丙三醇加入蒸馏水中，混匀后采用6NHC1调pH至6. 6 6. 8， 经高压灭菌15分钟，待冷至50 6(TC加入无菌的变色剂噻唑兰、白 蛋白-油酸-葡萄糖液和四种抗生素(即两性霉素、柰啶酸、氨苄青霉 素、甲氧苄嘧啶)，然后分装，避光保存。
本发明的同时进行分支杆菌培养、鉴定和药敏测定的方法，包括 如下步骤取前处理过的标本加入本发明的分支杆菌培养、鉴定和药 敏培养基中，混匀，再加入培养板中的培养孔、鉴定孔和药敏测定孔 中，盖上板盖，35-37-C培养，接种后从第2天开始，每天观察培养 板各孔变色情况，待培养孔变色后，取培养孔培养液进行抗酸染色， 如见抗酸杆菌则报告培养出分支杆菌，此时根据鉴定孔的变色情况判 断是结核分支杆菌还是非结核分支杆菌，根据药敏测定孔的变色情况 判断药物敏感性。
所述鉴定孔内的鉴定试剂最好采用对硝基苯甲酸，其在鉴定孔加 入培养基后的终浓度为0. 2-0. 5毫克/毫升。鉴定孔变色为非结核分支(枝)杆菌，不变色为结核分支(枝)杆菌。
所述标本前处理方法可采用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC) -NaOH 法，参见熊礼宽主编、人民卫生出版社2003年12月出版发行的《结 核病实验诊断学》第112页。试剂配制重量百分含量为2.94% (0. lmol/L)的枸椽酸钠溶液50ml，加4% (重量百分含量)NaOH溶 液50ml，混匀。临用前加入0. 5g NALC，混匀后置室温24 48小时 内使用，此溶液不稳定，应密闭冷藏。处理方法取被检标本10ml， 加等量上述消化液，振荡30秒，如果标本粘稠，可适当延长消化时 间，室温(20°C 25°C)放置15分钟，加入灭菌的0. 067mol/L磷 酸缓冲液(即PB缓冲液)20ml，混匀后离心15分钟，去上清液。 最后将沉淀混悬于灭菌的0. 067mol/L PB缓冲液1 2ml，备接种用。 如果采用2y。 4。/。(重量百分含量)NaOH或}^04等方法前处理标本(参 见熊礼宽主编、人民卫生出版社2003年12月出版发行的《结核病实 验诊断学》第112页)，应将沉淀再混悬于0. 067mol/L PB缓冲液20ml 中，混匀后离心15分钟，去上清液，最后将沉淀混悬于灭菌的 0.067mol/L PB缓冲液l 2ml，备接种用。
所述接种方法可采用如下方法在生物安全柜中，取下无菌培养 板的板盖，取每份前处理过的标本O. 5-2ml加入本发明的培养基中， 混匀，再加入培养板中的培养孔、鉴定孔和药敏测定孔中，各孔200 400微升，盖上板盖，35 37。C培养。
分支杆菌培养、鉴定和药敏测定的结果判断如下
接种后从第2天开始，每天观察培养板各孔变色情况，待培养孔变色后，取培养孔培养液进行抗酸染色，染色方法见熊礼宽主编、人
民卫生出版社2003年12月出版发行的《结核病实验诊断学》第93 99页。如见抗酸杆菌则报告培养出分支(枝)杆菌，此时如果鉴定 孔变色为非结核分支(枝)杆菌，不变色为结核分支(枝)杆菌；药 敏测定孔变色为耐药，不变色为敏感。
本发明的原理是本发明的培养基含缓冲液、甘油、微量元素、 白蛋白、葡萄糖、抗生素、变色剂等。 一方面培养基营养丰富，有利 于分支(枝)杆菌快速生长，另一方面抗生素能抑制分支(枝)杆菌 以外的革兰氏阳性和阴性细菌及真菌生长，当分支(枝)杆菌生长时， 分解色原底物(MTT)而发生颜色变化，由此判断是否有分支(枝) 杆菌生长。如果含药物的药敏测定孔能抑制分支(枝)杆菌生长(表 现为不变色)说明对该药物敏感，反之为耐药；如鉴定孔能抑制分支 (枝)杆菌生长，说明为结核分支(枝)杆菌，反之为非结核分支(枝) 杆菌。
本发明的优点如下
1.本发明的方法操作简单，使用方便。比传统的L-J培养基、 自动化的Middlebrook系列培养基、放射性检测系统(Bactec460系 统)、荧光感应器检测系统(Bactec960系统)和C02感应检测系统 (MB/Bact系统)简单，这些传统方法均为培养出分支(枝)杆菌， 再分别进行结核分支(枝)杆菌和非结核分支(枝)杆菌鉴定、结核 分支(枝)杆菌药敏试验，需要进行3次试验，使用本发明培养基， 本发明方法只需要一次试验，可以同时得到培养、鉴定和药敏结果。2. 本发明获得结果快速。如上所述，以前的方法分3次试验， 需要2 6个月(60-180天)获得结果，本发明只需要1次试验，7-56 天即可获得结果。
3. 本发明试验成本低。明显低于放射性检测系统(Bactec460系 统)、荧光感应器检测系统(Bactec960系统)和C02感应检测系统
(MB/Bact系统)。
4. 本发明结果便于观察，使用方便。本发明培养基为无色，变 色后为蓝色或紫红色，肉眼就可以观察，使用方便。
5. 本发明应用范围广泛。本发明可应用于微生物中分支(枝) 杆菌属中除麻风分支(枝)杆菌以外的所有分支(枝)杆菌的培养、 鉴定和药敏试验。
图1是本发明实施例五至实施例十中专用无菌培养板的结构示意图。
具体实施例方式
1000ml分支杆菌的培养、鉴定和药敏试验培养基由如下组分组
成
KH2P04 1.5g, Na2HP04 1.5g，
枸椽酸钠 0.4g，MgS04 0 . 05g,
谷氨酸钠 0.5g，
生物素 0.5g，
枸椽酸铁铵 0.04g，
氯化l 0.05g，
盐酸吡卩多醇 0. Olg，
ZnS04 0. Olg，
泛酸牵丐 O.Olg，
CuS04 0. Olg，
丙三醇 5ml ， 噻唑兰(MTT) lOmg， 白蛋白-油酸-葡萄糖液 lOOml，
两性霉素 5mg，
柰啶酸 5mg，
氨苄青霉素 25mg，
甲氧节嘧啶 5mg，
蒸馏水 定容至1000ml。
上述培养基的制备方法如下
按上述用量取KH2P04、 Na2HP04、枸椽酸钠、硫酸铵、MgS04、谷氨 酸钠、生物素、枸椽酸铁铵、氯化钙、盐酸吡哆醇、ZnS04、泛酸钙、 CuS04、丙三醇加入至蒸馏水中，用蒸馏水定容至1000ml，混匀后以 6N HC1调pH至6. 6 6. 8，经高压灭菌15min，待冷至50 60。C加无菌的MTT 10mg、白蛋白-油酸-葡萄糖液100ml和4种抗生素(即两 性霉素、柰啶酸、氨苄青霉素、甲氧苄嘧啶)。将此培养基直接分装 于灭菌玻璃瓶内，避光保存，可使用半年，-20。C保存2年。
实施例二
实施例二的分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏试验培养基，与
实施例一不同之处在于:在实施例二中，变色剂MTT的量为20mg，其 它与实施例一相同。
实施例三的分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏试验培养基，与 实施例一不同之处在于:在实施例三中，变色剂MTT的量为30mg，其 它与实施例一相同。
实施例四
实施例四的分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏试验培养基，与
实施例一不同之处在于在实施例四中，变色剂MTT为20mg，白蛋白 -油酸-葡萄糖液为200ml，其它与实施例一相同。
实施例五分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏测定方法
1、标本前处理采用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC) -NaOH法，参 见熊礼宽主编、人民卫生出版社2003年12月出版发行的《结核病实验诊断学》第112页。试剂配制重量百分含量为2. 94% (0. lmol/L) 枸椽酸钠溶液50ml，加4%(重量百分含量)Na0H溶液50ml，混匀。 临用前加入0. 5g NALC，混匀后置室温24 48h内使用，此溶液不稳 定，应密闭冷藏。处理方法取被检痰液标本10ml，加等量上述消 化液，振荡30s，如果标本粘稠，可适当延长消化时间，室温(2(TC 25°C)放置15min，加入灭菌的0. 067mol/L PB缓冲液20ml，混匀后 离心15min，去上清液。最后将沉淀混悬于灭菌的0. 067mol/L PB缓 冲液lml。
2、分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏测定在生物安全柜中， 取下图1所示的专用无菌培养板的板盖，取前处理过的标本lml加入 3ml培养基中(0. 5-lml标本， 一般加入到3-10ml的培养基)，混匀， 再加入专用培养板中的培养孔、鉴定孔和药敏测定孔中(在鉴定孔中 加有鉴定试剂对硝基苯甲酸，其终浓度为0. 5毫克/毫升，在药敏测 定孔中分别加有链霉素、异烟阱、利福平、乙胺丁醇)，各孔200微 升，盖上板盖，35'C培养，接种后从第2天开始，每天观察培养板各 孔变色情况，7天培养孔变色，取培养孔培养液进行抗酸染色(染色 方法见熊礼宽主编、人民卫生出版社2003年12月出版发行的《结核 病实验诊断学》第93 99页)，见抗酸杆菌，此时鉴定孔变色，鉴定 为非结核分支(枝)杆菌，药敏测定孔变色，测定为链霉素、异烟阱、 利福平和乙胺丁醇耐药。
实施例六分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏测定方法
1、标本前处理同实施例五。将沉淀混悬于灭菌的0. 067mol/LPB缓冲液O. 5ml。
2、分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏测定在生物安全柜中， 取下专用无菌培养板板盖，取前处理过的标本0. 5ml加入3ml培养基 培养基中，混匀，再加入专用培养板中的培养孔、鉴定孔和药敏测定 孔中(鉴定孔中鉴定试剂为对硝基苯甲酸，其终浓度为0.2毫克/毫 升，药敏测定孔中的抗生素同实施例五)，各孔400微升，盖上板盖， 35"C培养。接种后从第2天开始，每天观察培养板各孔变色情况，20 天培养孔变色，取培养孔培养液进行抗酸染色，见抗酸杆菌，此时鉴 定孔不变色，为结核分支(枝)杆菌，链霉素、异烟阱药敏测定孔变 色，利福平和乙胺丁醇药敏测定孔未变色，结果为链霉素、异烟阱耐 药，利福平和乙胺丁醇敏感。
实施例七分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏测定方法
1、 标本前处理用2% (重量百分含量)NaOH前处理标本(参见 熊礼宽主编、人民卫生出版社2003年12月出版发行的《结核病实验 诊断学》第112页)，将沉淀再混悬于0. 067mol/L PB缓冲液20ml中， 混匀后离心15min，去上清液，最后将沉淀混悬于灭菌的0. 067mol/L PB缓冲液lml。
2、 分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏测定接种方法同实施 例六。接种后从第2天开始，每天观察培养板各孔变色情况，41天 培养孔变色，取培养孔培养液进行抗酸染色，见抗酸杆菌，此时鉴定 孔不变色为结核分支(枝)杆菌，链霉素药敏测定孔变色，异烟阱、 利福平和乙胺丁醇药敏测定孔未变色，结果为链霉素耐药，异烟阱、
13利福平和乙胺丁醇敏感。
实施例八分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏测定方法
用4% (重量百分含量)NaOH前处理标本，其它方法同实施例七。 接种后38天培养孔变色，取培养孔培养液进行抗酸染色，见抗酸杆 菌，此时鉴定孔不变色为结核分支(枝)杆菌，链霉素、异烟阱、利 福平和乙胺丁醇药敏测定孔均未变色，结果为链霉素、异烟阱、利福 平和乙胺丁醇敏感。
实施例九分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏测定方法
用4% (重量百分含量)H2S04前处理标本，其他方法同实施例七。 接种后16天培养孔变色，取培养孔培养液进行抗酸染色，见抗酸杆 菌，此时鉴定孔变色为非结核分支(枝)杆菌，链霉素、异烟阱和乙 胺丁醇药敏测定孔均未变色，结果为链霉素、异烟阱和乙胺丁醇敏感， 利福平药敏测定孔变色，为利福平耐药。
实施例十分支(枝)杆菌的培养、鉴定和药敏测定方法
用2%(重量百分含量)H2S04前处理标本，其他方法同实施例七。 接种后23天培养孔变色，取培养孔培养液进行抗酸染色，见抗酸杆 菌，此时鉴定孔未变色为结核分支(枝)杆菌，链霉素、乙胺丁醇药 敏测定孔均未变色，结果为链霉素和乙胺丁醇敏感，异烟阱和利福平 药敏测定孔均变色，结果为异烟阱和利福平耐药。
权利要求
1.一种分支杆菌培养、鉴定和药敏培养基，其特征在于由如下组分组成KH2PO41.5g，Na2HPO41.5g，枸椽酸钠 0.4g，硫酸铵 0.5g，MgSO4 0.05g， 谷氨酸钠 0.5g，生物素0.5g，枸椽酸铁铵 0.04g，氯化钙0.05g， 盐酸吡哆醇 0.01g，ZnSO4 0.01g， 泛酸钙 0.01g，CuSO4 0.01g， 丙三醇 5ml，变色剂噻唑兰10-30mg，白蛋白-油酸-葡萄糖液 100-200ml，两性霉素5-10mg， 柰啶酸5-10mg，氨苄青霉素 25-50mg，甲氧苄嘧啶5-10mg，蒸馏水 定容至1000ml。
2. —种权利要求1所述的分支杆菌培养、鉴定和药敏培养基的 制备方法，其特征在于包括如下步骤按配方取KH2P04、 Na2HP04、枸 椽酸钠、硫酸铵、MgS04、谷氨酸钠、生物素、枸椽酸铁铵、氯化钙、 盐酸吡哆醇、ZnS04、泛酸钙、CuS04、丙三醇加入蒸馏水中，混匀后 采用6NHCl调pH至6.6 6.8，经高压灭菌15分钟，待冷至50 60。c加入无菌的变色剂噻唑兰、白蛋白-油酸-葡萄糖液和四种抗生素，然后分装，避光保存。
3. —种同时进行分支杆菌培养、鉴定和药敏测定的方法，其特征在于包括如下步骤取前处理过的标本加入权利要求1所述的培养 基中，混匀，再加入培养板中的培养孔、鉴定孔和药敏测定孔中，盖上板盖，35-37 r;培养，接种后从第2天开始，每天观察培养板各孔 变色情况，待培养孔变色后，取培养孔培养液进行抗酸染色，如见抗 酸杆菌则报告培养出分支杆菌，此时根据鉴定孔的变色情况判断是结 核分支杆菌还是非结核分支杆菌，根据药敏测定孔的变色情况判断药 物敏感性。
4. 根据权利要求3所述的同时进行分支杆菌培养、鉴定和药敏 测定的方法，其特征在于所述鉴定孔内的鉴定试剂采用对硝基苯甲 酸，浓度为0. 2-0. 5毫克/毫升。
5. 根据权利要求3或4所述的同时进行分支杆菌培养、鉴定和 药敏测定的方法，其特征在于所述标本的前处理采用N-乙酰-L-半 胱氨酸-NaOH法。
6. 根据权利要求3或4所述的同时进行分支杆菌培养、鉴定和 药敏测定的方法，其特征在于所述标本的前处理是先采用2% 4% 重量百分含量NaOH或H2S04处理方法，再将沉淀混悬于0. 067mol/L PB 缓冲液20ml中，混匀后离心15分钟，去上清液，最后将沉淀混悬于 灭菌的0.067mol/L PB缓冲液l 2ml，备接种用。
全文摘要
本发明为一种分支杆菌培养基及制备方法及培养、鉴定和药敏测定方法。培养基含缓冲液、甘油、微量元素、白蛋白、葡萄糖、抗生素、变色剂等。取前14个组分加入蒸馏水中，调pH，高压灭菌，加入噻唑兰、白蛋白-油酸-葡萄糖液和四种抗生素，即得培养基。取前处理过的标本加入本发明培养基中培养，待培养孔变色后，根据鉴定孔和药敏测定孔的变色情况判断是结核分支杆菌还是非结核分支杆菌及药物敏感性。本发明只需一次接种培养，即可得到分支杆菌培养、鉴定和药敏试验结果，操作简单、实用、易于标准化，阳性率高、快速、实用性强，价格低、易推广。本发明应用广泛，适用于人体、动物、污水等环境中分支杆菌培养、鉴定和药敏测定。
文档编号C12N1/20GK101560490SQ20091010701
公开日2009年10月21日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者熊礼宽 申请人:熊礼宽