专利名称：一种添加脂肪醇聚氧丙烯醚制备l-丙氨酸的方法
技术领域：
本发明属于生化工程和酶工程技术领域。具体涉及一种添加脂肪醇聚氧丙烯醚制 备L-丙氨酸的方法。
背景技术：
L一丙氨酸(L-Alanine)亦称α —氨基丙酸，是生命体内与糖代谢密切相关、需求 量较多的氨基酸之一，已在医药、食品及化工等行业中得到广泛应用，如用作制造氨基酸营 养输液、维生素Β6、合成泛酸钙、氨基酸纤维和其它有机化合物的原料，还可作为呈鲜剂、调 味剂、酸味剂、抗氧化剂、诱食剂、除草剂，也是合成低热营养甜味剂-阿力甜的主要原料。 其生产已成为继谷氨酸、赖氨酸之后的又一重要的氨基酸产业。在国外，日本的味之素公司从1978年开始规模化生产L-丙氨酸，方法也由提取 法，化学合成法，发展到以L-天冬氨酸(L-Asp)为原料，采用L-天冬氨酸-β-脱羧酶转化 的生物反应法生产。采用化学合成法收率，本高，产品质量差，并且存在严重的污染性，而 采用生物反应法由于简洁的工艺流程，较少的设备投资引起研究和投资者的关注并逐渐采用。目前普遍使用的整体细胞酶催化L-丙氨酸生产工艺中，制酶技术水平的高低是 一个关键，它占据了生产成本的较大比重。由于生产菌种的特性决定了有部分L-天冬氨 酸-β -脱羧酶是存在菌体内的。如用诸如超声波等处理菌体细胞时，细胞壁被破坏，酶释 放出来，酶活力显著提高。但现有生产工艺条件限定了不能采用破壁技术，因此这部份所谓 的胞内酶，在生产中是没有被利用而浪费掉，非常可惜。所以，如何改进制酶工艺，降低制酶 和生产成本是现有生产工艺改进的重点方向。脂肪醇聚氧丙烯醚是一种非离子表面活性剂，浅黄色透明油状液体，难溶于水，易 溶于丙酮和其他有机溶剂，能显著降低溶剂表面张力和液_液界面张力，具有亲水、亲油的 性质，能起乳化、分散、增溶、洗涤等一系列作用，是一种良好的乳化剂、组织改良剂和润滑 剂。在菌种产酶或酶促反应时添加一定量的脂肪醇聚氧丙烯醚，可以显著提高L-天冬氨 酸-β-脱羧酶胞外酶活力及酶促转化反应的稳定性，增加酶的实际使用效率。此技术呈现 较好的应用前景，它可以在不需要改变原有工艺路线和设备的情况下，以较低的成本，增加 有效酶的产量，从而提高单批次投料量，缩短反应时间，提高现有设备利用率和产能，同时 显著地降低生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用脂肪醇聚氧丙烯醚改进的L-丙氨酸制备方法，它 能够克服现有技术中的不足，提高有效酶活力及酶促转化反应的稳定性，缩短反应周期，提 高设备利用率和产能，降低生产成本。为实现本发明的目的，所采用的技术方案为一种添加脂肪醇聚氧丙烯醚制备L-丙氨酸的方法，包括如下步骤
1)菌种培养将从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的假单胞菌(Pseudomonasdacunhae) 菌种(保藏号20147)，接入pH7. O的斜面培养基，30°C条件下培养24h，得到活化的菌种。所述斜面培养基为蛋白胨lg，牛肉膏0. 5g，酵母膏0. 5g，氯化钠0. 5g，琼脂2g， 水 100ml。2)发酵产酶将所述活化的菌种接入pH 7.0的发酵产酶培养基中，30°C条件下培养24h，得到 发酵液，即酶液。所述发酵产酶培养基为富马酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8. 5g，玉米浆6. 5g， KH2PO4O. 3g，MgSO4O. 2g，脂肪醇聚氧丙烯醚 0. 05_2ml，水 1000ml。3)酶促转化在所述酶液中添加0. 05-3ml的脂肪醇聚氧丙烯醚，pH值为4. 5-7. 5，温度为 25°C-45°C的条件下进行酶促转化反应，生成L一丙氨酸粗品。4)产品提取和精制将所述L一丙氨酸粗品加水3000ml，搅拌升温至80°C重溶，添加30g活性炭脱色， 过滤，70°C减压浓缩，冷却析出结晶，离心分离，洗涤，干燥即得L一丙氨酸产品。所述脂肪醇聚氧丙烯醚为分析纯试剂。本发明的有益效果是 1、脂肪醇聚氧丙烯醚用量少，价格便宜，可提高L-天冬氨酸_ β _脱羧酶有效酶活 力和酶促反应稳定性，减少制酶成本。2、不需要改变原有工艺路线和设备，添加方式简单，易操作，方便现有生产线的挖 潜改造。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步描述实施例11)菌种培养将从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的假单胞菌(Pseudomonasdacunhae) 菌种(保藏号20147)，接入pH7. 0的斜面培养基，30°C条件下培养24h，得到活化的菌种。所述斜面培养基为蛋白胨lg，牛肉膏0. 5g，酵母膏0. 5g，氯化钠0. 5g，琼脂2g， 水 100ml。2)发酵产酶将所述活化的菌种接入pH 7.0的发酵产酶培养基中，30°C条件下培养24h，得到 发酵液，即酶液。所述发酵产酶培养基为富马酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8. 5g，玉米浆6. 5g， KH2PO4O. 3g，MgSO4O. 2g，脂肪醇聚氧丙烯醚 0. 05ml，水 1000ml。3)酶促转化反应将底物L-天冬氨酸添加到所述酶液中，添加脂肪醇聚氧丙烯醚0. 05ml,控制 PH4. 5-7. 5，温度25°C，搅拌反应6天，生成L一丙氨酸粗品。
4
4)产品提取和精制将L一丙氨酸粗品加水3000ml，搅拌升温至80°C重溶，添加30g活性炭脱色，过滤， 70°C减压浓缩，冷却析出结晶，离心分离，洗涤，干燥即得L一丙氨酸产品。实施例21)菌种培养将从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的假单胞菌(Pseudomonasdacunhae) 菌种(保藏号20147)，接入pH7. O的斜面培养基，30°C条件下培养24h，得到活化的菌种。所述斜面培养基为蛋白胨lg，牛肉膏0. 5g，酵母膏0. 5g，氯化钠0. 5g，琼脂2g， 水 100ml。2)发酵产酶将所述菌种斜面1支接入pH 7.0的发酵产酶培养基中，30°C条件下培养24h，得到 发酵液，即酶液。所述发酵产酶培养基为富马酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8. 5g，玉米浆6. 5g， KH2PO4O. 3g，MgSO4O. 2g，脂肪醇聚氧丙烯醚 0. 2ml，水 1000ml。3)酶促转化反应将底物L-天冬氨酸添加到所述酶液中，添加脂肪醇聚氧丙烯醚0. 3ml，控制 PH4. 5-7. 5，温度30°C，搅拌反应7天，生成L一丙氨酸粗品。4)产品提取和精制将L一丙氨酸粗品加水3000ml，搅拌升温至80°C重溶，添加30g活性炭脱色，过滤， 70°C减压浓缩，冷却析出结晶，离心分离，洗涤，干燥即得L一丙氨酸产品。实施例31)菌种培养将从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的假单胞菌(Pseudomonasdacunhae) 菌种(保藏号20147)，接入pH7. 0的斜面培养基，30°C条件下培养24h，得到活化的菌种。所述斜面培养基为蛋白胨lg，牛肉膏0. 5g，酵母膏0. 5g，氯化钠0. 5g，琼脂2g， 水 100ml。2)发酵产酶将所述活化的菌种接入pH 7.0的发酵产酶培养基中，30°C条件下培养24h，得到 发酵液，即酶液。所述发酵产酶培养基为富马酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8. 5g，玉米浆6. 5g， KH2PO4O. 3g，MgSO4O. 2g，脂肪醇聚氧丙烯醚 1ml，水 1000ml。3)酶促转化反应将底物L-天冬氨酸添加到所述酶液中，添加脂肪醇聚氧丙烯醚1. 5ml，控制 PH4. 5-7. 5，温度35°C，搅拌反应7天，生成L一丙氨酸粗品。4)产品提取和精制将L一丙氨酸粗品加水3000ml，搅拌升温至80°C重溶，添加30g活性炭脱色，过滤， 70°C减压浓缩，冷却析出结晶，离心分离，洗涤，干燥即得L一丙氨酸产品。实施例41)菌种培养
5
将从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的假单胞菌(Pseudomonasdacunhae) 菌种(保藏号20147)，接入pH7. O的斜面培养基，30°C条件下培养24h，得到活化的菌种。所述斜面培养基为蛋白胨lg，牛肉膏0. 5g，酵母膏0. 5g，氯化钠0. 5g，琼脂2g， 水 100ml。2)发酵产酶将所述活化的菌种接入pH 7.0的发酵产酶培养基中，30°C条件下培养24h，得到 发酵液，即酶液。所述发酵产酶培养基为富马酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8. 5g，玉米浆6. 5g， KH2PO4O. 3g，MgSO4O. 2g，脂肪醇聚氧丙烯醚 2ml，水 1000ml。3)酶促转化反应将底物L-天冬氨酸添加到所述酶液中，添加脂肪醇聚氧丙烯醚3ml，控制 PH4. 5-7. 5，温度45°C，搅拌反应8天，生成L一丙氨酸粗品。4)产品提取和精制将L一丙氨酸粗品加水3000ml，搅拌升温至80°C重溶，添加30g活性炭脱色，过滤， 70°C减压浓缩，冷却析出结晶，离心分离，洗涤，干燥即得L一丙氨酸产品。上述实施例中，底物L-天冬氨酸的投入、产物L-丙氨酸的产出、摩尔转化率、提取
收率结果如下
指标实施例1实施例2实施例3实施例4L-天冬氨酸2820350537054320L-丙氨酸1645207022102520摩尔转化率98%97%97%99%提取收率89%91%92%90%
权利要求
一种添加脂肪醇聚氧丙烯醚制备L 丙氨酸的方法，包括菌种培养、发酵产酶和酶促转化反应、产品提取和精制步骤，其特征在于，所述发酵产酶和酶促转化反应的具体条件为发酵产酶将活化的菌种接入pH 7.0的发酵产酶培养基中，30℃条件下培养24h，得到发酵液，即酶液，所述发酵产酶培养基为富马酸15g，葡萄糖15g，蛋白胨8.5g，玉米浆6.5g，KH2PO40.3g，MgSO40.2g，脂肪醇聚氧丙烯醚0.05 2ml，水1000ml，酶促转化在所述酶液中添加0.05 3ml的脂肪醇聚氧丙烯醚，pH值为4.5 7.5，温度为25℃ 45℃的条件下进行酶促转化反应，生成L 丙氨酸粗品。
全文摘要
一种添加脂肪醇聚氧丙烯醚制备L-丙氨酸的方法，包括菌种培养、发酵产酶和酶促转化反应、产品提取和精制步骤，所述发酵产酶是将活化的菌种接入添加0.05-2ml的脂肪醇聚氧丙烯醚pH7.0的发酵产酶培养基中，30℃条件下培养24h，得到发酵液，即酶液，所述酶促转化反应是在所述酶液中添加0.05-3ml的脂肪醇聚氧丙烯醚，pH值为4.5-7.5，温度为25℃-45℃的条件下进行酶促转化反应，生成L-丙氨酸粗品。该生产工艺简单、易于操作，适宜于大规模工业化生产。
文档编号C12P13/06GK101914583SQ20091011467
公开日2010年12月15日 申请日期2009年12月28日 优先权日2009年12月28日
发明者何鑫平, 吴孔阳, 夏小斌, 康超, 彭康, 曹喜秀, 曹普美, 李湘萍, 李灿明, 李秋蓉, 梁智群, 梁耀星, 汪晟, 白山, 黄时海 申请人:广西大学