专利名称：一种木质纤维原料酶水解的方法
技术领域：
本发明属于木质纤维原料生物降解与转化生产燃料乙醇、化工平台化合物和其他
生物基化学品中的酶水解技术领域，特别涉及一种以纤维素酶分段水解木质纤维素及超滤 回收e-葡萄糖苷酶的方法。
二背景技术：
据预测，地球上可利用的石油资源将在今后几十年内耗竭，从长远看，液体燃料短 缺将是困扰人类社会发展的重大问题。各国科学家一直在积极寻找能够替代或部分替代石 油的新能源。生物乙醇以其可再生性、环保性和使用过程中不引起温室效应等突出优点，被 公认为是汽油的最佳替代品而得到广泛的研究。生产乙醇的原料主要包括淀粉质原料、糖 质和木质纤维原料。由于受到粮食和耕地短缺的制约，单纯以粮食或糖质为原料生产乙醇 的方法，不可能满足迅猛发展的汽车工业对燃料乙醇的需求，因此，研究如何利用可再生的 木质纤维原料大规模生产燃料乙醇，就成为了当前的重要课题。 木质纤维原料生物法制备燃料乙醇主要包括原料预处理、纤维素的酶水解和糖液 (包括戊糖和己糖)发酵三个关键技术。纤维素的酶水解是木质纤维原料生物法制备燃料 乙醇的关键技术之一。纤维素的酶水解过程具有反应温度低，可发酵糖得率高，产生的发酵 抑制物少，能耗较低，设备要求简单、对环境友好等特点，因此，纤维素的酶水解被认为是有 较大工业应用前景的纤维素水解技术。 纤维素酶是水解纤维素成葡萄糖的一组酶的总称，它是一个多组分的复合酶系， 主要有三种组分，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和P-葡萄糖苷酶。纤维素是在这三 种酶的协同作用下彻底水解成葡萄糖的。在纤维素酶水解过程中，内切葡聚糖酶以随机形 式切断纤维素链中的P-l，4-糖苷键生成短链纤维素或纤维低聚糖；随后外切葡聚糖酶主 要作用于短链纤维素和纤维低聚糖的非还原端以生成纤维二糖；最后纤维二糖在P-葡萄 糖苷酶的作用下彻底生成葡萄糖。在纤维素水解过程中，纤维素对纤维素酶系中的内切葡 聚糖酶、外切葡聚糖酶亲和力较大，而对P _葡萄糖苷酶的亲和力较小，因此在纤维素酶水 解体系中，内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶主要吸附在不溶性纤维素上，而P-葡萄糖苷酶主 要存在于水相中。 如何提高纤维素的酶水解效率和得率，是利用可再生木质纤维原料大规模生产燃 料乙醇的技术关键，也是当前国内外相关研究领域的主要研究方向。
已有技术可参考 CN 200810021531. 3 —种将农林废弃物转化为可发酵糖的方法 CN 200810023479. 5蒸汽爆破木质纤维原料可溶性低聚糖同步酶解制取单糖的方
法，等。
三
发明内容
本发明的目的是根据纤维素的酶水解机理，寻找一种在燃料乙醇生产过程中，可
3以提高纤维素的酶水解效率和得率的新方法。 纤维素酶是一种受产物反馈抑制的水解酶类。随着纤维素酶水解过程的进行，反 应体系中不断累积的纤维二糖，将会抑制纤维素酶系中内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活 力；葡萄糖在反应体系中的不断累积，则会抑制P-葡萄糖苷酶的活力，且更加敏感。
针对上述存在的问题，在酶解反应体系中，一般可以通过添加外源e-葡萄糖苷
酶的方法来降低纤维二糖对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制作用；而葡萄糖对P-葡 萄糖苷酶的抑制作用，则可通过及时移走生成的单糖或同步糖化发酵(SSF)技术来解除， 但SSF法由于酶解与发酵工艺对温度的需求存在较大差异，从而限制了它的工业应用。
本发明通过纤维素酶分段水解木质纤维原料并及时移走酶反应生成的产物来减 轻产物对纤维素酶的抑制作用，通过添加P _葡萄糖苷酶的方法水解移走反应液中的纤维 二糖成葡萄糖，并采用超滤的方法回收利用反应液中的纤维素酶和P-葡萄糖苷酶。
本发明的技术解决方案为一种木质纤维原料酶水解的方法，其特征是采用分段 酶解木质纤维原料和超滤回用纤维素酶和P-葡萄糖苷酶的工艺，具体工艺流程如下
a.将经过适当预处理的木质纤维原料在底物固液重量比为1 : 3 20，纤维素酶 用量5 25FPIU/g纤维素，pH值4 6，45 50。C条件下水解，分别在水解6h、12h和24h 时进行固液分离，用蒸馏水洗涤酶解渣； b.分别将上述6、12h阶段的固液分离液、洗涤液合并，用截留分子量为 10kDa(Da——截留分子量单位，道尔顿)的超滤膜回收液体中的纤维素酶，并用于下一阶段 的酶水解； c.分别在a步骤获得的洗涤酶解渣中添加一定pH值的水溶液、b中回收的纤维素 酶后于pH值4 6，45 5(TC条件下继续进行下一段酶解直至24h ; d.将超滤回收过纤维素酶后的液体减压浓縮至纤维二糖浓度为30g/L，添加1 2IU/ml以上的外源P-葡萄糖苷酶，在pH值4 6，45 5(TC条件下水解2 4h，获得酶 解液； e.用截留分子量为30kDa的超滤膜回收利用d中所得酶解液中的P _葡萄糖苷 酶。 回收的P-葡萄糖苷酶作为外源P-葡萄糖苷酶用于下一批次酶水解，超滤后的 酶解液用于下一步的糖液乙醇发酵。 如上述过程a中所述，也可以采用在水解12h时进行固液分离的两段酶解方法简
化工艺过程，但纤维素水解得率略有降低。 分段酶解的流程示意简图参见附图5和附图6。 有益效果采用上述分段酶解木质纤维原料和超滤分别回用纤维素酶和13 _葡萄 糖苷酶的工艺，由于反应过程中纤维二糖和葡萄糖的及时移除，大大减轻了反应产物对纤 维素酶的抑制作用，提高了纤维素的水解得率和纤维二糖转化为葡萄糖的效率，且可明显 縮短酶解反应的时间。
四
图1为纤维素酶三段法水解蒸汽爆破预处理玉米秸杆，纤维素水解得率随时间的 变化规律；
4
图2为|3 _葡萄糖苷酶均相水解纤维二糖的历程； 图3为|3 _葡萄糖苷酶的回收及回收13 -葡萄糖苷酶对纤维二糖的水解作用；
图4为纤维素酶一段法水解蒸汽爆破预处理玉米秸杆，纤维素水解得率随时间的 变化规律； 图5为三段酶解流程的示意简图；
图6为两段酶解流程的示意简图。
五具体实施例方式实施例1 :纤维素酶三段法水解蒸汽爆破预处理玉米秸秆 1.以蒸汽爆破、水洗预处理的玉米秸秆为木质纤维原料，在固液重量比为1 : 3 20，纤维素酶用量5 25FPIU/g纤维素，pH值4 6、温度为45 5(TC的条件下，低速搅 动水解6h后进行固液分离。 2.水解物于4000转/分条件下离心10min，收集上清液，测定糖液中纤维二糖和 葡萄糖的含量，计算纤维素酶水解得率。离心获得的酶解渣用蒸馏水洗涤两次，于10000转 /分下离心5min，分别收集上清液和酶解渣。 糖浓度测定采用高效液相色谱(HPLC)法。色谱仪Agilent 1100 ;色谱柱 Bio-rad HPX-87H ;柱温50 。C ;流动相0. 005mol/L H2S04 ;流速0. 6mL/min ;上样量
10ilL;检测器RID检测器。 纤维素水解得率Y用下式计算
Y = [(CXLXO. 9)/(GXW)] X100
式中 Y-纤维素水解得率，％ ;
L-水解糖液体积，L; C-水解液中葡萄糖和纤维二糖浓度，g/L ;
0. 9-纤维素和葡萄糖、纤维二糖的转换系数；
G-原料重，g ;
W-原料中纤维素含量，％。 3.合并上述三次离心分离获得的糖液，用截留分子量10kDa的超滤膜回收其中的 纤维素酶组分，分别收集纤维素酶和糖液。 4.在步骤2获得的洗涤酶解渣中添加用硫酸调节的pH值为4 6的水、步骤3回 收的纤维素酶，使反应体系总体积与初始反应体积一致，于pH值4 6、温度为45 50°C 的条件下，低速搅动水解6h后进行固液分离。
5.重复步骤2和3。 6.在步骤5获得的洗涤酶解渣中添加用硫酸调节的pH值为4 6的水、步骤5回 收的纤维素酶，使反应体系总体积与初始反应体积一致，于pH值4 6、温度为45 50°C 的条件下，低速搅动水解12h后进行固液分离。 7.水解物于4000转/分条件下离心10min，收集上清液，测定糖液中纤维二糖和 葡萄糖的含量，计算纤维素酶水解得率。离心获得的酶解渣用蒸馏水洗涤两次，于10000转 /分下离心5min，收集合并上述离心上清糖液，弃用洗涤酶解渣。
实验结果如图1所示。结果表明木质纤维原料经分段酶水解后，纤维素水解得率 显著提高，酶水解时间大大縮短。与未分段的木质纤维原料酶水解工艺相比，采用三段酶水 解法可使纤维素水解得率从52. 06%提高到70. 16%，酶水解时间从48h减少到24h。
实施例2 : 13 -葡萄糖苷酶均相水解纤维二糖糖液及超滤回收复用13 -葡萄糖苷酶
1.合并实施例1中分段水解所得糖液，减压蒸发浓縮至纤维二糖浓度为30g/L。
2.将上述浓縮糖液添加P-葡萄糖苷酶、缓冲液和蒸馏水，P-葡萄糖苷酶的添 加量分别为1和2IU/ml，控制水解体系pH值4 6， 45 50°C的温度下低速搅动水解1 6h。 3.水解结束后，测定水解液中纤维二糖和葡萄糖的含量，计算P-葡萄糖苷酶水 解纤维二糖的水解得率。用截留分子量为30kDa的超滤膜回收水解液中的P-葡萄糖苷酶， 测定P-葡萄糖苷酶的酶活，并计算P-葡萄糖苷酶的回收率。 4.回收的P-葡萄糖苷酶用于下一批次分段水解所得糖液的浓縮液中纤维二糖 的水解，重复使用8批次。 结果表明在(6+6+12)h三段水解糖液的浓縮液中分别加入1IU/ml和2IU/ml的 P -葡萄糖苷酶，水解3h时，水解液中纤维二糖浓度分别为4. 19g/L和1. 63g/L，如附图2所 示，并据此确定合适的外源P-葡萄糖苷酶的添加量为^ 1 2IU/ml，酶解时间为2 4h。
用30kDa的超滤膜回收纤维二糖水解液中的P _葡萄糖苷酶并用于下一批次的酶 解，回用第一轮酶回收率为98. 87% ，纤维二糖水解为葡萄糖的得率为92. 71 %;回用至第八 轮酶回收率为95. 25%，纤维二糖水解为葡萄糖的得率为90. 87%，结果如附图3。
实施例3 :纤维素酶两段法水解蒸汽爆破预处理玉米秸秆 参照实施例1和2的方法，采用(12+12) h两段水解的方法简化工艺过程，24h纤维 素水解得率约为59. 12%。两段或三段法酶解工艺分阶段得率情况见下表
蒸汽爆破玉米秸杆分段酶解结果
方案纤维素水解得率(％)
第一段第二段第三段合计
(12+12) h39.7019.50/59.20
(6+6+12) h31.7621.2117.1970.16 不管采用两段法或三段法酶解工艺，固液分离的具体分段时间，完全可以考虑生 产调度的方便而允许在一定的范围内进行变动。 采用更多分段的固液分离处理工艺，虽然可以在一定程度上继续提高酶解的效率 和得率，但会增加处理的成本，故不予考虑。
比较例1 :纤维素酶一段法水解蒸汽爆破预处理玉米秸秆 1.固液比、纤维素酶用量、pH值、温度条件同实施例l，低速搅动水解48h后进行 固液分离。 2.于不同时间点取样，测定上清液中纤维二糖和葡萄糖的含量，并计算纤维素酶 水解得率。实验结果如图4。 结果表明，采用传统的一段法酶水解蒸汽爆破玉米秸杆，24h纤维素水解得率为 52. 06% ;48h纤维素水解得率为59. 14%。
权利要求
一种木质纤维原料酶水解的方法，用经过预处理的木质纤维作原料，其特征是采用分段酶解和超滤回用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的工艺，具体流程如下a.原料固液重量比为1∶3～20，纤维素酶用量5～25FPIU/g纤维素，在pH值4～6，45～50℃条件下水解，分别在水解6h、12h和24h时进行固液分离，用蒸馏水洗涤酶解渣，分别合并上述各阶段的固液分离液、洗涤液，用截留分子量为10kDa的超滤膜回收6、12h分离、洗涤合并液中的纤维素酶，并用回收的纤维素酶继续下一段水解洗涤后的固体渣直至水解24h；b.将超滤回收过纤维素酶后的液体减压浓缩至纤维二糖浓度为30g/L，添加1～2IU/ml以上的β-葡萄糖苷酶，在pH值4～6，45～50℃条件下水解2～4h；c.用截留分子量为30kDa的超滤膜回收利用b中所得酶解液中的β-葡萄糖苷酶。
2. 如权利要求1所述的木质纤维原料酶水解的方法，其特征是在la中，在水解12h时 进行固液分离并进行相同的b， c处理。
全文摘要
一种木质纤维原料酶水解的方法，用经过预处理的木质纤维作原料，其特征是采用分段进行酶解和超滤回用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的工艺。由于反应过程中纤维二糖和葡萄糖的及时移除，大大减轻了反应产物对纤维素酶的抑制作用，提高了纤维素的水解得率和纤维二糖转化为葡萄糖的效率，且可明显缩短酶解反应的时间。
文档编号C12P7/10GK101705254SQ20091021269
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月16日 优先权日2009年11月16日
发明者余世袁, 勇强, 杨静 申请人:南京林业大学