专利名称：类胡萝卜素的发酵法的制作方法
技术领域：
本发明涉及类胡萝卜素的微生物学制备方法。详细来讲，本发明涉及利用微生物发酵来制备虾青素、角黄素(canthaxanthin)、玉米黄质(zeaxanthin)、β -隐黄素 (β -cryptoxanthin)、番爺红素(Iycopene)、β -古月萝卜素、绿蚬黄质(phoenicoxanthin)、 侧金盏花黄质(adonixanthin)、海胆烯酮(echinenone) ,Asteroidenone和3_羟基海胆酮 (3-hydroxyechinenon)等类胡萝卜素的方法。
背景技术：
类胡萝卜素是可作为饲料添加剂、食品添加剂、医药品等的有用的天然色素。类胡萝卜素包括虾青素、角黄素、玉米黄质、隐黄素、番茄红素、胡萝卜素、绿蝇黄质、侧金盏花黄质、海胆烯酮、Asteroidenone和3-羟基海胆酮等。在此之中，虾青素作为鲑鱼、鳟鱼、真鲷(red sea bream)等养殖鱼类的体色改良剂、家禽类的蛋黄颜色改良剂等饲料添加剂是有用的。此外，虾青素作为安全的天然食品添加剂以及健康食品用的素材，在产业上的价值高。通过确立侧金盏花黄质和绿蝇黄质的工业化制备方法，可以期待其与虾青素同样的作为饲料添加剂、食品添加剂、医药品等的用途。此外，胡萝卜素被作为饲料添加剂、 食品添加剂、医药品等使用，角黄素被作为饲料添加剂、食品添加剂、化妆品等使用，玉米黄质被作为食品添加剂、饲料添加剂等使用。此外，番茄红素、海胆烯酮、隐黄素、3-羟基海胆酮、Asteroidenone等也被期待能够作为饲料添加剂、食品素材等使用。作为这些类胡萝卜素的制备方法，已知的有化学合成法、从天然物质提取的方法、由微生物产生的方法等。
作为虾青素的化学合成法，已知的有由β -胡萝卜素进行转换的方法(非专利文献 1 =Pure Appl. Chem.，57，741，1985)和由 C15 磷盐(phosphonium salt)进行合成的方法 (非专利文献2 =Helv. Chim. Acta, 64，2436，1981)。由这些化学合成法所制备的虾青素作为饲料添加剂被销售。此外，虾青素存在于真鲷、鲑鱼等鱼类以及虾、蟹、磷虾(krill)等甲壳类中，也可以从这些中进行提取。
作为利用微生物的虾青素的生产方法，已得到报导的方法有利用绿藻类雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的培养法(专利文献1 日本特开2007-97584)、利用红色酵母红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)的发酵法(专利文献2 日本特开平11-69969) 和利用属于副球菌(Paracoccus)属的细菌(在下文中也称为“副球菌属细菌”)的发酵法。作为生产虾青素的属于副球菌属的细菌的例子，可以列举出E-396株和A-581-1 株(专利文献3 日本特开平7-79796以及非专利文献3 international Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282)。作为其它具有虾青素生产性的属于副球菌属的细菌，可以列举出马氏副球菌(Paracoccus marCuSii)MHl株(专利文献4:日本特表 2001-512030)、Paracoccus haeundaensis BC74171 株(__专禾U文献 4 Jnternational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54,1699-1702) >glJ J<|ii 属细菌N-81106菌株(专利文献5 日本特开2007-24420 、产玉米素副球菌(Paracoccuszeaxanthinifaciens) ( ^ ^ ^1J5 International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238)以及 Paracoccus sp. PC-1 株(专利文献 6 :W0 2005/118812)等。
但是，上述类胡萝卜素的制备方法存在几个问题点。例如，从安全性的观点来看， 化学合成法是会给与消费者不好印象的方法。此外，从天然物中提取的制备成本高。此外， 利用绿藻类或酵母进行生产则因为生产性低下并且具有坚固的细胞壁，因此存在难于提取类胡萝卜素的问题。
一方面，属于副球菌属的细菌，具有增殖速度快、类胡萝卜素的生产性高、提取容易等优点，已经报导了几种培养方法。在日本特开2007-143492(专利文献7)中公开了在培养过程中添加铁盐的方法，此外，在日本特开2008-167665 (专利文献8)中公开了限制碳源浓度的方法，但这些方法中大量使用价格昂贵的酵母提取物(yeast extract)作为培养基的原料，因此在商业上和工业上实用性不理想。
现有技术文献 专利文献 专利文献1 专利文献2 专利文献3 专利文献4 专利文献5 专利文献6 专利文献7 专利文献8 非专利文献 非专利文献1 =Pure Appl. Chem.，57，741，1985 非专利文献2 :Helv. Chim. Acta, 64, 2436,1981 __专禾Ij文献 3 international Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49,277-282 __ 专禾U 文■ 4 :International Journal of Microbiology(2004)，54，1699-1702 __ 专禾U 文■ 5 :International Journal of Microbiology(2003)，53，231-238
发明内容
发明所要解决的问题 本发明是鉴于这样的实际情况而进行的，其目的在于提供一种高产率并且低成本的制备类胡萝卜素的微生物学方法。
解决问题的方法 本发明人等为了解决上述问题进行了种种探讨，结果发现了在产生类胡萝卜素的细菌的培养中，通过在细菌培养中通常使用的培养基中进一步添加谷氨酸钠等氨基酸或者日本特开2007-97584号公报 日本特开平11-69969号公报 日本特开平7-79796号公报 日本特表2001-512030号公报 日本特开2007-244205号公报 国际公开第2005/118812号小册子 日本特开2007-143492号公报 日本特开2008-167665号公报
Systematic and Evolutionary Systematic and Evolutionary氨基酸盐，能够提高类胡萝卜素的生产性，从而完成了本发明。
即，本发明提供一种制备类胡萝卜素的方法，该方法包括使用添加了氨基酸的培养基培养产生类胡萝卜素的细菌，并从所得到的培养物中收集类胡萝卜素的步骤；其中 所述氨基酸为选自谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸、以及这些物质的盐中的至少一种。
在所述方法中，氨基酸优选为谷氨酸或谷氨酸盐。
此外，氨基酸的添加浓度，例如为lmmol/L至200mmol/L。在本说明书中，“氨基酸的添加浓度”是指在添加了该氨基酸的培养基中所达到的氨基酸的浓度(即，被添加的氨基酸在培养基中的浓度)。
此外，所述类胡萝卜素，例如是选自虾青素、角黄素、玉米黄质、β-隐黄素、番茄红素、β-胡萝卜素、绿蝇黄质、侧金盏花黄质、海胆烯酮、Asteroidenone和3-羟基海胆酮中的至少一种。
在所述方法中，细菌优选使用属于副球菌属的细菌。此外，所述细菌，可以是16S 核糖体RNA所对应的DNA碱基序列和SEQ ID NO 1记载的碱基序列具有95%以上的同源性的细菌。特别是，所述细菌优选Ε-396株(FERM ΒΡ-4283)、或Α-581-1株(FERM ΒΡ-4671)、 或这些菌株的突变株。
发明的效果 本发明使得更加高效率地制备高浓度的类胡萝卜素成为可能。此外，本发明使得以微生物学方法低成本地制备类胡萝卜素成为可能。
具体实施例方式以下，对本发明进一步进行详细说明。本发明的范围不局限于这些说明，除了以下的例示以外，可以在不违背本发明的要点的范围内适当进行改变来进行实施。
需要说明的是，将本说明书中引用的全部出版物，例如现有技术文献、公开公报、 专利公报以及其它专利文献中的全部内容并入本说明书中作为参考。本说明书包含作为本申请要求优先权的基础的日本特愿2008-268106号说明书中的内容。
本发明提供一种培养产生类胡萝卜素的细菌来制备类胡萝卜素的方法，其中本方法在培养基中添加特定的氨基酸。本发明的方法使得更加高效率并且低成本地制备高浓度的类胡萝卜素成为可能。
在本发明中所用的细菌，只要是产生类胡萝卜素的细菌即可，没有任何限制，优选为属于副球菌属的细菌。在属于副球菌属的细菌中，优选使用Paracoccus carotinifaciens> 马氏 glj 求胃(Paracoccus marcusii) > Paracoccus haeundaensis 禾口产玉米素畐Ij 球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens),特另Ij 优选使用 Paracoccus carotinifaciens。作为属于副球菌属的细菌的具体的菌株的例子，可以列举Paracoccus carotinifaciens E-396株和副球菌属细菌A-581-1株(FERM BP-4671)，这些菌株在本发明中也优选使用。
此外，优选16S核糖体RNA所对应的DNA碱基序列和SEQ ID NO 1记载的E-396 株的碱基序列具有高同源性的细菌作为产生类胡萝卜素的细菌。在这里所谓“具有高同源性”，是指例如与SEQ ID NO 1中所记载的碱基序列相比，细菌对应的碱基序列优选95%以上、进一步优选96 %以上、更优选97 %以上、特别优选98 %以上、最优选99 %以上相同。
与16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列，是指将16S核糖体RNA的碱基序列中的U(尿嘧啶)置换为T(胸腺嘧啶)的碱基序列。
基于该16S核糖体RNA的碱基序列的同源性的微生物分类法近年来成为主流。以往的微生物分类法是基于该微生物的运动性、营养要求性、糖同化性等菌学性质来分类的， 因此当产生自然突变的形质变化等时，存在对微生物发生误分类的情况。相对于此，16S核糖体RNA的碱基序列在遗传上极为稳定，因此基于其同源性的分类法与以往的分类法相比分类的可靠性得到大幅度提高。
Paracoccus carotinifaciens E-396 株的 16S 核糖体 RNA 的碱基序列和其他的产生类胡萝卜素的细菌马氏副球菌(Paracoccus marcusii)DSM 11574株、副球菌属细菌 N-81106 株、Paracoccus haeundaensis BC 74171 株、畐Ij球菌属细菌 A-581—1 株、产玉 7^ 1] lif (Paracoccus zeaxanthinifaciens) ATCC21588 _禾口 Paracoccus sp. PC-I ^ 的16S核糖体RNA的碱基序列的同源性，分别为99. 7%、99. 7%、99. 6%、99. 4%、95. 7%和 95.4%，可见这些菌株在分类学上为极为近缘的菌株。因此，可以说这些菌株是产生胡萝卜素的细菌所组成的一个群组。因此，这些菌株在本发明中优选使用，能够高效率地产生类胡萝卜素。
在本发明中，也可以使用类胡萝卜素的生产性得到改良的突变株。作为得到改良的突变株的例子，可以列举虾青素生产性能高的菌株(日本特开2001-95500)、能够选择性地产生大量角黄素的菌株(日本特开2003-30487 、能够选择性地产生大量玉米黄质和 β-隐黄素的菌株(日本特开2005-87097)、能够选择性地产生番茄红素的菌株(日本特开 2005-87100)。
类胡萝卜素的生产性得到改良的突变株，可以通过突变处理和筛选来取得。进行突变处理的方法只要能够诱发突变即可，没有特别限制。例如，可以采用使用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)等突变剂的化学方法、紫外线照射和X射线照射等物理方法、基因重组和转座子等生物学方法等。进行突变处理的细菌没有特别限制，优选为产生类胡萝卜素的细菌。此外，突变株也可以是由自然发生的突然突变所产生的。
突变株的筛选方法没有特别限制，例如，除了通过在琼脂培养基上的菌落的颜色来对目标突变株进行选择的方法之外，可以列举在试管、烧瓶、发酵罐等中对突变株进行培养，利用吸光度、高速液相色谱、薄层层析等进行类胡萝卜素色素分析而选择目标突变株的方法。
突变和筛选的步骤可以是一次，此外，可以将突变和筛选步骤反复进行两次以上， 从而例如由突变处理和筛选而得到突变株，并且进一步进行突变处理和筛选而获得生产性得到改良的突变株。
作为本发明中使用的产生类胡萝卜素的细菌的例子举出的Ε-396株，如下所述国际保藏于日本独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
国际保藏机构日本独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(旧名称日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所) 邮政编码 305-8566 日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6 识别标识E-396 保藏号FERMBP-4283 原保藏日平成5年(1993年)4月27日 此外，作为本发明中使用的产生类胡萝卜素的细菌的其他例子举出的A-581-1 株，是在上述机构中如下进行国际保藏的。
识别标识A-581-1 保藏号FERMBP-4671 原保藏日平成6年(1994年)年5月20日 在本发明中，与使用没有添加该氨基酸的培养基进行培养时相比，通过在特定的氨基酸添加培养基中对上述产生类胡萝卜素的细菌进行培养，能够高浓度地生产更加大量的类胡萝卜素。
对由本发明的方法生成的类胡萝卜素没有特别限制，例如是虾青素、角黄素、 玉米黄质、隐黄素、番茄红素、胡萝卜素、绿蝇黄质、侧金盏花黄质、海胆烯酮、 Asteroidenone或3-羟基海胆酮，优选为虾青素、角黄素、玉米黄质或β-隐黄素，更优选为虾青素、玉米黄质或隐黄素。由本发明所制备的类胡萝卜素可以是一种，也可以是多种组合而成的。
下面对本发明中的所述细菌的培养方法进行说明。
在本发明的培养中使用的类胡萝卜素生产用培养基，是添加了特定氨基酸的氨基酸添加培养基，并且，只要是产生类胡萝卜素的细菌能够生长繁育并且生产类胡萝卜素的培养基即可，没有特殊限制，优选使用含有碳源、氮源、无机盐类以及视需要含有维生素类等的培养基。即，在本发明中，氨基酸被添加到产生类胡萝卜素的细菌可以生长繁育并且产生类胡萝卜素的培养基(例如标准的类胡萝卜素生产用培养基)中。
作为碳源，可以列举例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和麦芽糖等糖类，醋酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和丙酮酸等有机酸，乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和甘油等醇类，大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和亚麻籽油等油脂类等，其中优选使用葡萄糖或蔗糖。在这些碳源中，可以使用1种或2种以上。在培养前的培养基(初始培养基)中添加的量可以依碳源的种类不同而适当调整，通常在每IL 培养基中为1至100g、优选2至50g。此外，不但可以在初始培养基中添加碳源，也优选在培养过程中逐次的或连续的进行补加供给。
作为无机氮源，可以使用硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐类、硝酸钾等硝酸盐类、氨气和尿素等中的1种或2种以上。添加量可以依氮源的种类而适当进行调整，通常相对于IL培养基为0. Ig至20g，优选为0. 2至10g。
作为有机氮源，可以使用例如玉米浆(corn steep liquor)(含过滤处理物)、药用培养基(pharmamedia)、大豆饼(大豆粕)、大豆粉、花生粉(peanuts meal)、、酒糟可溶物 (distiller’ s solubles)和干燥酵母等中的1种或2种以上。添加浓度可以依氮源的种类而适当进行调整，通常为0至80g/L，优选为0至30g/L。
无机氮源和有机氮源通常添加在初始培养基中，也优选进行逐次的或连续的补加供给。
作为无机盐类，使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠等磷酸盐类、硫酸镁、氯化镁等镁盐类、硫酸铁、氯化铁等铁盐类、氯化钙、碳酸钙等钙盐类、碳酸钠、氯化钠等钠盐类、硫酸锰等锰盐类、氯化钴等钴盐类、硫酸铜等铜盐类、硫酸锌等锌盐类、钼酸钠等钼盐类、硫酸镍等镍盐类、硒酸钠等硒盐类、硼酸和碘化钾等中的1种或2种以上。添加量可以依无机盐的种类不同而适当进行调整，通常相对于IL培养基为0. 0001至15g。添加磷酸盐类、镁盐类、钙盐类、钠盐类和铁盐类时，优选为0. 02至15g/L，添加锰盐类、钴盐类、铜盐类、锌盐类、钼盐类、镍盐类、硒盐类、硼酸、碘化钾等时，优选的浓度为0. 1至15mg/L。无机盐类通常添加在初始培养基中，也可以逐次的或者连续的进行补加供给。
作为维生素类，可以使用例如氰钴胺素(cyanocobalamin)、核黄素、泛酸、吡哆醇、 硫胺素、抗坏血酸、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、生物素、肌醇、胆碱等。添加比例可以依维生素类的种类不同而适当进行调整，通常在IL培养基中为0. 001至lOOOmg，优选0. 01至 IOOmgo维生素类通常添加在初始培养基中，也可以逐次的或者连续的进行补加供给。
本发明的特征，是在添加了氨基酸的类胡萝卜素生产用氨基酸添加培养基中对产生类胡萝卜素的细菌进行培养。通过在类胡萝卜素生产用氨基酸添加培养基中培养产生类胡萝卜素的细菌，与在没有添加该氨基酸的培养基中进行培养的情况相比，能够制备高浓度的更加大量的类胡萝卜素。
本发明中所用的氨基酸，不是水解酪蛋白氨基酸、酵母提取物、蛋白胨等具有复杂成分的天然混合物中所含有的氨基酸，而是一定程度上经过纯化的纯物质(单品)，也就是分离物。在天然混合物中不但含有有效的氨基酸，并且存在含有无用的或是阻碍性的成分的可能性，并且不同的批次可能存在成分的差异。此外，水解酪蛋白氨基酸、酵母提取物、蛋白胨等天然混合物的价格昂贵，在工业上的利用价值低。
纯化氨基酸的纯度，优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上。但是，在不会阻碍产生类胡萝卜素的细菌的生长繁育的水平，或不会阻碍产生类胡萝卜素的细菌的类胡萝卜素生成的水平的条件下，本发明所用的氨基酸也可以含有该氨基酸以外的成分。此时使用的氨基酸，例如优选为不含有杂质等其他成分的纯粹的氨基酸，但在不阻碍所述类胡萝卜素的产生的情况下也可以是未纯化的(例如纯度低于90% 的氨基酸)。
作为在类胡萝卜素生产用培养基中添加的氨基酸，优选谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸、或这些物质的盐。这些氨基酸优选L构型，也可以是L构型和D构型的混合物。更优选为谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺、或这些物质的盐，更优选谷氨酸或天冬氨酸或这些物质的盐。其中，谷氨酸或谷氨酸盐具有优异的类胡萝卜素生产效果，因此优选使用。 L-谷氨酸钠或其水合物价格低廉，因此特别优选使用。
作为与酸形成的盐，可以列举例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐以及甲酸、醋酸、乳酸等有机酸盐等。此外，作为与碱形成的盐，可以列举钠盐、钾盐等碱金属盐、钙盐、镁盐等碱土金属盐、三甲胺、三乙胺、吡啶等有机碱盐、铵盐等。
添加到类胡萝卜素生产用培养基中的氨基酸可以是所述氨基酸中的至少1种以上，可以添加1种也可以添加2种以上的氨基酸。
在必需氨基酸中半胱氨酸、赖氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸对于类胡萝卜素的生产有阻碍作用，因此在本发明中优选添加到培养基中的氨基酸不包括这些氨基酸。
氨基酸通常添加在初始培养基中，也可以在培养过程中间歇的或连续的进行添加，此外，在初始培养基中添加并进一步在培养过程中间歇的或者连续的进行补加添加也是可以的。
本发明方法中的氨基酸添加浓度(即所添加的氨基酸在培养基中的浓度)没有特别的下限，优选lmmol/L以上、更优选3mmol/L以上、进一步优选5mmol/L以上、特别优选lOmmol/L、最优选15mmol/L以上。氨基酸的添加浓度没有上限，优选200mmol/L以下、 更优选150mmol/L以下、进一步优选lOOmmol/L以下、并且更优选80mmol/L以下、特别优选 60mmol/L以下、最优选50mmol/L以下。因此，在本发明中，氨基酸添加浓度为例如lmmol/L 至 200mmol/Lo 在本发明中，优选使用用于抑制培养液起泡的消泡剂。消泡剂的种类，只要是有能够抑制泡沫的发生或消去泡沫的作用、并且对于生产菌的阻碍作用小的消泡剂即可，没有特别限制。例如，可以列举醇系消泡剂、聚醚系消泡剂、酯系消泡剂、脂肪酸系消泡剂、硅系消泡剂、磺酸系消泡剂等。添加量可以依消泡剂种类的不同而适当进行调整，通常相对于IL 培养基为O.Olg至10g。
消泡剂通常添加在灭菌前的初始培养基中。并且，可以在培养过程中连续或者间歇的补加添加消泡剂。作为在培养过程中添加消泡剂的方法，可以列举如下方法用传感器感知泡沫而进行自动添加的方法；用程序计时器按一定时间间隔进行添加的方法；与饲养用碳源、氮源或PH调节剂等混合并添加从而与生长繁育速度连动的方法等。在初始培养基中添加的消泡剂与在培养过程中向培养液中添加的消泡剂可以使用相同种类的，也可以根据用途不同而使用不同的种类。
在本发明中，将添加了氨基酸的氨基酸添加培养基的初期pH值调整为2至12、优选6至9、更优选6.5至8.0。在培养中也优选将pH保持于上述范围。作为pH调节剂，可以列举氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、氨水、氨气、硫酸水溶液或这些物质的混合物。
在本发明中，氨基酸添加培养基是在进行了灭菌处理后用于细菌的培养。灭菌处理只要是本领域技术人员即可适当进行。例如可以使用高压灭菌锅对于在适当容器中的培养基进行加热灭菌。或者使用灭菌过滤器进行过滤灭菌即可。
在本发明中，将类胡萝卜素生产细菌接菌在如上所述制备的氨基酸添加培养基中，并在一定的条件下进行培养。接菌通常是通过使用试管、烧瓶或者发酵罐等种子培养适当增殖的菌株、将得到的培养物添加到类胡萝卜素生产用氨基酸添加培养基中来进行。在种子培养中所用的培养基只要是能够使类胡萝卜素生产菌良好增殖的培养基即可，没有特殊限制，可以是添加了特定氨基酸的培养基，也可以是没有添加氨基酸的培养基。
培养可以在适当的培养容器中进行。培养容器可以依照培养容量而适当选择，例如可以列举试管、烧瓶、发酵罐等。
培养温度为15至80°C、优选20至35°C、更优选25°C至32°C，通常在需氧条件下进行培养1至20天、优选2至12天、更优选3至9天。所谓需氧条件，例如可以列举振荡培养或通气搅拌培养等，优选将溶解氧浓度控制在一定的范围内。溶解氧浓度的控制，例如可以通过改变搅拌转速、通气量、内压等来进行。优选将溶解氧浓度控制到0. 3至lOppm、更优选0. 5至7ppm、进一步优选1至5ppm。
在本发明中，可以通过高速液相色谱来定量培养产生类胡萝卜素的细菌而得到的培养物中的类胡萝卜素，或从培养物中经某种纯化操作而收集的类胡萝卜素。
如上所述，可以培养产生类胡萝卜素的细菌，并从得到的培养物中收集类胡萝卜素。
培养物可以列举例如培养液、培养上清液、菌体浓缩液、湿菌体、干燥菌体、菌体溶解物等。培养上清液可以通过将培养液进行离心处理或过滤处理而从培养液中除去菌体来进行制备。菌体浓缩液可以通过将培养液进行离心分离或者膜过滤浓缩而得到。湿菌体可以通过将培养液进行离心分离或过滤而得到。干燥菌体可以通过按照一般的干燥方法对湿菌体或菌体浓缩液进行干燥而得到。这样得到的含类胡萝卜素的干燥菌体可以直接作为饲料添加剂使用。
对本发明中从所述培养物中收集类胡萝卜素的方法没有特别限制，能够稳定并且高效率地回收类胡萝卜素的任何方法均可。这些方法可以从本领域技术人员公知的提取技术和纯化技术中适当选择。
在从培养物中提取类胡萝卜素之前，可以对培养物进行下述处理中的一种或两种以上，所述处理为使用碱性试剂或表面活性剂等的化学处理；使用溶菌酶、脂质分解酶和蛋白质分解酶等的生物化学处理；或超声波或破碎等的物理处理。
例如，从培养物中提取类胡萝卜素时，对提取和洗涤所用的溶剂没有特别限制，可以列举出甲醇、乙醇、异丙醇等低级醇类、丙酮、四氢呋喃、甲乙酮、甲基异丁基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。
在提取操作中欲极力防止类胡萝卜素的氧化时，可以在氮气等不活性气体环境中进行处理。此外，可以选择在医药品或食品等中所用的抗氧剂添加到提取溶剂中。或者可以将这些处理组合使用。
此外，为了极力防止光引起的类胡萝卜素的分解，可以在不见光的条件下进行。
这样得到的提取物可以作为类胡萝卜素直接使用，也可以进一步进行纯化再加以使用。
对从提取操作后的提取物中分离细菌等的方法没有特别限制，可以使用膜过滤、 离心分离、滗析(decantation)等。
从提取物得到类胡萝卜素沉淀物的方法，一般来说可以列举出加热和/或减压浓缩以及结晶析出法。此外，在低温下进行类胡萝卜素色素的析出，或由酸/碱药剂或各种盐类进行析出可以使类胡萝卜素色素在不浓缩的情况下得到分离。
在工业上使用时，优选进行结晶析出。
所得到的类胡萝卜素沉淀物，可以视用于清洗的需要使用少量的低级醇类等溶剂进行悬浮搅拌。
对清洗的方法没有特别的限制，例如作为实用性强的优选方法可以举例在悬浮搅拌后进行过滤回收的方法，或在沉淀物上流通液体的方法等。
如上所述得到的培养物、提取物或纯化物，可以分别单独作为类胡萝卜素使用，也可以将这些按照任意的比例混合后使用。
实施例 以下给出实施例对本发明进行具体的说明，但本发明的范围不局限于以下的例子。
需要指出的是，在实施例中可以使用高速液相色谱(HPLC)法如下进行类胡萝卜素类的定量。
柱是将Wakosil-II 5SIL-100 ( Φ 4. 6 X 250mm)(和光纯药制)2根连接在一起后使用的。在室温附近的一定温度下按照每分钟l.OmL通入作为流动相的正己烷-四氢呋喃-甲醇混合液GO 20 1)进行洗脱。在测定时，将用流动相将溶解有样品的四氢呋喃再稀释100倍，并将稀释后的液体20 μ L作为注入量，柱洗脱液的检测在波长470nm条件下进行。此外，作为定量用的标准品，使用了 Sigma公司制的虾青素(Cat. No. A9335)。在测定了标准液在477nm处的吸光度(A)以及在上述条件下进行HPLC分析时的虾青素峰的面积百分比％ (B)后，使用下述公式来设定标准液的虾青素浓度。
虾青素的浓度(mg/L)= A + 2150XBX100 [实施例1] 将8ml以下组成的培养基(蔗糖30g/L、玉米浆30g/L、磷酸二氢钾1. 5g/L、磷酸氢二钠十二水合物3. 8g/L、氯化钙二水合物5. Og/L、硫酸镁七水合物0. 7g/L、硫酸铁七水合物0. 3g/L、pH7. 2)放入内径18mm的带有棉栓的试管中，在121°C下进行15分钟的高压灭菌锅灭菌，制备了种子用试管培养基。
接下来将8ml以下组成的培养基(葡萄糖30g/L、玉米浆过滤处理物5g/L、硫酸铵 1. 5g/L、磷酸二氢钾1. 5g/L、磷酸氢二钠十二水合物3. 8g/L、氯化钙二水合物5. Og/L、硫酸镁七水合物0. 7g/L、硫酸铁七水合物0. 6g/L、酯系消泡剂0. 2g/L)放入内径18mm的带有棉栓的试管中，共准备了 21份这样的培养基。
接下来分别添加甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸和脯氨酸20种氨基酸，使各浓度为1.0g/L。为了进行比较，有1个培养基没有添加任何氨基酸。最后使用氢氧化钠水溶液或硫酸水溶液调节到PH7. 1，在121°C进行了 20分钟高压灭菌锅灭菌。
将Paracoccus carotinifaciens E-396 株(FERM BP-4283)接菌在种子用试管培养基中，在^°C、2天、300spm条件下进行了振荡培养后，将0. Iml其培养液分别接菌在21 种试管培养基上，在^°C、4天、300spm条件下进行了振荡培养。
使用HPLC对培养液的类胡萝卜素浓度进行了测定，此外，通过0D610 (在610nm处的吸光度)对菌体生长繁育进行了测定，其结果如表1所示，可见谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸对类胡萝卜素色素的生产有促进效果。另一方面，半胱氨酸、赖氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸对于类胡萝卜素的生产有明显的阻碍作用。
[表1]
权利要求
1.一种制备类胡萝卜素的方法，该方法包括使用添加了氨基酸的培养基培养产生类胡萝卜素的细菌、并从所得到的培养物中收集类胡萝卜素的步骤；其中，所述氨基酸为选自谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸、以及这些物质的盐中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氨基酸为谷氨酸或谷氨酸盐。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氨基酸的添加浓度为lmmol/L 200mmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述类胡萝卜素是选自虾青素、角黄素、 玉米黄质、隐黄素、番茄红素、胡萝卜素、绿蝇黄质、侧金盏花黄质、海胆烯酮、 Asteroidenone和3-羟基海胆酮中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细菌是属于副球菌属的细菌。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细菌是对应于16S核糖体RNA的DNA碱基序列与SEQ ID NO :1记载的碱基序列具有95%以上的同源性的细菌。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细菌是Ε-396株(FERMΒΡ-4283)、Α-581-1 株(FERM ΒΡ-4671)、或这些菌株的突变株。
全文摘要
本发明提供一种制备类胡萝卜素的方法，该方法包括使用添加了氨基酸的培养基培养产生类胡萝卜素的细菌，并从所得到的培养物中收集类胡萝卜素的步骤。所述氨基酸为选自谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸、以及这些物质的盐中的至少一种。
文档编号C12R1/01GK102186984SQ20098014086
公开日2011年9月14日 申请日期2009年10月16日 优先权日2008年10月17日
发明者平泽和明, 坪仓章, 佐藤博, 矢田哲久 申请人:吉坤日矿日石能源株式会社