专利名称：一种灭杀钉螺的苏云金芽孢杆菌及制备方法
技术领域：
本发明属于灭杀钉螺及血吸虫防治技术领域，更具体涉及一种灭杀钉螺的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)，同时还涉及一种灭杀钉螺的苏云金芽孢杆 菌的制备方法。该菌种是由本实验室从死亡湖北钉螺中分离、并以日本血吸虫的中间宿主 湖北钉螺(Oncomelania hupensis)为供试钉螺，经过毒力生物测定所筛选出的对湖北钉螺 有高毒力的菌株。该菌株发酵72h的发酵上清液感染湖北钉螺24h后，对钉螺的致死率在 50%以上，因而该菌株可用于生产新型苏云金芽孢杆菌杀螺剂，扩大苏云金芽孢杆菌杀虫 剂的使用范围。
背景技术：
血吸虫病(Schistosomiasis)是世界上最重要的人畜共患寄生虫病之一。它不仅 严重危害人体健康，同时对家畜也会造成极大的危害，影响疫区经济发展，因此，人们称它 为“瘟神”。血吸虫生存繁殖离不开生长在潮湿草滩上和沟渠旁的钉螺。钉螺是血吸虫的中 间宿主，是传染血吸虫病的重要媒介。在我国，传播日本血吸虫的湖北钉螺(Oncomelania hupensis)是日本血吸虫的唯一中间宿主。因此，灭螺是防止血吸虫感染，控制和阻断血吸 虫病传播的最有效途径之一。1991年，WHO血吸虫病专家委员会第4次会议中，在强调疾 病控制策略思想的同时，着重指出“要达到阻断传播的目标，必须开展螺蛳控制”，表明了螺 蛳控制在防治血吸虫病中必不可少的作用。吴仪副总理在全国血吸虫病防治工作会议的讲 话中，将“开展灭螺新药和新技术研究”摆在了加强血防科研，不断改进防治技术的首要位 置。然而，中国水域广阔，钉螺分布面积大，如何治理长江流域和洞庭湖等地区的钉螺危害， 是摆在人们面前的一个亟待解决的问题。毕竟，辽阔的水体面积使得我们不可能像日本那 样，在水塘边上用水泥砌好，使钉螺无法吸附于表面，并最终达到消灭钉螺的作用。目前世界各国对于钉螺的防治主要使用物理方法和化学杀螺剂如氯硝柳胺、五氯 酚钠和溴乙酰胺等。物理灭螺的方法工程浩大，耗资巨大，受自然环境条件、人力、物力、财 力等的限制，而化学杀螺剂存在选择性较弱、持效期短、易造成环境污染等缺点。为了弥补 物理和化学杀螺剂灭螺的不足，近年来有关植源性灭螺药的研究报道较多，如樟树、银杏、 枫杨、中草药等的水浸液及茶皂素等对钉螺均有毒效，但这些植物生长缓慢，灭螺的有效成 分含量低，因此植源性灭螺药的生产和使用成本高，产量和应用受到限制。因而筛选有效的 杀螺微生物，进行微生物灭螺制剂的研究及开发日显必要，这对于有效地防止血吸虫病的 传播，保护生态环境具有重要意义。早在1971年，巴西圣保罗热带医学杂志报道，黄鞠菌和寄生鞠菌 (Aspergillusparasilicus)的代谢产物Alfatoxin在实验室中有良好的杀螺作用；1976 年，Wp CA等报道，放线菌(Act. Lavendulae)的代谢产物植菌霉素(Phytobactriomycin) 对豆螺有毒杀作用。我国在50年代就发现了微生物对钉螺的毒杀作用，简浩然等于 1958年从钉螺中分离出了多株细菌，发现有5株细菌对钉螺有一定的杀灭作用[石孟芝，微生物杀灭钉螺的研究概况。实用预防医学，2003，10(3) :435-437]；姚超素等自 1966年开展微生物灭螺研究工作以来，分离筛选出了多株有杀螺活性的微生物菌株[姚 超素，胡代炎，石孟芝，蔡文华，胡钢，微生物及寄生虫防治钉螺的研究.实用预防医学， 1995,2(4) 198-200 ；胡代炎，石孟芝，任茂元，姚超素，灰色直丝链霉菌杀钉螺的实验 研究.实用预防医学，1994，1(4) :213-214]。杨建明等介绍了有关微生物灭钉螺方法 和途径的研究现状，并说明了几种灭螺微生物凸形假单孢菌(Psudomonas colllwxa Chester)、浅灰链霉菌 230 (Streptomyces griseolus 230)、链霉菌 218 (Streptomyces diastatochromogenyes218)(Streptomyces griseolus 132) ^
果和作用机理[杨建明，肖瑞芬，周艳。微生物灭钉螺的研究现状，湖北大学学报(自然科学版)，2003，25 (4) :337-341]。阳桂芬等从钉螺和钉螺孳生的土壤中分离具有杀钉螺作用 的微生物，结果153株中分离出YT28和LT129芽孢杆菌强毒株，室内浸泡杀螺，48h钉螺死 亡率90%，72h达95%，表明YT28和LT129菌株有较好的杀螺效果[阳桂芬等，杀钉螺微生 物的筛选，热带病与寄生虫学，2003，1(4) :214-215]。然而微生物灭螺的研究进展缓慢，到 目前为止，尚未找到一种理想的能推广应用的灭螺有效菌株。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种重要的杀虫细菌，由 于其具有杀虫效果好、特异性强、不污染环境、生产工艺简单、生产和使用成本低等优点而 在害虫生物防治中发挥了重要作用。现已报道，苏云金芽孢杆菌对鳞翅目、鞘翅目、双翅目 等9个目的昆虫和螨类、植物线虫、原生动物、扁形动物等有特异性杀虫活性。近年来，通过 实验发现，Bt亦可以杀灭钉螺，是一种有效的、颇有应用前景的杀螺微生物。OSMAN G.Y.等 (1991，1992)研究了几种Bt杀螺剂SAN401，SAN402, SAN415的杀螺活性，结果表明，Bt杀 螺剂对沙地阿拉伯血吸虫的中间宿主Bulunus truncatus禾口 Biomphalaria alexandrina 均有显著的活性，认为苏云金芽孢杆菌具有潜在的高效杀螺活性，但其杀螺机理有待进一 [Osman G Y, Mohamed A Μ, AL-Layl K J. Studies on MolluscicidalActivity of Different Preparation of Bacillus一thuringiensis as Biocidal Agents onBiomphalaria—alexandria Snails as Vectors of Schistosomiasis Bilharziasis inSaudiarabia. Anzeiger fuer Schaedlingskunde Pflanzenschutz Umweltschutz 1992, 65(4) :67-70]。Liu C和Starnes R L等专利中报道了一株对包括钉螺在内的害虫有 杀虫功效的 BT 菌株[Liu C, Starnes R L, Macmullan A M, Manker D C, Lufburrow PA, Liu C L. Bacillus thuringiensis strain that produces pesticidal cpd. -esp. 2, 5-bis(2-alanyl-amino-l,3-di :hydroxypropyl)pyrazine or deoxy analogue, used with otherbacillus-related pesticide against coleoptera.Patent Assignee (s) Abbot Lab (ABBO) ；VALENT BIOSCIENCES CORP(VALE-Non-standard)] ；Liu, C-L.禾口 Marrone, P. G.等专利报道了对钉螺等害虫有杀虫功效的能产生高产量晶体delta-内 毒素的 Bt 突变株[Liu C, Starnes R L, Macmullan A M, Manker D C, Lufburrow P A, Liu C L. Bacillus thuringiensis strain that produces pesticidal cpd. -esp. 2, 5-bis(2-alanyl-amino-l,3-di :hydroxypropyl)pyrazine or deoxy analogue,used with otherbacillus-related pesticide against coleoptera. Patent Assignee (s) :Abbot Lab (ABBO) ；VALENT BIOSCIENCES CORP(VALE-Non-standard)]
发明内容
本发明的目的在于是提供了一种灭杀钉螺的苏云金芽孢杆菌。该菌株对钉螺有高效特异性的毒杀作用，但对人、畜和环境安全。本发明的另一个目的是在于提供了一种灭杀钉螺的苏云金芽孢杆菌的制备方法。 用该方法能够快速，有效地对该菌株进行培养与收集，并获得对湖北钉螺有效的发酵上清 液，该培养方法简单、成本低、易于实施。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施苏云金芽孢杆菌菌株A0H-01是一种由本实验室从死亡湖北钉螺中分离、并以日 本血吸虫的中间宿主湖北钉螺(Oncomelania hupensis)为供试钉螺，经过毒力生物测定 所筛选出的对湖北钉螺有高毒力的菌株。根据该菌株的作用对象，取抗(Anti-)、湖北钉螺 (Oncomelania hupensis)的第一个字母组成其代码AOh，又因该菌株是从同一死螺样品中 分离的多株芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为01的一株，因此将该苏云金芽孢杆菌命名为 AOh-Ol (Bacillus thuringiensis ssp. A0H-01，CCTCC 保藏号M 2010047)。基本的技术原 理是利用芽孢可耐80-85°C高温的特性，在80-85°C高温下分离苏云金芽孢杆菌；以湖北 钉螺为供试钉螺，进行毒力生物测定，经过比较毒力，筛选到该高毒力菌株AOh-Ol。(1)杀钉螺苏云金芽孢杆菌菌株A0H-01的制备方法一种灭杀钉螺的苏云金芽孢杆菌的制备方法，其具体步骤如下A.利用芽孢可耐80-85 °C的高温的特性，在80-85 °C高温下，用普通固体细菌培养 基倒平板，在28-30°C下培养2-3天，分离细菌单菌落。该普通固体细菌培养基的组成为 蛋白胨1%，牛肉膏0. 5%，氯化钠0. 5%，琼脂1. 0-1. 5%，用水补充体积至100ml。B.随机挑选单菌落涂片，用石碳酸复红染色后在光学显微镜下观察，筛选能产生 芽孢和晶体的苏云金芽孢杆菌。C.以湖北钉螺为试螺，对筛选出的苏云金芽孢杆菌进行毒力生物测定，经过比较 毒力致死中量Lc5tl，筛选到该高毒力菌株。根据该菌株的作用对象，取抗(Anti-)、湖北钉螺 (Oncomelania hupensis)的第一个字母组成其代码A0h，又因该菌株是从同一死螺样品中 分离的多株芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为01的一株，因此将该苏云金芽孢杆菌命名为 AOh-Ol (Bacillus thuringiensis. AOh-Ol，CCTCC保藏号M 2010047)，保藏日期2010 年 3 月4日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国.武汉.武汉大学。该菌株的具体特征如下(2)杀钉螺苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis. AOh-Ol的基本特征A.形态学特征Bacillus thuringiensis. AOh-Ol的细胞形态为杆状，产生椭圆 形芽孢和菱形伴孢晶体。B.培养特征Bacillus thuringiensis ssp. AOh-Ol牛肉膏-蛋白胨琼脂平板培 养基中30°C培养24小时，形成针尖大小的浅黄色小菌落，边缘平滑，培养72小时，形成圆盘 状菌落，乳白色，边缘不整齐，表面似毛玻璃，有皱纹。C. H血清型以AOh-Ol的鞭毛抗原与Bt的标准抗血清进行凝集反应试验，AOh-Ol 的H血清型为H27。 D.生化特性按Barjac的经典方法进行生理生化试验，其生理生化特征如表一所示。
表一苏云金芽孢杆菌AOh-Ol菌株的生理生化特征
水解淀粉+++
禾_柠檬盐+NTNT
还原NCh-NO2十++
1周内脱苯丙氨酸_NTNT
溶血试验+++
甲基红反应++“
明胶水解试验+++
吲哚试验_—_
脲酶水解____a.对照分别为血清型27型标准菌株和Bt subsp. kurstaki ；NT,未检测。E.生物活性经毒力生物测定，菌株AOh-I对湖北钉螺有较高毒杀作用，其72h的
发酵上清液感染24h后对钉螺的致死率在50%以上，使用透析袋浓缩后杀螺效果进一步提
高，超过80%，发酵液经pHl-14处理一个小时后，杀螺活性有所降低，用SDS处理一个
小时也会降低杀螺活性(表二)。菌株AOh-Ol产生的杀螺活性成分对温度比较稳定，经100°C处理一个小时后，活
性几乎保持不变(表三)。菌株AOh-Ol的杀螺活性物质在培养8h时就已经产生，在40h左
右浓度最高，随后略有下降，但杀螺活性波动不大(表四)。采用3. 5kd透析袋对发酵上清液进行透析处理后，透析液和透析保留液对钉螺均具有活性，说明活性成分分子量应该在3500以下，发酵上清液经121 °C，20min灭菌处理后， 活性下降明显(表五)。表二理化因素对AOh-Ol杀螺活性的影响 表三温度处理对菌株AOh-Ol杀螺活性的影响 a.发酵72h后，发酵液于不同温度下均处理Ih表四不同培养时间对AOh-Ol上清液的杀螺活性 表五透析和灭菌处理后AOh-Ol上清液的杀钉螺活性F.发酵性能菌株AOh-Ol易于培养，发酵性能优良，在合适的发酵条件下生长整 齐，发酵周期短。发明的优点和效果中国是血吸虫病的多发地区。中国慢性血吸虫病病人一直持续在80万人左右，大部分重流行区的血吸虫病人畜感染率在3%至5%，局部地区血吸虫病人畜感染率可高达 68%。中国血吸虫病的防治工作所面临的严峻形势是病人数居高不下，钉螺扩散严重，新 疫区不断增加，血吸虫病向城市蔓延。在我国，传播日本血吸虫的湖北钉螺是日本血吸虫的 唯一中间宿主，因此，筛选出对湖北钉螺有高效的苏云金芽孢杆菌并运用其生产新型杀螺 齐U，是控制和阻断血吸虫病传播的最有效途径之一，具有现实意义和紧迫性。苏云金芽孢杆菌AOh-Ol具有日本血吸虫的中间宿主湖北钉螺的特点，国内目前尚无杀湖北钉螺的苏云金芽孢杆菌菌株及商品制剂，因而可利AOh-Ol生产新型苏云金芽 孢杆菌杀螺剂，使苏云金芽孢杆菌杀虫剂的产品多样化和系列化，扩大苏云金芽孢杆菌杀 虫剂的使用范围，减少化学农药对环境的污染，有效防治钉螺，阻断血吸虫的传播。其安全 性与其它野生苏云金芽孢杆菌无异，对人、畜及动植物无害，不污染环境，有良好的经济和 生态效益。因而，从优越而独特的杀钉螺特性、生产和使用成本低、工业化生产技术成熟、对 人和动植物安全、不污染环境及市场需求等方面考虑，苏云金芽孢杆菌AOh-Ol有良好的推 广应用前景。
具体实施例方式实施例1 一种灭杀钉螺的苏云金芽孢杆菌的制备方法，其具体步骤如下A.利用芽孢可耐80或82或85°C的高温的特性，在80或82或85°C高温下，用普 通固体细菌培养基倒平板，在30°C下培养3天，分离细菌单菌落。该普通固体细菌培养基的 组成为蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，琼脂1或1.3或1.5%，用水补充体积至 100ml。B.随机挑选单菌落涂片，用石碳酸复红染色后在光学显微镜下观察，筛选能产生 芽孢和晶体的苏云金芽孢杆菌。C.以湖北钉螺为试螺，对筛选出的苏云金芽孢杆菌进行毒力生物测定，经过比较 毒力致死中量Lc5tl，筛选到该高毒力菌株。根据该菌株的作用对象，取抗(Anti-)、湖北钉螺 (Oncomelania hupensis)的第一个字母组成其代码AOh，又因该菌株是从同一死螺样品中 分离的多株芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为01的一株，因此将该苏云金芽孢杆菌命名为 AOh-Ol (Bacillus thuringiensis. AOh-Ol, CCTCC 保藏号M 2010047)。
权利要求
一种灭杀钉螺的苏云金芽孢杆菌，其特征在于苏云金芽孢杆菌为(Bacillus thuringiensis)AOh-01，CCTCC NOM 2010047。
2.一种灭杀钉螺的苏云金芽孢杆菌的制备方法，其步骤是A.、利用芽孢可耐80-85°C的高温的特性，在80-85°C高温下，用固体细菌培养基倒平 板，在28-30°C下培养2-3天，分离细菌单菌落，所述的固体细菌培养基组成为蛋白胨1%， 牛肉膏0. 5 %，氯化钠0.5%，琼脂1.0-1.5%，用水补充体积至IOOml ；B.、随机挑选单菌落涂片，用石碳酸复红染色后在光学显微镜下观察，筛选芽孢和晶体 的苏云金芽孢杆菌；C.以湖北钉螺为试螺，对筛选出的苏云金芽孢杆菌进行毒力生物测定，经过比较毒力 致死中量Lc5tl，筛选到高毒力菌株。
全文摘要
本发明公开了一种灭杀钉螺的苏云金芽孢杆菌及制备方法，苏云金芽孢杆菌为(Bacillus thuringiensis)AOh-01，CCTCC NOM2010047。其步骤是A、利用芽孢可耐80-85℃的高温的特性，在80-85℃高温下，用固体细菌培养基倒平板，在28-30℃下培养2-3天，分离细菌单菌落，所述的固体细菌培养基组成为蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，琼脂1.0-1.5％，用水补充体积至100ml；B、随机挑选单菌落涂片，用石碳酸复红染色后在光学显微镜下观察，筛选芽孢和晶体的苏云金芽孢杆菌。C.以湖北钉螺为试螺，对筛选出的苏云金芽孢杆菌进行毒力生物测定，经过比较毒力致死中量Lc50，筛选出高毒力菌株。该方法简单、成本低、易于实施，该菌株对钉螺有高效特异性的毒杀作用，但对人、畜和环境安全。
文档编号C12N1/20GK101838624SQ20101012830
公开日2010年9月22日 申请日期2010年3月16日 优先权日2010年3月16日
发明者刘朋明, 吴燕, 樊鸿宇, 高梅影 申请人:中国科学院武汉病毒研究所