专利名称：蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法
技术领域：
本发明涉及一种蜜柚果汁脱苦酶的生产及应用技术，主要是以为黑曲霉为菌种， 采用特殊的培养基及发酵，发酵生产蜜柚果汁脱苦酶，从菌体及发酵液中提取脱苦酶并应 用于蜜柚果汁脱苦，制备无苦味的蜜柚果汁。其生产技术属于发酵工程及酶工程的内容，其 应用技术属于农产品贮藏与加工的内容。
背景技术：
蜜柚是我国重要的经济水果，它味美香醇，深受人们喜爱。我国蜜柚种植历史悠 久，培育形成了福建琯溪蜜柚、浙江玉环文旦柚、四川坪山红心柚、广西沙田柚等多个名、 优、特品种。近年来，随着蜜柚种植面积不断扩大，蜜柚产量逐年上升，鲜销市场趋于饱和，而 深加工技术研究滞后，尚未实现产业化的深加工，产供销矛盾日益突出，售果难，果贱伤农 的问题逐渐显现。果肉汁多味美、酸甜适口，蜜柚果皮及果渣含有丰富的膳食纤维(半纤维素及果 胶)及香精油等成分，加工升值的潜力很大，如，果肉可加工生产蜜柚果汁，果皮可用于生 产香精、果胶及果脯，果渣可用于生产果茶、果酱及提取果胶。然而，蜜柚榨汁获得的鲜果汁 具有明显的苦味，需要经过脱苦处理后才能加工成无苦味的蜜柚果汁产品。由于蜜柚脱苦 方面的技术还达不到产业化生产的要求，因此，还不能利用蜜柚果肉生产出大宗的果汁加 工产品。虽然利用蜜柚果皮生产蜜柚果脯、蜜柚香精、蜜柚果胶的技术日趋成熟，但由于蜜 柚果实中最有加工价值的部分——蜜柚果汁无法利用，仅利用蜜柚的果皮生产果脯、提取 柚香精或生产蜜柚果胶无利可图，这导致了蜜柚深加工的技术体系无法实现产业化。因此， 建立蜜柚果汁脱苦的产业化技术，将蜜柚加工成能被市场接受的蜜柚果汁产品是蜜柚深加 工技术领域急需解决的关键难题。目前，有吸附法、酶法、β-环糊精包埋、苦味物质掩蔽剂、代谢法多种技术可用于 对蜜柚果汁进行脱苦，β “环糊精包埋、苦味物质掩蔽剂、代谢法等只能去除蜜柚果汁的部 分苦味，不能实现完全脱苦；虽然用吸附法可实现完全脱苦，但该法在吸附去除苦味成分的 同时，也吸附去除蜜柚中的许多营养成分，极大地降低了蜜柚果汁的商品价值。很多研究涉 及了酶法脱苦蜜柚果汁，但由于目前所报导的研究成果没有发酵获得柠碱酶及诺米林酶， 虽然获得了柚苷酶的高产，但由于蜜柚中含有多种苦味物质，用柚苷酶处理后，蜜柚果汁仍 然具有非常严重的苦味，不能用于生产果汁、果酒等产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可完全去除果汁苦味、工艺简单的蜜柚果汁脱苦酶的 发酵生产方法。为实现上述目的，本实用新型的技术解决方案是⑴蜜柚苦味物质的提取；⑵ 以蜜柚苦味物质为唯一碳源配制培养基；(3)接种黑曲霉发酵产生蜜柚果汁脱苦酶；(4)提
3取蜜柚果汁脱苦酶；(5)酶法分解蜜柚果汁中的苦味物质；(6)浓缩制备获得浓缩果汁。本发明是一种蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法，它包括上述步骤(1)_(4)步骤(1)的蜜柚苦味物质的提取是以蜜柚囊衣为材料，在80-100°C的条件烘干、 粉碎过80目筛、加入20倍(体积/质量)丙酮，10-60°C浸提5-85h，真空浓缩得到干品。步骤⑵培养基的组分和含量为培养基的配方为蜜柚苦味物质2-40g/L， MgSO4 0. 2-lg/L, KH2PO4 0. 5_2g/L，CaCl2 0. 05-0. 15g/L, (NH4)2SO4 2—lOg/L，ZnSO4 · 7H20 0. 02-0. lg/L，酵母膏0. 5-4g/L，豆饼粉0. 5_8g/L，曲拉通0. 1-0. 5g/L。按发酵体积称取各 培养基成分，加水溶解后灭菌备用。步骤(3)蜜柚果汁脱苦酶采用的菌种为黑曲霉，菌种是以斜面孢子作为起始接种 物，逐级扩大培养至所需要的体积，菌种培养基为蜜柚苦味物质2g/L，MgSO4 0. 2g/L，KH2PO4 0. 5g/L, CaCl2 0.03g/L，酵母膏4g/L，豆饼粉5g/L。将菌种接种至发酵培养基中，在温度 28-34°C、pH值为6.0士 1、溶氧30士 10%的条件下发酵8-lld。本发明的黑曲霉是从平和县 烂柚子堆集点采集土壤样品，用特殊的方法(以柚皮苷为唯一碳源)分离得到的能产生柚 苷酶、柠碱酶、诺米林酶等多种脱苦酶的黑曲霉菌株。步骤(4)脱苦酶的提取过程是分别收集发酵液和菌体，将菌体破碎后和发酵液合 并，先用超滤法去除小分子及大颗料，收集20-130kDa的活性组分用Q-琼脂糖凝胶分离，收 集NaCl浓度范围为0. 15-0. 3之间的活力组分，再次进行超滤浓缩，可同时纯化多个酶活力 组分。本发明还提供了一种蜜柚果汁脱苦的方法，步骤(5)酶法分解蜜柚果汁中的苦味 物质条件为温度为20-45°C，加酶量为10U/mL蜜柚果汁(以酶液中柚苷酶活力计)。有益效果采用上述技术方案后，同时可发酵生产得到包括柚苷酶、柠碱酶和诺米林酶等活 性的蜜柚果汁脱苦酶，其中，柚苷酶的活力可达1400U/ml，柠碱酶的活力可达140U/ml，诺 米林酶活力可达52U/ml。酶的纯化得率超过65%，纯化倍数为16.2倍。蜜柚果汁经过处 理后，主要苦味物质的去除率都超过了 90%，脱苦后的蜜柚原果汁没有苦味。相比同类相关研究，本发明的创新点主要体现(1)针对蜜柚果汁中含有多种苦 味成分，用单一的脱苦酶(如柚苷酶、柠碱酶、诺米林酶)不能完全去除蜜柚的苦味，本发明 生产复合脱苦酶对蜜柚果汁进行脱苦；(2)针对脱苦酶大部分都是诱导酶，且受到碳源分 解代谢调节，本发明用蜜柚的苦味物质为唯一碳源培养黑曲霉，解除碳源分解代谢调节，经 过长时间的培养，发酵获得了柚苷酶、柠碱酶及诺米林酶等多种脱苦酶；(3)同时对发酵液 及菌体中的脱苦酶进行处理，脱苦酶的活性组分更完全，用超滤及离子交换纯化脱苦酶，操 作简便，还可同时纯化得到多个酶活力组分；(4)用酶处理完全去除了蜜柚果汁的苦味，不 需要再应用树脂吸附、环糊精包埋、苦味物质掩蔽剂等技术去除蜜柚果汁的苦味，不影 响产品的营养及风味、技术的应用性广，不仅可用于生产适用于不同用途的蜜柚果汁产品， 还可用于对蜜柚果皮及果渣进行脱苦处理(参见表1、表2)。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施例方式一、蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法
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1、方法本发明是一种蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法，它包括以下步骤(1)蜜柚苦味 物质的提取；(2)以蜜柚苦味物质为唯一碳源配制培养基；(3)接种黑曲霉发酵产生蜜柚果 汁脱苦酶将菌种接至初始培养基中，在溶氧为20-40%，pH为5-6，温度为28-34°C的条件 下培养，定期检测酶活力，发酵8-lld，当柚苷酶活力达到1200U/mL以上就可放罐；(4)提 取蜜柚果汁脱苦酶离心收集菌体，在10°C以下用超声波破碎细胞，将细胞破壁液与发酵 液合并，先用超滤法截留20-130kDa的活性组，再用Q-琼脂糖凝胶分离，收集NaCl浓度为 0. 15-0. 3mol/L的活性组分，再经超滤浓缩就得到了具有多种酶活性的脱苦酶液；(5)酶法 分解蜜柚果汁中的苦味物质，条件为温度为20-45°C，加酶量为10U/mL蜜柚果汁(以酶液中 柚苷酶活力计)；(6)浓缩制备获得浓缩果汁。2、在本实施例中，培养基及其制备方法实施例1 培养基的组分和含量为蜜柚苦味物质40g/L，MgSO4I g/L, KH2PO4 2g/L, CaCl2 0. 15g/L，(NH4)2SO4 10g/L，ZnSO4 · 7H20 0. lg/L，酵母膏 4g/L，豆饼粉 8g/L，曲拉通 0. 5g/L。上述的发酵培养基各成分量的计算方法以配制IOm3发酵培养基为例，蜜 柚苦味物质=40g/LX1000L/m3X10m3+1000g/kg = 400kg, MgSO4 = lg/LX1000L/ m3X 10m3+ 1000g/kg = 10kg, KH2PO4 = 2g/LX 1000L/m3X IOm3+lOOOg/kg = 20kg, CaCl2 = 0. 15g/LX 1000L/m3X10m3+1000g/kg = 1.5kg，(NH4)2SO4 = 10g/LX1000L/ m3X 10m3+1000g/kg = 100kg, ZnSO4 · 7H20 = 0. lg/LX 1000L/m3X IOOm3+lOOOg/kg =lkg,酵母膏=4g/LX1000L/m3X10m3+1000g/kg = 10kg,豆饼粉=8g/LX1000L/ m3X IOm3+1000g/kg = 80kg，曲拉通 0. 5g/LX 1000L/m3X IOm3+lOOOg/kg = 5kg，水=IOm30培养基的制备方法按照发酵液的总体积及配方计算各培养基成分的用量，先将 各培养基成分称好，加入适量水溶解混合均勻，调PH至6. 0，用泵打入发酵罐，加水至10m3， 灭菌、冷却就制得发酵培养基。实施例2 蜜柚苦味物质2g/L，MgSO4 0. 2g/L，KH2PO4 0. 5g/L，CaCl2 0. 05g/L，(NH4)2SO4 2g/ L，ZnSO4 · 7H20 0. 02g/L，酵母膏 0. 5g/L，豆饼粉 0. 5g/L，曲拉通 0. 1-0. 5g/L。培养基的配 制、发酵过程控制及酶的提取与实例1相同。实施例3 蜜柚苦味物质21g/L，MgSO4 0. 6g/L, KH2PO4 1. 25g/L, CaCl2 0. lg/L, (NH4)2SO4 6g/ L，ZnSO4 · 7H20 0. 06g/L,酵母膏2. 25g/L，豆饼粉4. 25g/L，曲拉通0. 3g/L。培养基的配制、 发酵过程控制及酶的提取与实例1相同。实施例4 蜜柚苦味物质25g/L，MgSO4 0. 4g/L, KH2PO4 lg/L, CaCl2 0. lg/L, (NH4)2SO4 5g/L， ZnSO4 · 7H20 0. 4g/L，酵母膏 3g/L，豆饼粉 8g/L，曲拉通 0. 2g/L。培养基的配制、发酵过程控制及酶的提取与实例1相同。3、原理本发明利用蜜柚的苦味物质培养黑曲霉，诱导产生具有多种酶活性的脱苦酶，分 离纯化这些脱苦酶，对蜜柚果汁的苦味进行特异性的分解，从而去除其苦味。
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工艺所采用的菌种为黑曲霉，其主要内容包括(1)蜜柚苦味物质的提取；(2)培 养基的配制；(3)菌种的制备；(3)发酵产生蜜柚果汁脱苦酶；(4)提取蜜柚果汁脱苦酶； (5)果汁的酶法脱苦；培养基的使用。本发明提供了一种发酵蜜柚果汁脱苦酶的方法，主要特点在于特殊的培养基及酶 的提取方法，概括为以下几个方面。(1)从囊衣中提取苦味物质，苦味物质含量，提取工艺 简单；(2)以蜜柚提取的苦味物质为唯一碳源，其组成及重量份为蜜柚苦味物质2-40g/L， MgSO4 0. 2-lg/L, KH2PO4 0. 5_2g/L，CaCl2 0. 05-0. 15g/L, (NH4)2SO4 2—lOg/L，ZnSO4 · 7H20 0. 02-0. lg/L，酵母膏0. 5-4g/L，豆饼粉0. 5_8g/L，曲拉通0. 1-0. 5g/L，其余成分为水，pH 6. 0 ； (3)采用黑曲霉为菌种，安全性高，酶种类丰富；(4)发酵时间为8-llh，有利于黑曲霉 诱导产生多种脱苦酶；(5)用超滤法及离子交换法分离纯化酶，收集20-130kDa的活性组分 用Q-琼脂糖凝胶分离，用集NaCl浓度范围为0. 15-0. 3之间的活力组分，再次进行超滤浓 缩，可同时纯化多个酶活力组分。二、应用本发明生产的蜜柚果汁的酶法脱苦方法实例1 蜜柚果汁经过100°C煮沸5min，在果汁自然pH，温度为60°C，加酶量为300U/mL 果汁和条件酶解时间为0. 5h，，真空浓缩至总糖度66%，制成浓缩果汁冷藏，其中柚皮苷含 量低于150mg/L，柠碱含量低于30mg/L，诺米林含量低于2g/L，稀释至原果汁后感觉不到苦 味。实例2 蜜柚果汁不煮沸，加入酶，在自然pH值、温度20°C、，加酶量为10U/mL果汁的条件 酶解2h，煮沸灭酶后，其柚皮苷的浓度小于10mg/L，柠碱小于lmg/L，诺米林未检出，果汁无 苦味，可直接用于配制蜜柚果汁饮料或真空浓缩至总糖度66%以上，制成浓缩果汁冷藏。实例3 蜜柚果汁煮沸5min，在果汁自然pH、温度为40°C、加酶量为155U/mL果汁的条件下 酶解1. 25h，煮沸灭酶后，真空浓缩至糖度66%以上，其中柚皮苷的浓度小于170mg/L，柠碱 小于35mg/L，诺米林小于4mg/L，稀释到原果汁的糖度(14% )时无苦味，可用于提供给饮料 企业生产各类蜜柚果汁饮料产品。实例4 蜜柚果汁煮沸5min，在果汁自然pH、温度20°C、加酶量20U/mL果汁的条件下酶解 0. 8h，煮沸灭酶后，真空浓缩至糖度66%以上，其中柚皮苷的浓度小于130mg/L，柠碱小于 15mg/L，诺米林未检出，浓缩果汁无苦味，可用于提供给饮料企业生产各类蜜柚果汁饮料产
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ΡΠ O表1脱苦酶的各酶活力纯化倍数及回收率
6 表2脱苦前后苦味物成质及营养成分变化
权利要求
一种蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法，其特征在于它包括以下步骤(1)用丙酮从蜜柚囊衣中提取蜜柚苦味物质；(2)以蜜柚苦味物质为唯一碳源配制培养基；(3)接种黑曲霉发酵8 11d，产生蜜柚果汁脱苦酶；(4)同时提取菌体及发酵液中脱苦酶，获得了脱苦酶的各种活性组分；(5)酶法分解蜜柚果汁中的苦味物质；(6)浓缩制备获得浓缩果汁。
2.根据权利要求书1所述的蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法，其特征在于步骤(1) 的蜜柚苦味物质的提取是以蜜柚囊衣为材料，经过干燥、粉碎、脱脂、丙酮浸提、减压浓缩而 得到的含有柚皮苷、柠碱、诺米林等多种苦味成分在内的粗提取物。
3.根据权利要求书2所述的蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法，其特征在于所述的丙 酮浸提为囊衣粉用20倍(体积/质量)丙酮于10-60°C浸提5-85h，真空浓缩提所得到的 提取物。
4.根据权利要求书1所述的蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法，其特征在于步骤(2) 培养基的组分和含量为该培养基的配方为蜜柚苦味物质2-40g/L，MgSO4 0. 2-lg/L， KH2PO4 0. 5-2g/L, CaCl2 0.05-0. 15g/L, (NH4)2SO4 2-lOg/L，ZnSO4 · 7H20 0.02-0. lg/L，酵母 膏0. 5-4g/L，豆饼粉0. 5-8g/L，曲拉通0. 1-0. 5g/L，其余成分为水。
5.根据权利要求书1所述的蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法，其特征在于步骤(3) 蜜柚果汁脱苦酶发酵采用的黑曲霉，黑曲霉的发酵过程中发酵温度为28-34°C，培养pH值 为6.0士 1，溶氧为30士 10%，发酵时间为8-lld。
6.根据权利要求书1所述的一种蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法，其特征在于步骤 (4)脱苦酶的提取是先收集菌体，用超声波法在破碎菌体后与发酵液合并，再用超滤法浓 缩，收集20-130kDa的活性组分用Q-琼脂糖凝胶分离，用集NaCl浓度范围为0. 15-0. 3之 间的活力组分，再次进行超滤浓缩，得到的脱苦酶有4个蛋白质组分，其分子量分别为120、 95、55、25kDa。
7.根据权利要求书1所述的蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法，其特征在于步骤(5) 酶法分解蜜柚果汁中的苦味物质条件为温度为20-45°C，加酶量为10U/mL蜜柚果汁。
全文摘要
本发明公开了一种蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产及使用方法，其主要技术流程包括蜜柚苦味物质的提取→以蜜柚苦味物质为唯一碳源配制培养基→接种黑曲霉发酵产生蜜柚果汁脱苦酶→提取蜜柚果汁脱苦酶→酶法水解解蜜柚果汁中的苦味物质→浓缩制备获得浓缩果汁。利用本发明发酵的蜜柚果汁脱苦酶包括柚苷酶、柠碱酶和诺米林酶等多种酶系，可特异性地分解蜜柚果汁的苦味物质，用其对蜜柚果汁进行脱苦，可得苦味完全去除的蜜柚果汁。本方法不影响产品的营养及风味、技术的应用性广，不仅可用于生产适用于不同用途的蜜柚果汁产品，还可用于对蜜柚果皮及果渣进行脱苦处理。
文档编号C12R1/685GK101897452SQ201010219099
公开日2010年12月1日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者伍菱, 倪辉, 曾琪, 李丽君, 杨秋明, 杨远帆, 肖安风, 胡阳, 蔡慧农 申请人:集美大学