专利名称：一种建立植物雄性不育系的方法及其专用表达盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种建立植物雄性不育系的方法及其专 用表达盒。
背景技术：
杂交育种和杂种优势的利用是农业增产的关键。而雄性不育系是杂交育种和杂种 制作的关键材料。传统的雄性不育系要从大田中或野生的种质资源中随机筛选得到。至今 还有很多重要农业和蔬菜作物因缺乏良好的雄性不育系而不能充分利用杂交优势。此外要 把自然选育得到的雄性不育系用于育种还有多种障隘需要大量的工作。首先，把一个雄性 不育系转到其他优良品系的母本时需通过多代的回交，这样不仅育种周期长而且经常会遇 到优良品系某些品质丢失等问题。更关键的问题是与不育系相匹配的恢复系不易获得，不 能得到可育的杂种。一个创造雄性不育和恢复系的方法在杂交育种和杂种生产上有巨大的 应用价值。利用分子生物学和转基因手段来构建雄性不育系及其配套的恢复系，可以在任 何植物中建立不育系和恢复系，为杂交育种和杂交种制备提供父母本材料。油菜素内酯 (brassinosteroids,BRs)作为一种新型的植物生长调节激素，在花的发育过程中起着重要 的作用。在拟南芥和水稻中，油菜素的缺失都造成雄性不育或不同程度的育性下降。但这 些油菜素突变体都是全身性激素缺失，同时伴随着很多生长发育缺陷，比如极度矮化，从而 不能直接用于杂交育种。此外这些突变体的雄性不育是因为雄蕊中油菜素功能丧失造成的 还是整体植物生长缺陷间接造成的一直不清楚。是否可以通过局部地在花药或雄蕊中特异 关闭油菜素响应来得到雄性不育而又不影响植物的营养生长和授粉后的结实一直还没有 报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培育植物雄性不育系的方法。本发明提供的培育植物雄性不育系的方法是通过降低雄蕊或雄蕊器官原基中的 油菜素内酯的作用，从而得到植物雄性不育系。上述降低雄蕊或雄蕊器官原基中的油菜素内酯作用是通过抑制油菜素内酯合成、 加速降解油菜素内酯或阻断油菜素信号转导来实现的。具体地讲，上述阻断油菜素信号转导是将一表达盒导入目的植物中的实现的；所 述表达盒，从上游至下游依次包括花药或雄蕊器官原基特异启动子、油菜素信号转导负调 控因子的编码序列和终止子。进一步，上述油菜素信号转导负调控因子的编码序列是序列表中序列1。上述花药特异启动子可以是核苷酸序列如序列表中序列2所示的AP3启动子。上述表达盒是通过含有所述表达盒的重组表达载体导入所述目的植物中的。进一步，上述重组表达载体的构建方法包括如下步骤利用TOPO重组将序列表中
3序列1所示基因连到pENTRY-SD/D/TOPO载体，得到载体pT0P0-bin2，然后用MluI酶切所述 载体pT0P0-bin2回收2. 4kb的DNA片段，再将所述2. 4kb的DNA片段与中间载体进行LR Gateway重组反应，得到所述重组表达载体；所述中间载体是将所述AP3启动子插入pGWB20 载体的HidIII和XbaII酶切位点间得到的载体。上述目的植物是双子叶植物或单子叶植物，优选十字花科植物，更优选是拟南芥。本发明的另一目的在于提供一种用于培育植物雄性不育系的表达盒。本发明提供的表达盒，从上游至下游依次包括花药或雄蕊器官原基特异启动子、 油菜素信号转导负调控因子的编码序列和终止子。上述油菜素信号转导负调控因子的编码序列是序列表中序列1 ；所述花药特异启 动子是核苷酸序列如序列表中序列2所示的AP3启动子。实验证明本发明构建的AP3_bin2的转基因阳性株系中的完全不育的占20. 7%, 并且与另一发明构建的AP3-bzrl-lD的转基因植株进行杂交后，完全不育的AP3-bin2的转 基因株系结实，杂交Fl代植物的育性恢复正常，显示AP3-bzrl-lD可恢复AP3-bin2-l的育性。BIN2是BR的信号转导中一个关键的激酶，它的显性纯合突变体bin2表现为极度 矮化并100%雄性不育；而BZRl是一个BIN2的激酶底物，其活性被BIN2抑制，它的显性突 变体bzrl-lD可完全恢复bin2的矮化的表型。因此本发明利用BIN2和BZRl在优良品系 中直接构建显性雄性不育系，保持系和恢复系，这样作成的三系可直接在杂交育种和杂种 制作中应用，节约育种成本并使杂交种子规模化生产成为可能。如果用只在花药中特异表 达的启动子来驱动bin2-l和BZRl的表达，可达到雄性不育系和恢复系而不影响其它性状 特征。本发明建立一套通过转基因手段制造抑制雄蕊中油菜素信号转导得到雄性不育 植物的方法。这一方法得到的雄性不育可以通过启动油菜素下游信号因子BZRl恢复育性。 因此通过本发明得到的雄性不育系可以被恢复育性，从而可以广泛用于多种作物的杂种制备。
图1为AP3启动突变的bin2在花药中特异表达引起不育，A是AP3-bin2转基因 的整体形态图，图中植物在16h光照、8h黑暗的温室中生长5周；B是AP3-bin2转基因植 物的花序组织表型；C和D是AP3-bin2转基因植物的花序在显微镜下的表型；图中所有植 物从左往右依次是野生型WT、AP3-bin2育性降低转基因系1#、完全不育系7#，bin2+/_是 bin2-l显性突变体，具有育性降低的表型。图2 :AP3-bin2雌性可育，Α.不育的AP3_bin2植物不能自花授粉结实 (BeforeCross)，但被野生型花粉授粉后(After Cross)果夹长大并结实；B.由图2A所示 植物得到和后代分离可育和不育植株。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
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实施例1、建立雄性不育系和恢复系一、建立雄性不育系1、重组表达载体AP3_bin2的构建1)中间载体(AP3-GWB20)的构建合成下述的引物对AP3PF-H GCGAAGCTTGAGTGCGTGTTGTTTGTGTAG(下划线标出为 HindIII 酶切位
占). /、、、 / AP3PR-X GCGTCTAGAGTTGAAGAGATTTGGTGGAGAG (下划线标出为 XbaI 酶切位点)。用AP3PF-H和AP3PR-X从野生型Co 1拟南芥(购自美国拟南芥生物资源中心 (Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC))的基因组中扩出 1. 2K 的 AP3 启动 子(ΑΡ3启动子是一个在花药特异启动子)，将扩增得到的ΑΡ3启动子与经HidIII和XbaII 酶切过的PGWB20载体(记载过该材料的文献是Nakagawa et al.，J BiosciBioeng. 2007 Jul ；104(1) :34-41，公众可从王志勇处获得)连接，得到中间载体AP3-GWB20。测序表明 中间载体是将序列表中序列2所示的DNA片段(AP3启动子)插入pGWB20载体的HidIII 和XbaII酶切位点间的。2)AP3_bin2 的构建合成下述的引物对BIN2GWF CACCATGGCTGATGATAAGGAGATGBIN2GWR :AGTTCCAGATTGATTCAAGAAGCTTAGACCC提取纯合bin2突变体(记载过该材料的文献是He，J-X et al.，Proc Nat. Acad. Sci. 99，10185-10990 ；公众可从王志勇处获得)的RNA，反转录成cDNA，用BIN2GWF和 BIN2GW引物从bin2突变体的cDNA中扩出bin2基因，测序表明bin2基因的编码序列如序 列表中序列1所示。利用TOPO 重组将 bin2 基因连到 pENTRY-SD/D/TOPO 载体(Invitrogen 公司)，得 到载体命名为pT0P0-bin2，将pT0P0-bin2用MluI进行酶切，跑胶回收大约2. 4kb的DNA 片段，然后将该2. 4kb的DNA片段与上述的中间载体AP3-GWB20进行LR Gateway重组反 应(Invitrogen公司)，将bin2插入到AP3下游的，得到AP3_bin2。经测序重组表达载体 AP3-bin2构建正确。其中重组表达载体AP3-bin2中含有核苷酸序列如序列表中序列3所 示的表达盒，序列表中序列3的第1-1184位与序列2 —致，为AP3启动子；序列表中序列3 的第1221-2360位与序列1 一致，为bin2基因；序列表中序列3的第2414-2804为myc标 签，2821-3073Nos终止子序列。由此我们得到载有AP3_bin2表达盒的pGWB20载体，这样的 载体可将AP3bin2表达盒通过农杆菌介导转入植物。2、雄性不育系的获得利用花序浸泡法，将步骤1获得的重组表达载体AP3_bin2转到拟南芥野生型 Col (公众可网上购自www. arabidopsis. org)中，得到AP3_bin2的转基因植株。其中，花序 浸泡法的步骤如下1)在LB平板上挑取AP3_bin2的农杆菌单克隆，接种于5ml含卡那霉素的YEB液 体培养基中，280C，200rpm,振荡培养至对数生长晚期；2)按1 100的比例转接到500ml LB培养基中，28°C，200rpm，振荡培养至0D_为0. 6左右；3) 5，OOOrpm，离心15分钟，收集菌体，重悬于渗透缓冲液(5%蔗糖，0.02% silwetL-77)，调 OD600 至 0. 6 左右；4)取正在开花的拟南芥，剪去转化前形成的果荚，然后将整个花序浸泡在上述准 备的菌悬液中15秒，使得农杆菌很好的粘附在花序中进行转化；5)农杆菌侵染后的拟南芥放于阴暗处保湿培养24小时，然后将拟南芥移到培养 室中继续正常培养，7-10天后再浸泡转化一次。收获成熟的拟南芥种子，充分晾干后用10%次氯酸钠消毒后，铺在含有潮酶素的 1/2MS培养基上，筛选得到的抗性苗(Tl代)移入土中继续培养。将AP3-bin2的转基因植株进行分子检测，所用引物为BIN2GWF和GWB20R(GWB20R 序列为TTGTTCACCGTTAATTAACCCG)，共得到58个阳性株系。3、阳性株系的表型分析将58个AP3_bin2转基因阳性株系、野生型Col拟南芥、纯合bin2突变体和杂 合bin2突变体(记载该杂合突变体的文献是He，J-X et al.，Proc Nat. Acad. Sci. 99， 10185-10990 ；公众可从王志勇处获得)在16h光照、8h暗，22度温室中培养，观察整个生长 发育期的表型。AP3-bin2的转基因阳性株系在营养生长阶段与野生型类似，无任何显著性差异， (如图IA所示)。在抽薹开花后，AP3-bin2的转基因阳性株系的花药出现不同程度的败育 (图1B)，具体统计结果如表1所示，AP3-bin2的转基因阳性株系按照植物形成正常果夹的 比率可以分为3类育性正常90%果夹饱满的无发育异常的转基因植物(30棵约51. 8% )；育性降低果夹生成率在30% -50%的弱表型转基因植物，其结实率明显低于野 生型对照，果夹不饱满或部分果夹空瘪(16棵约27. 5% )；完全不育不产生任何种子的强表型转基因植物(12棵20. 7% )。雄蕊分析显示育性正常的转基因株系具有和野生型一样的长雄蕊可达到柱头从 而可顺利完成授粉；在弱表型育性降低转基因植株中，花丝变短，雄蕊不能有效的接触柱头 导致育性降低；在强表型完全不育转基因植株中，雄蕊发育异常，不能形成花药，只有丝状 物产生，从而导致不育(如图IC和ID所示)。表1. AP3-bin2的转基因阳性株系的育性分析 4、AP3_bin2不育系的保持选取5个完全不育的AP3_bin2转基因植物与野生型Col杂交。其中杂交的步骤 如下1)选取生长健壮的完全不育的AP3_bin2转基因植物(AP3_bin2不育系)的花序， 用镊子将多余的花蕾去除，保留最佳时期的花蕾5-6个，然后用镊子轻轻摘掉一片花萼和花瓣，要小心不要碰伤柱头；2)从野生型Col上选取正在开放的花朵，用镊子摘取花药然后涂抹在AP3_bin2的 柱头上；3)进行标记。杂交结果显示野生型的花粉与AP3_bin2不育系杂交可形成正常的果夹(图2A)， 表明AP3-bin2转基因只影响了雄蕊的发育，而雌蕊发育正常可正常结实。对Fl的杂交后 代分析显示，这些不育系还会分离出育性正常的植株和不育的植株(图2B)，PCR分析显示 育性正常的植株为野生型，而不育的植株为AP3-bin2转基因植物，说明由AP3-bin2转基因 造成的不育可以遗传。其中有三个不育系的杂交后代可育与不育的分离比值为1 1，说明 这些不育系只有一个T-DNA插入。而另外两个不育系的杂交后代可育与不育的分离比值为 1 3，说明这两个不育系有两个T-DNA插入。我们对只有一个T-DNA插入的不育系，再次 用野生型的花粉进行杂交。F2依然保留着50%的不育植株，说明野生型是AP3-bin2转基 因不育系的保持系，我们可用野生型来保留转基因植物不育的表型。
权利要求
一种培育植物雄性不育系的方法，是通过降低雄蕊或雄蕊器官原基中的油菜素含量，从而得到植物雄性不育系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述降低雄蕊或雄蕊器官原基中的油菜素 含量是通过抑制合成油菜素、加速降解油菜素或阻断油菜素信号转导来实现的。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述阻断油菜素信号转导是将一表达盒导 入目的植物中的实现的；所述表达盒，从上游至下游依次包括花药或雄蕊器官原基特异启 动子、油菜素信号转导负调控因子的编码序列和终止子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述油菜素信号转导负调控因子的编码序 列是序列表中序列1。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述花药特异启动子是核苷酸序列如 序列表中序列2所示的AP3启动子。
6.如权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述表达盒是通过含有所述表达 盒的重组表达载体导入所述目的植物中的。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述重组表达载体的构建方法包括如下 步骤利用TOPO重组将序列表中序列1所示基因连到pENTRY-SD/D/TOPO载体，得到载体 pT0P0-bin2，然后用MluI酶切所述载体pT0P0-bin2回收2. 4kb的DNA片段，再将所述2. 4kb 的DNA片段与中间载体进行LR Gateway重组反应，得到所述重组表达载体；所述中间载体 是将所述AP3启动子插入pGWB20载体的HidIII和XbaII酶切位点间得到的载体。
8.如权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物是双子叶植物或单 子叶植物，优选十字花科植物。
9.用于培育植物雄性不育系的表达盒，从上游至下游依次包括花药或雄蕊器官原基特 异启动子、油菜素信号转导负调控因子的编码序列和终止子。
10.如权利要求9所述的表达盒，其特征在于所述油菜素信号转导负调控因子的编码 序列是序列表中序列1 ；所述花药特异启动子是核苷酸序列如序列表中序列2所示的AP3 启动子。
全文摘要
本发明公开了一种培育植物雄性不育系的方法及其专用表达盒。本发明提供的培育植物雄性不育系的方法是通过降低雄蕊或雄蕊器官原基中的油菜素含量，从而得到植物雄性不育系。实验证明本发明构建的AP3-bin2的转基因阳性株系中的完全不育的占20.7％，并且与另一发明构建的AP3-bzr1-1D的转基因植株进行杂交后，完全不育的AP3-bin2的转基因株系结实，杂交F1代植物的育性恢复正常，显示AP3-bzr1-1D可恢复AP3-bin2-1的育性。
文档编号C12N15/113GK101921794SQ20101022608
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者王志勇 申请人:王志勇