专利名称：稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立和应用方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种能够稳定指示细胞自噬活动同时又具备高转 移潜能的肝癌细胞株，以及该细胞株的建立和应用方法。
背景技术：
原发性肝癌是严重威胁人类健康的恶性疾病。其发病率虽只列恶性肿瘤发病率的 第六位，但是死亡率却高居第三位。中国是原发性肝癌高发国，发病人数约占全球的55%。 全国第三次死因回顾抽样调查报告显示肝癌是我国恶性肿瘤相关死亡的第二位死因(在 城市和男性则是首位死因)。如何有效防治肝癌是我国目前亟需解决的重大问题。在影响肝癌患者生存的诸多因素中，转移复发是最为主要的因素。肝癌患者在就 诊时，多数已发生转移而无法手术治疗，可手术治疗率只有15-30%。即使手术，患者术后5 年的总体转移复发率也高达50-80% (多数于2年内复发)。因此，肝癌转移复发的防治是 治疗肝癌的关键，相关的研究紧要而迫切。自噬被认为可能在肝癌转移中起重要作用。自噬是一种细胞自我降解消化的过 程，在细胞处于不利于细胞生存的应激条件时，细胞通过循环利用细胞内成份，维持营养和 生物能量的稳定，清除受损或多余的蛋白质和细胞器，维持细胞自我稳态，维持细胞生存。 其在肿瘤细胞克服不良应激(如缺血缺氧代谢应激、放化疗等细胞毒作用等)，维持癌细胞 生存，进而促进肿瘤发生发展的重要作用已为近年来的研究证实。由于自噬在维持肿瘤细 胞生存中的重要作用，而肝癌细胞转移又是一个不断克服不良环境作用的复杂过程，自噬 一直被推测可能在肝癌细胞转移过程中起重要作用。然而，这种推论一直未能得到很好的研究和证实，究其原因，主要是因为缺乏良好 的研究工具和模型。要满足自噬与肝癌细胞转移的相关研究，需要有良好的研究用的肝癌 细胞株。这个肝癌细胞株需要满足如下条件具备高转移能力，能够在体内和体外很好地模 拟癌转移过程；具备良好的自噬指示能力，能够实时显示自噬的改变并便于联合其他相关 技术观察分析。目前的肝癌细胞株尚不能满足研究所需。这主要是因为(1)通用肝癌细胞株不 具备高转移能力目前广泛使用的肝癌研究工具细胞，如ATCC的HepG2等，不具备高转移 能力，难以在体内和体外良好地复制转移过程(特别是体内转移)；( 自噬指示观察及快 速定量分析方法不足目前自噬研究采用的自噬观察方法有很大的局限性，无法完成转移 过程中自噬变化等观察。目前广泛用于观察自噬的方法主要包括透射电镜、吖啶橙染色荧 光显微镜或流式细胞术，Western blot检测等。这些观察方法是通过对某个时间点的细胞 进行断点取材观察，对于实时动态观察存在不足，而转移是一个不断变化的动态的过程， 因此很多过程无法观测到。例如在侵袭移动过程中，癌细胞侵透胞外细胞基底膜运动的 过程，即使在体外应用Matrigel模拟，这一运动过程中自噬的动态改变通过以上方法也很 难观察；而癌细胞在进出循环系统以及在循环系统内播散时自噬的改变，定植扩增并形成转移灶时的改变，更难以观察。此外，这些方法还存在其它不足，如透射电镜法样本制作 过程繁琐，观察不便，难以定量或半定量分析；吖啶橙染色法特异性差，易于出现假阳性或 假阴性结果，可靠性差；Western blot法检测步骤多、时程长，工作量大，检测费用高等。使 用GFP绿色荧光蛋白标记LC3形成GFP-LC3自噬报告基因标记细胞使细胞指示自噬，借助 荧光显微镜观察自噬活动，是近年来出现的一种新的自噬观察方法，这种方法使得实时动 态观察自噬改变成为可能。该方法利用自噬发生过程中自噬关键分子LC3由LC3-I变为 LC3-II，LC3在细胞内的分布发生改变(由LC3-I的细胞胞浆内弥散分布变为LC3-II的富 集于自噬体上)，以GFP标记LC3分子，通过荧光分布的改变(由GFP-LC3-I弥散分布于细 胞质之弥散绿色荧光变为GFP-LC3-II富集于自噬体上形成绿色荧光亮点)及变化程度来 观察分析自噬的发生和发生强度。理论上，该方法具有实时动态观察、简便快捷等诸多优 势，但在实际工作中却不易实现。其主要问题在于缺乏能够高效稳定地将GFP-LC3基因导 入细胞并使之稳定表达的方法。目前广泛应用的建立表达GFP-LC3基因的方法是通过脂质 体转染方法(瞬时转染)将携带GFP-LC3基因的重组表达质粒转入细胞内并使其在细胞内 表达。GFP-LC3瞬时转染法建立的GFP-LC3表达不稳定，导致自噬指示不稳定，细胞在连续 传代后自噬指示减弱或丧失，而转移过程是一个时间跨度较大的过程，这使得其难以满足 转移过程的自噬观察(特别是在体内转移模型观察时)。例如模式生物是高可信的研究 方法，应用小鼠或斑马鱼于体内建立转移模型进行研究是获得最接近人体试验结果的可靠 方法。而应用人肝癌细胞建立该模型，需要细胞能够稳定指示自噬，以目前通用的瞬时转染 技术产生的自噬指示细胞，于体内种瘤，在细胞分裂多次瘤生长至一定大小后(远在癌细 胞转移发生之前)，GFP-LC3自噬指示即减弱或丧失，这使得体内观察转移过程中自噬的改 变无法实现。传统的GFP-LC3研究方法除存在上述稳定表达方面的不足外，还存在应用方 法方面的严重不足缺乏快速可靠的自噬定量分析方法。传统的自噬定量方法为人工肉眼 计数GFP-LC3自噬荧光亮点，再人工计数细胞，计算获得平均荧光亮点数/细胞。人工计数 工作量很大(每一个处理组总计数细胞量通常在200以上，总荧光亮点计数量通常在1000 以上)，尤其是在多因素、大样本量实验时工作非常繁重，计数者易于视疲劳计数出错，可靠 性较差，同时人工计数主观随意性大，定量分析结果因缺乏足够客观性而可信度有限等。此 外，传统的GFP-LC3方法还存在其他一些不足，包括转染效率低下、转染试剂具有细胞毒性 和自噬诱导作用等。其中转染试剂的自噬诱导作用对于自噬的相关研究有较大影响，因为 转染试剂可诱导自噬，并在转染试剂去除后仍维持较长时间，造成本底背景自噬很高，在背 景自噬高的情况下，将难以准确判断自噬的发生及改变。总之，目前的肝癌细胞株及相关研究方法不能满足自噬与转移的研究所需，迫切 需要能够克服当前不足的肝癌细胞株及其相关应用方法。
发明内容
本发明旨在提供一种能够稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立方法 和应用方法。本发明提供的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株，已于2010年09月沈日保 藏于“中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心)”，其保藏号为 “CCTCCC201097”和“CCTCC C2010102”，分类命名为“稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H-GFP-LC3”和“稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株HCCLM3-GFP-LC3”。本发明的技术方案如下本发明以本所(复旦大学肝癌研究所)前期建立的高转移潜能肝癌细胞MHCC97H 和HCCLM3为母细胞，利用慢病毒表达载体技术将EGFP-LC3基因整合入宿主细胞基因组， 使之稳定表达EGFP-LC3，实现稳定自噬指示，建立满足研究所需的稳定指示自噬的高转 移肝癌细胞株；再进一步地通过结合应用基于Top-hat算子的图像分析技术实现自噬指 示的快速定量分析，建立所述细胞株的相关应用方法。本发明应用的母细胞是申请人所 在的复旦大学肝癌研究所已经建立的高转移潜能肝癌细胞MHCC97H (British Journal of Cancer. 1999 ；81(5) :814-821)禾口 HCCLM3(J Cancer Res Clin Oncol. 2003 ； 129(1) 43-51)，具备高肺转移潜能。裸鼠皮下或肝脏原位种植后一定时间后可形成100%的肺转 移(高转移人肝细胞癌裸小鼠模型ht J Cancer 1996，66 :239-243 ;J Cancer Res Clin Oncol. 1996 ； 122 (7) :397-402)，是研究肝癌转移的优良细胞和模型。本发明所应用的慢 病毒表达载体技术是近年来开始逐渐应用的一种稳定转染技术，通过慢病毒表达载体，可 以将EGFP-LC3自噬报告基因整合入宿主细胞基因组，实现EGFP-LC3在细胞内的稳定表达 (细胞传代后表达不衰减)，并进而实现稳定实时的自噬指示。除可实现稳定表达外，相对 于瞬转技术，慢病毒表达载体技术尚具有转染效率高，细胞毒性小，自噬诱导弱，对细胞功 能干扰小等优点，克服了传统方法的诸多不足。慢病毒技术所建立的基因稳定表达使得应 用稳定表达GFP-LC3的细胞于动物体内建立癌转移模型观察转移过程中自噬的改变成为 可能。本发明应用基于Top-hat算子的图像分析技术实现自噬改变的快速定量分析。细胞 内的自噬体数目代表细胞自噬活性程度，自噬体经表达载体指示为荧光亮点后，荧光亮点 数等于自噬体数目，计数荧光亮点数目即可明确细胞自噬活性程度。Top-hat算子是一种 高通滤波算子，利用该算子通过选择合适的结构元素可以将感兴趣的目标从复杂的背景中 提取出来。自噬荧光亮点具有显著的图形特征(孤立于弥散分布的绿色荧光背景中的圆形 亮点)，根据自噬荧光亮点的这些特征，以Top-hat算子结合disk型结构元素对图像处理， 提取荧光亮点。再进一步利用自噬荧光亮点固有的形态特征(一定的面积大小的圆形)，设 置形状及大小参数过滤，进行形态滤波处理进一步去除残留的混杂干扰目标，可完成自噬 荧光亮点的提取。荧光亮点提取后，进行相关计数后即可判断自噬改变。而以上所有图像 运算处理均可通过生物医学专业图像软件如Meta Morph,Image Pro plus等的计算模块快 速处理实现。这种基于Top-hat的自噬定量分析方法克服了传统的人工肉眼计数自噬定量 方法的工作繁重、易于出错、可靠性差等不足，实现了快速定量分析，使多因素、大样本量实 验的自噬分析工作成为可能。本发明所述的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株，具备如下特性①稳定指 示细胞自噬细胞稳定表达EGFP-LC3自噬报告基因，可在激发波长为488nm、发射波长为 509nm的条件下用荧光显微镜进行观察，通过EGFP-LC3的胞内荧光分布改变指示细胞自噬 活动，荧光稳定不淬灭；EGFP-LC3基因整合入宿主细胞基因组，传代不丢失，表达稳定，其 荧光强度不随细胞传代而减弱；②细胞具备高转移潜能细胞在裸鼠皮下成瘤6-8周或肝 脏原位种植5-6周后可自发形成肺转移。本发明所述的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株的建立方法，其特征是建 立所述细胞株的步骤如下①建立EGFP-LC3慢病毒人工合成人LC3基因，插入pUC57载
5体，构建成PUC57-LC3 ；用Nhe I和Age I对pUC57_LC3进行双酶切获得384bp的LC3基 因片段；用Nhe I和Age I对pLV_UbC-EGFP_3FLAG表达质粒进行酶切，将LC3基因连接入 表达质粒，构建成pLV-UbC-EGFP-LC3表达质粒；将表达质粒pLV_UbC-EGFP_LC3和包装质 粒pRsv-REV，pMDIg-pRRE，pMD2G混合，于293T细胞包装形成EGFP-LC3慢病毒；纯化，浓 缩、测定滴度；②以EGFP-LC3慢病毒感染高转移潜能肝癌细胞取对数生长期细胞，30%融 合，以MOI = 40计算所需病毒量，病毒与polybrene混勻于培养液后作用对象细胞，感染 后36-4 换液，7 后荧光显微镜下观察确认后继续培养扩增；③分选筛选及培养扩增以 488nm光激发，使用配有高级荧光活性细胞分选器的流式细胞仪在无菌条件下分选出具有 一定荧光强度的细胞，获得稳定指示细胞自噬活动的高转移潜能肝癌细胞株，常规培养扩 增；本发明所述的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株的应用方法，其特征是利用 该细胞株实现细胞自噬指示并采用基于Top-hat算子的图像分析方法定量分析自噬改变， 其具体步骤如下①以自噬研究相关处理因素处理权利要求1所述的稳定指示自噬的高转 移潜能肝癌细胞株；②采用荧光显微镜在激发波长为488nm、发射波长为509nm的条件下 观察细胞内荧光改变，于同一条件下摄取荧光图像，每个处理组随机取至少五个视野，使受 分析细胞总数> 500 ；③以专业生物图像分析软件之Top-hat算子模块、形态滤波模块实现 以下图像运算分析，提取EGFP-LC3自噬荧光亮点以Top-hat算子结合disk结构元素运算 抑制去除荧光背景，进一步以大小一定的圆形设置形态滤波过滤去除假阳性干扰目标，提 取出EGFP-LC3自噬荧光亮点；④以专业生物图像分析软件之点自动计数模块计数提取出 的EGFP-LC3自噬荧光亮点，获得总荧光亮点数；⑤以专业生物图像分析软件之细胞计数模 块或人工计数受分析细胞数；⑥计算每个细胞的平均荧光亮点数，重复以上步骤，数据输入 统计软件，统计分析。本发明的积极效果是本发明所述稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株能够稳 定指示自噬，实时动态观察自噬改变，同时该细胞株具备高转移潜能，能够在体内和体外很 好地模拟肝癌转移过程。通过应用本发明所述的细胞株在体外和体内建立转移模型，利用 细胞的稳定自噬指示，结合激光共聚焦显微等技术，可以动态地观察细胞在转移过程中的 变化，实现传统方法无法实现的自噬与转移的相关观察研究。例如体外应用Matrigel建 立癌转移模型，结合活细胞工作站激光共聚焦显微技术可以连续动态观察自噬在侵袭移动 过程中的改变；应用本细胞株在斑马鱼体内建立癌转移，借助激光共聚焦显微技术观察癌 细胞在进出循环系统以及在循环系统内循环播散时自噬的改变；应用本细胞株在小鼠体 内建立肝癌转移模型，结合冰冻切片共聚焦荧光扫描技术可观察癌细胞在定植过程中的改 变，推测其作用。本发明如与慢病毒siRNA等技术结合，则可进一步扩展研究的范围和用 途。本发明所述的细胞株自噬指示高效稳定、灵敏可靠、操作简便易用、对研究的设备条件 及人员技术要求低(具备普通荧光显微镜即可开展工作)，其应用方法(基于Top-hat的快 速定量分析方法)简单易用、快速准确、可靠便捷，大大降低了人工劳动量，这些可极大地 拓展自噬与转移的相关研究，方便研究的进行，缩短研究所需时间，节省研究的精力，加速 自噬研究的进程。本发明的应用价值本发明在自噬与癌转移的相关研究方面具有广阔的应用前景 和潜在的社会与经济价值。本发明可用于肝癌转移与自噬的相关研究，探讨自噬在肝癌转移中的作用、以自噬为靶点的新治疗方法，为在体抗肿瘤新药或其他干预治疗的效果评估 提供便利等。同时，由于本发明所述的方法具有普适性，可推广应用至其他肿瘤细胞乃至更 广范围的研究对象细胞，从而可广泛应用于自噬的相关研究。
图1稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株，图2自噬在侵袭转移过程中的改变(体外侵袭模型)，图3自噬在肝癌细胞定植形成远处转移灶时的自噬改变(裸小鼠肝癌肺转移模 型)，表格1稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株的生物学特性、转移潜能及自噬指示功 能。
具体实施例方式实施例1 本实施例用以说明稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株的建立过 程、功能鉴定及其应用方法(1)稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株的建立①构建EGFP-LC3慢病毒表 达载体NCBI获得LC3基因序列信息，人工合成人LC3基因；EcoR V酶切pUC57质粒及合 成LC3基因，将LC3基因片段插入pUC57载体，构建成pUC57_LC3 ；转化感受态细胞，筛选 克隆，提取质粒电泳及Kpnl、HindIII双酶切鉴定，测序确认插入产物；用Nhe I和Age I 对pUC57-LC3进行双酶切，酶切产物电泳后再做胶回收384bp的LC3基因片段；用Nhe I 和Age I对pLV-UbC-EGFP-3FLAG表达质粒进行酶切，酶切产物电泳后做胶回收；将LC3基 因连接入表达质粒，构建成pLV-UbC-EGFP-LC3表达质粒；转化感受态细胞，鉴定阳性克隆； 测序无误的克隆再接种扩增，进行质粒抽提；选择生长旺盛期细胞铺板，将表达质粒 pLV-UbC-EGFP-LC3 和包装质粒 pRsv-REV，pMDIg-pRRE, pMD2G 与 CaC12 溶液混合后逐滴加 入等体积的2XHBS中，混合溶液轻轻加入培养皿中并混勻后常规培养；转染约8小时后用 完全培养基进行换液；换液后M小时，收取上清病毒液，并加入含2% FBS的低血清培养 基，24h后第二次收毒；振荡混勻后4°C以10，OOOg高速离心30min，吸干上清后加入适量 OMEM溶解沉淀；浓缩病毒液于细胞测定病毒滴度；②以EGFP-LC3慢病毒感染肝癌细 胞首先测定EGFP-LC3慢病毒的最佳感染复数(MOI)取MHCC97H和HCCLM3以M板各均 勻铺板，培养至30%融合，然后加入病毒培养液混合物(病毒的浓度按照梯度加入，感染复 数分别取2. 5，5，10，20，40，80，160，320)，设三复孔，感染后36_48h换液，感染后72h荧光 显微镜观察拍照，统计感染率和表达率，继续培养，其中一部分细胞以Rapamycin诱导自噬 发生，观察EGFP-LC3荧光分布改变及荧光亮点形成情况，另外一部分细胞以MTT法检测细 胞活力及增殖力；按照感染率和表达率> 95%，自噬指示功能以及细胞活力及增殖力良好 的原则，确定MHCC97H、HCCLM3的最佳感染复数均为40 ；确定MOI值后，常规培养MHCC97H 和HCCLM3细胞，取对数生长期，30%融合，根据细胞量(约IXlO6)及MOI值00)计算所 需病毒量，加入病毒培养液混合液，感染后36-4 换液，72h后荧光显微镜下观察确认后继 续培养扩增；③分选筛选及培养扩增以488nm光激发，使用配有高级荧光活性细胞分选器 的流式细胞仪，根据荧光有无和荧光强弱，在无菌条件下分选出表达荧光强度在荧光强度 均值以上的细胞，获得稳定指示细胞自噬活动的高转移潜能肝癌细胞株MHCC97H-GFP-LC3，HCCLM3-GFP-LC3 (图1_1，2，5，6 ；普通荧光显微镜100X)；分选纯化后的细胞常规培养扩 增，其中一部分细胞持续传代，25代后重复以上功能检测，可见细胞在转染效率，表达强度， 自噬指示功能等方面保持稳定，无明显衰减；获得的细胞冻存保种或实验应用；(2)细胞株生物学特性及功能鉴定①MHCC97H-GFP-LC3和HCCLM3-GFP-LC3细 胞的生物学特性细胞常规连续培养传代，显微镜下观察细胞形态、生长方式等，细胞计数 及MTT检测分析细胞倍增时间，流式细胞术检测DNA倍体、细胞周期，染色体检查及AFP、 HBsAg检测(表1)；②细胞转移潜能检测对数生长期活力良好的MHCC97H-GFP-LC3和 HCCLM3-GFP-LC3细胞，1 X IO7细胞消化富集后悬浮于0. 2-0. 3ml HBSS中，5周龄BALB/c 裸鼠皮下注射，观察皮下成瘤率，3-4周后取皮下瘤组织，手术接种于5周龄Balb/c裸鼠肝 脏，建立原位种植模型。对于皮下瘤和肝原位种瘤模型，分别于种瘤后第4、5、6、7、8周处死 小鼠，取出肺脏，做连续切片和HE染色，观察转移发生情况(表1)；③细胞自噬指示功能检 测MHCC97H-GFP-LC3和HCCLM3-GFP-LC3细胞常规培养，以自噬诱导剂Rapamycin诱导自 噬，荧光显微镜下观察荧光分布改变，可见自噬诱导后荧光由细胞胞浆内弥散分布变为荧 光亮点(图1-3，7;普通荧光显微镜200 X ；图1-4，8激光共聚焦显微镜)，在一定范围内， 荧光亮点数随诱导强度线性增加。(3)应用基于Top-hat算子的图像分析方法定量分析自噬改变①以自噬研究相 关处理因素处理MHCC97H-GFP-LC3和HCCLM3-GFP-LC3细胞(Rapamycin诱导细胞自噬)；②采用荧光显微镜在激发波长为488nm、发射波长为509nm的条件下观察细胞内 荧光改变，于同一条件下摄取荧光图像，每个处理组随机取至少五个视野，使受分析细胞总 数> 500 ；③以专业生物图像分析软件之Top-hat算子模块、形态滤波模块实现图像运算分 析，提取EGFP-LC3自噬荧光亮点以Top-hat算子结合disk结构元素运算抑制去除荧光背 景，进一步以大小一定的圆形设置形态滤波过滤去除假阳性干扰目标，提取出EGFP-LC3自 噬荧光亮点；④以专业生物图像分析软件之点自动计数模块计数提取出的EGFP-LC3自噬 荧光亮点获得总荧光亮点数；⑤以专业生物图像分析软件之细胞计数模块或人工计数受分 析细胞数；⑥计算每个细胞的平均荧光亮点数，重复以上步骤，数据输入统计软件，统计分 析。实施例2-3用以进一步说明本发明的具体应用实施例2应用本发明设置体外侵袭模型观察自噬在侵袭转移过程中的改变应用Matrigel和Transwel 1小室体外模拟侵袭转移是最常用的体外研究癌细胞 转移的研究方法。使用本发明的细胞株，通过使用Matrigel设置体外侵袭，结合活细胞工 作站和激光共聚焦显微镜连续观察，可以一定程度上观察癌细胞在侵袭过程中自噬的变 化(1)MHCC97H-GFP-LC3或HCCLM3-GFP-LC3细胞培养至对数生长期，取状态良好者 用于实验；(2)使用Matrigel和Transwell小室建立体外侵袭模型①Matrigel包被 Transwell小室基底膜溶Matrigel胶(4C过夜)，用无血清的冷DMEM稀释Matrigel胶至 5mg/ml，取IOOul稀释胶加到"Transwell上室中，37C孵育4- ；②加细胞悬液消化法从 细胞培养瓶中获取细胞，用无血清DMEM洗3遍，重悬细胞于含5% FBS的冷DMEM，细胞浓度为5X105cellS/ml，吸取200ul细胞悬液加于上室Matrigel上面；③小室置入特制的可半 悬放置Transwell小室的激光共聚焦用玻底小皿，小皿内加入含有10% FBS和NIH3T3上清 的DMEM液，浸没小室底部；④Transwell小室和小皿放置于PerkinElmer活细胞工作站培 养小室内，常规培养维持细胞于正常状态；(3)使用PerkinElmer活细胞工作站的激光共聚焦显微镜观察置于培养小室内的 Transwell小室中的细胞，间隔Ih激光共聚焦连续扫描，动态追踪观察细胞自噬的改变，采 集记录图像(图2)；(4)以生物专业图像分析软件Image Pro plus，使用本发明所述定量分析方法进 行定量分析，比较分析自噬在侵袭移动过程中的改变。实施例3应用本发明设置裸小鼠肝癌肺转移模型观察自噬在肝癌细胞定植形成 远处转移灶时的自噬改变使用本发明所述的细胞株可以在裸小鼠体内建立肝癌肺转移模型，结合冰冻切片 荧光显微镜观察技术，通过细胞株的自噬指示功能，可以观察分析肝癌细胞在转移中自噬 的改变(以HCCLM3-GFP-LC3细胞示例)(1)建立小鼠肝癌肺转移模型取对数生长期活力良好的HCCLM3-GFP-LC3细胞， IX IO7细胞消化富集后悬浮于0.2-0. :3ml HBSS中，4_5周龄BALB/c裸鼠皮下注射成瘤。取 皮下瘤组织，手术接种于5周龄BALB/c-nu裸鼠肝脏，建立肝癌原发灶，5-6周后肝癌肺转移 成模；(2)肝癌原发灶和肺转移灶冰冻切片肝脏原位种植后5-6周，处死小鼠，立即 取出肝脏及肺脏，浸没于OCT中包埋，-80度冰箱冻lh，再置入-20度2h，冰冻切片机以 20um (普通显微镜)或40-60um (激光共聚焦显微镜)厚度连续切片，切片以Dapi复染细胞 核；(3)荧光显微镜观察使用普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜以488nm激发， 509nm吸收波长观察，同一条件下拍摄图片(图3)；(4)定量分析以本发明所述定量分析方法分析原发灶和转移灶的自噬活性，对 比分析自噬在肝癌细胞定植形成远处转移灶时的自噬改变。
表格权利要求
1.稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株，其特征是①稳定指示细胞自噬细胞稳 定表达EGFP-LC3自噬报告基因，可在激发波长为488nm、发射波长为509nm的条件下用荧 光显微镜进行观察，通过EGFP-LC3的胞内荧光分布改变指示细胞自噬活动，荧光稳定不淬 灭；EGFP-LC3基因整合入宿主细胞基因组，传代不丢失，表达稳定，其荧光强度不随细胞传 代而减弱；②细胞具备高转移潜能细胞在裸鼠皮下成瘤6-8周或肝脏原位种植5-6周后 可自发形成肺转移。
2.一种建立权利要求1所述的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株的方法，其特征 是建立所述细胞株的步骤如下①构建EGFP-LC3慢病毒表达载体人工合成人LC3基因，插入pUC57载体，构建成 PUC57-LC3 ；用Nhe I和Age I对pUC57_LC3进行双酶切，获得384bp的LC3基因片段；用 Nhe I和Age I对pLV_UbC-EGFP_3FLAG表达质粒进行酶切，将LC3基因连接入表达质粒，构 建成pLV-UbC-EGFP-LC3表达质粒；将表达质粒pLV-UbC_EGFP_LC3和包装质粒pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G混合，于细胞包装形成EGFP-LC3慢病毒；纯化，浓缩、测定滴度；② 以EGFP-LC3慢病毒感染高转移潜能肝癌细胞取对数生长期细胞，30%融合，以MOI = 40 计算所需病毒量，病毒与polybrene混勻于培养液后作用对象细胞，感染后36-4 换液， 7 后荧光显微镜下观察确认后继续培养扩增；③分选筛选及培养扩增以488nm光激发， 使用配有高级荧光活性细胞分选器的流式细胞仪在无菌条件下分选出表达荧光强度在荧 光强度均值以上的细胞，获得稳定指示细胞自噬活动的高转移潜能肝癌细胞株，常规培养 扩增。
3.一种应用权利要求1所述的稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株的方法，其特征 是利用该细胞株实现细胞自噬指示并采用基于Top-hat算子的图像分析方法定量分析自 噬改变，其具体步骤如下①以自噬研究相关处理因素处理权利要求1所述的稳定指示自 噬的高转移潜能肝癌细胞株；②采用荧光显微镜在激发波长为488nm、发射波长为509nm的 条件下观察细胞内荧光改变，于同一条件下摄取荧光图像，每个处理组随机取至少五个视 野，使受分析细胞总数> 500 ；③以专业生物图像分析软件之Top-hat算子模块、形态滤波 模块实现以下图像运算分析，提取EGFP-LC3自噬荧光亮点以Top-hat算子结合disk结构 元素运算抑制去除荧光背景，进一步以大小一定的圆形设置形态滤波过滤去除假阳性干扰 目标，提取出EGFP-LC3自噬荧光亮点；④以专业生物图像分析软件之点自动计数模块计数 提取出的EGFP-LC3自噬荧光亮点，获得总荧光亮点数；⑤以专业生物图像分析软件之细胞 计数模块或人工计数受分析细胞数；⑥计算每个细胞的平均荧光亮点数，重复以上步骤，数 据输入统计软件，统计分析。
全文摘要
本发明属生物医学领域，旨在提供稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立和应用方法。本发明通过构建含有EGFP-LC3自噬报告基因的慢病毒表达载体，并使用该表达载体感染具有高转移潜能的肝癌细胞，使宿主细胞稳定高效表达EGFP-LC3，稳定指示细胞自噬变化。应用该细胞株可以于体外和体内建立转移研究模型，观察自噬在转移中的改变，并采用基于Top-hat算子和形态滤波的图像分析方法快速定量分析细胞自噬改变。本发明具有自噬指示稳定可靠、实时灵敏、转移发生确切，自噬定量快速准确、操作简便等特点，可极大地方便自噬与转移的相关研究。
文档编号C12N5/10GK102115730SQ201010295088
公开日2011年7月6日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者丁振斌, 史颖弘, 彭远飞, 樊嘉 申请人:复旦大学附属中山医院