专利名称：高亲和力抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No.2的轻链和重链可变区的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种单克隆抗体，特别涉及抗SEB单克隆抗 体FMU-SEB-No. 2的轻链和重链可变区，包括其氨基酸序列和核苷酸序列。
背景技术：
生物威胁及其防御是目前世界各国最重要的国家安全关切问题之一，也是军事医 学研究的重要领域之一。生物威胁主要包括生物战争和生物恐怖活动，是指利用生物剂 (包括战剂)故意对特定目标人群以及与人类生产生活密切相关的其他生物体(如动物、植 物)和设施等发动袭击的行为。因此，生物威胁不仅可以大量杀伤人、畜，而且造成的民众 心理恐慌、社会混乱以及经济损失等都是十分巨大的。尽管联合国制定的《禁止生物武器公 约》)存在，但并没有有效遏止生物武器研制和发展的势头，一些军事大国不断提高其生物 战能力，拥有生物武器的国家和地区进一步增多，国际生物威胁的形势日趋恶化。构成生物 威胁的主要元素是生物剂，而生物剂中最主要的是烈性病原体及其毒性产物(毒素)。B型葡萄球菌肠毒素(Staphylococal enterotoxin B, SEB)毒性大、极少量毒素 侵入人或动物机体便会中毒，对人、动物及环境构成极大威胁。1. 7μ g的SEB就可杀死一个 成年人，是被列入联合国《禁止生物武器公约》核查清单的11种生物毒素之一。美军10年 来的毒素战剂防治研究规划始终将SEB作为重要的研究对象之一，重点研究SEB损伤治疗 性抗体和小分子抑制剂等，但是也仅有多克隆抗体(PcAb)制备的报道，治疗性单克隆抗体 (mAb)仍然处于起步研究阶段。抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二 硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可变区 (V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。 重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR 是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区 不同可分为人源、鼠源等，鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性，易引起人体的免疫反 应，这些免疫反应可引起对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了克服 鼠源性抗体的缺陷，需要构建高亲和力的特异性嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体。在改造过程中，最为重要的是首先必须获得具有良好特异性、亲和力和中和活性 的鼠源性亲本抗体，克隆其轻链和重链可变区基因，然后将这两条基因进行改造，构建重组 抗体基因。因此，筛选出高亲和力、具有中和活性的鼠源性抗SEB mAb，从中克隆出轻、重链 可变区基因，对进一步研制具有完全自主知识产权的紧急救治SEB毒素中毒的中和性基因 工程抗体制剂，作为战略储备以填补我国、我军在该领域的空白，对于提升我军未来反生物 战、反生物恐怖应对能力，不仅具有极其重大的军事意义，而且在平时食物中毒救治方面也 具有十分重要的实际应用价值。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种高亲和力抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No. 2的轻 链和重链可变区，包括其氨基酸和核苷酸序列，为构建高亲和力、具有中和活性的抗SEB嵌 合或人源化基因工程抗体提供支持。本发明是通过以下技术方案来实现一种抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No. 2的轻链和重链可变区，所述轻链可变区的3 个互补决定区(CDR)序列分别为CDRl =Ser-Ser-Val-Ser-Tyr ；
CDR2 =Asp-Thr-Ser ； CDR3 =Gln-Gln-Trp-Ser-Gly-Asn-Pro-Pro-Met-Tyr-Thr ；所述重链可变区的3个互补决定区(OTR)序列分别为CDRl =Gly-Phe-Ala-Phe-Ser-Asn-Tyr-Asp ；CDR2 Jle-Ser-Ser-Gly-Gly-Thr-Tyr-Ala ；CDR3 Thr-Ser-His-Asp-Tyr-Gly-Ser-Thr-Tyr-Arg-Trp-Tyr-Phe-Asp-Val。所述的抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No. 2的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。所述的编码SEB单克隆抗体FMU-SEB-No. 2轻链可变区的基因序列如SEQ. ID. NO. 3 所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ. ID. NO. 4所示。所述的抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No. 2的轻链和重链可变区应用于构建针对SEB 的基因工程抗体或诊断试剂的制备。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明提供的抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No. 2与SEB的亲和力高，能够特异性 识别SEB并进行免疫反应，动物体内外实验证实对SEB具有较强的中和能力；2、本发明克隆抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No. 2的轻链、重链可变区基因和氨基酸 序列，序列分析证实了该抗体序列的惟一性。3、分析获得轻链、重链可变区的⑶R区，在此基础上为构建高亲和力、具有中和活 性的抗SEB嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。
图1是间接ELISA检测FMU-SEB-No. 2mAb与SEA、SEB和SECl的交叉反应结果图；图2是FMU-SEB-No. 2mAb抑制SEB引起的小鼠脾细胞体外增殖实验结果图；图3是FMU-SEB-No. 2mAb体内中和SEB中毒的小鼠存活实验结果图；图4是FMU-SEB-No. 2mAb轻链可变区基因同源性序列检测结果；图5是FMU-SEB-No. 2mAb重链可变区基因同源性序列检测结果；图6是FMU-SEB-No. 2mAb轻链可变区氨基酸同源性序列检测结果；图7是FMU-SEB-No. 2mAb重链可变区氨基酸同源性序列检测结果。
具体实施例方式本发明用天然SEB免疫Balb/c小鼠，制备了一组小鼠抗SEB的单克隆抗体，从中筛选出能稳定分泌高亲和力抗SEB的FMU-SEB-No. 2mAb杂交瘤细胞株，制备腹水获得高亲 和力抗SEB mAb ；并确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；为抗SEB嵌合 或人源化基因工程抗体提供支持。下面结合具体单克隆抗体的制备方法、抗体活性检测，以 及序列的检测和唯一性的确定对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 本发明具体按以下步骤实施 1、小鼠抗SEB高亲和力抗体FMU-SEB-No. 2mAb的制备 1. 1单克隆抗体的制备、纯化按单克隆抗体制备方法(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)，用天然 SEB免疫Balb/c小鼠(购白第四军医大学实验动物中心)，初次免疫，使用福氏完全佐剂， 后续免疫使用福氏不完全佐剂，每次间隔3周，均为皮下多点注射，共免疫4次。末次免疫 7 10天后采血测其效价，检测免疫效果。间隔2 3周后，经腹腔注射抗原再加强免疫， 3天后处死动物取脾进行细胞融合。取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数，同时制备免疫脾细胞悬液。将骨髓瘤 细胞与脾细胞按1 10比例混合进行细胞融合。融合后细胞悬液加入含有饲养细胞(正常 Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔板，37°C、5% CO2孵箱培养。待克隆出现后，间接ELISA 检测，挑选阳性克隆。对含有阳性克隆孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化，直至获得能够 稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系(体外连续培养超过6个月)，并对其分泌的抗体进行Ig亚 类测定(结果为IgGl亚类，κ型轻链)。在获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，按小鼠腹水制备方法制备包含单 克隆抗体的腹水(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)。腹水经45%饱和硫酸 铵沉淀后，采用QFF阴离子交换层析法纯化。用SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度，纯化的 FMU-SEB-No. 2mAb 纯度达到 95%。1. 2抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No. 2的效价测定用间接ELISA方法测定纯化前腹水以及纯化后mAb的相对亲和力。其中包被抗原 为天然SEB，待测样品为系列稀释的腹水以及纯化后mAb，检测抗体为羊抗鼠-HRP酶标记抗 体，底物使用ABTS。所筛选出的高亲和力FMU-SEB-No. 2mAb，腹水效价为1 X 10_7，纯化后效 价为0. 6ng/ml，而一般采用间接ELISA检测腹水效价达1 X 10_5以上的抗体即可使用。1. 3间接ELISA检测FMU-SEB-No. 2mAb与其他型别葡萄球菌肠毒素的交叉反应分别用SEA(A型葡萄球菌肠毒素)、SEB、SECl (Cl型葡萄球菌肠毒 素)包被 96 孔 ELISA 板，100 μ 1/孔，4 °C 过夜。0. 05 % Tween20-PBS (PBST)洗涤后，将 FMU-SEB-No. 2mAb用含0. 1 % BSA的抗体稀释液稀释至0. 5 μ g/ml加入到ELISA板孔中， 100 μ 1/孔，37°C孵育lh。PBST洗涤后，加入工作浓度羊抗鼠-HRP酶标记抗体，100 μ 1/孔， 37Γ孵育45min，行间接ELISA。结果如图1所示，其中，纵坐标为405nm波长处的吸光度值 (A405)，表示FMU-SEB-No. 2mAb与不同抗原反应的程度，可以看出FMU-SEB-No. 2mAb仅特异 性地与SEB反应，而与SEA和SECl均无交叉反应。1. 4FMU-SEB-No. 2mAb体内外中和活性测定 通过抗SEB的FMU-SEB-No. 2mAb抑制SEB引起的小鼠脾细胞体外增殖情况来确定 抗体的体外中和活性。取8周龄Balb/c小鼠的脾细胞悬液，按1 X IO6/孔的浓度加入到培 养板当中，加入RPMI 1640作为阴性对照组(既不加SEB、也不加阻断抗体)，其余的培养孔分别设加入浓度为200ng/ml的SEB组、SEB+FMU-SEB-No. 2mAb组(浓度为200 μ g/ml)、 SEB+PcAb (针对SEB的多克隆抗体，小鼠免疫血清)组、SEB+抗卵类粘蛋白No. 9 (无关抗体 对照)组，均与小鼠脾细胞共培养5天(37°C，5% CO2)，在倒置显微镜下观察对照孔细胞有 明显的增殖时；用MTT法检测细胞增殖情况。检测结果如图2所示，纵坐标为490nm波长处 的吸光度值(A490)，表示细胞增殖程度，RPMI 1640组为阴性对照组，相当于正常的脾细胞 增殖；可以看出加入SEB后，脾细胞在受到SEB的刺激之后，与正常相比显示出明显的增殖 促进作用；加入作为阻断抗体的FMU-SEB-No. 2mAb与针对SEB的多克隆抗体对SEB的刺激 进行阻断，细胞增殖效果与正常培养相当，说明加入的阻断抗体能够完全阻断SEB对小鼠 脾细胞的刺激作用；而作为对照抗体的抗卵类粘蛋白No. 9则几乎无阻断作用，细胞增殖效 果与SEB刺激组相当。体重14 17g的8周龄Balb/c小鼠，两只为一组，以生理盐水作为阴性对照， anti-PTAlmAb 作为无关抗体对照，将不同剂量 FMU-S^-No. 2mAb (2 μ g、20 μ g、200 μ g、 2mg)分别与SEB(2yg)预先混合(PBS稀释至0. 5ml)，室温放置1小时，小鼠腹腔注射 (0. 5ml/只)；4小时后腹腔注射LPS (PBS稀释至75 μ g/0. 5ml/只)，观察小鼠存活情况4 天(96小时)。具体结果如图3所示，横坐标为观察的时间，纵坐标为小鼠存活的个数，可 以看出，生理盐水对照和anti-PTAl对照抗体均不能保护小鼠，24 h之后无小鼠存活；注射 剂量为2μ g、20y g、200y g WmAb组也不能保护小鼠，显示相同的结果；而注射剂量为2mg mAb组的两只小鼠一直存活，说明注射剂量达到2mg之后，FMU-SEB-No. 2mAb可以有效保护 注射SEB (2 μ g相当于8LD50)小鼠的存活，在体内表现出对SEB的中和活性。2、抗SEB的FMU-Sra-No. 2mAb轻链和重链可变区基因的克隆2. IFMU-SEB-Νο. 2mAb杂交瘤细胞的培养按常规方法复苏(细胞培养，第一版，P88)分泌FMU-SEB-No. 2mAb的杂交瘤细胞， 用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基于37°C，5% CO2孵箱中培养至对数生长期。2. 2总RNA的提取和cDNA第一链的合成采用TRIZOL Reagent (购自美国GIBCO公司)提取总RNA，具体操作步骤按说明书 进行；cDNA第一链合成试剂盒购自美国GIBCO公司，在得到总RNA后按说明书进行反转录 合成cDNA第一链。2. 3RT-PCR 法扩增 FMU-SEB-No. 2mAb 的 VL 禾口 VH 基因一步法RT-PCR扩增试剂盒购自TakaRa公司，按试剂盒说明书扩增 FMU-SEB-No. 2mAb 的 VL 禾口 VH 基因；利用VL F (上游引物)和VL B (下游引物)以及VH F和VH B两对引物，以总RNA 为模板进行RT-PCR ；反应体积50 μ 1，反应条件为94°C 5min ；95°C 30s, 58°C lmin,72°C lmin，循环 35 次；72°C7min;引物序列为VL F :gttagatctc cagcttggtc cc22bp ；VL B:gacattcagc tgacccagtc tcca24bp ；VH F:tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34bp ；VH B:aggtsmarct gcagsagtcw gg22bp ；(IUB 标准兼并碱基代码:s :c/g ；m :a/c ；r :a/g ；w :a/t)
2. 4PCR扩增产物的克隆和筛选PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程 有限会司)回收PCR扩增片段，用DNA连接试剂盒(购自TakaRa公司)将该片段按说明书， 利用加A尾插入pMD-TIS载体(购自TakaRa公司)中，连接物转化E. coli (购自中国普通 微生物菌种保藏中心，CGMCC，北京)，接种在Amp抗性LB琼脂培养平皿中37°C培养过夜。挑取LB琼脂培养平皿中克隆，在Amp抗性LB培养基中37°C摇菌过夜，以1 μ 1菌 液为模板，通过上述针对轻链、重链可变区设计的引物，用PCR法筛选重组阳性 Ε. coli克 隆；将所获得重组阳性Ε. coli克隆摇菌，菌液送交上海生物工程技术服务有限公司 完成基因序列测定，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，重链可变区的基因序列如 SEQ ID NO. 4 所示。3FMU-SEB-No. 2mAb轻链和重链可变区的核苷酸序列及同源性分析3. 1确定测序无误后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源 性分析(Blastn)。FMU-SEB-No. 2mAb轻链可变区基因与编号为GeneID 100047316的小鼠Ig轻链可 变区基因同源性最高，达254/272(93% )，如图4所示。FMU-SEB-No. 2mAb重链可变区基因与编号为GeneID 100043989的小鼠Ig重链可 变区基因同源性最高，为268/280(95% )，如图5所示。同源性分析表明，编码FMU-SEB-No. 2mAb的轻、重链可变区的核苷酸序列，尽管与 其它基因序列有一定同源性，但未发现与本发明完全相同的基因序列，表明本发明在基因 序列上具有惟一性。3. 2将可变区基因翻译成氨基酸序列，进行氨基酸序列分析FMU-Sra-No. 2mAb轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0. 1，重链可变区的氨基酸 序列如SEQ ID N0. 2所示。在 non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF 蛋白质 数据库中，进行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。分析结果表明，FMU-SEB-No. 2mAb轻链氨基酸序列与编号为qb | AAB00850. 1的小 鼠BCR同源性最高，达95/107 (88 % )，如图6所示。FMU-SEB-No. 2mAb重链氨基酸序列与编号为qb |AA019048. 1的小鼠Ig重链可变区 蛋白的同源性最高，为103/122(84% )，如图7所示。同源性分析表明，FMU-SEB-No. 2mAb轻、重链可变区的氨基酸序列，尽管与其它蛋 白氨基酸序列有一定同源性，但未发现与本发明完全相同的氨基酸序列，表明本发明在氨 基酸序列上也具有惟一性。3. 3利用IMGT/V-QUEST分析可变区结构，确定⑶R区。将测序所得FMU-SEB-No. 2mAb轻链和重链可变区序列，在IMGT/V-QUEST网站 (http://imgt. cines. fr/IMGT_vquest/vquest)进行分析，得出其 CDR 区。轻链可变区的3个互补决定区(OTR)序列，如SEQ ID NO. 1划线部分所示，具体 为CDRl =Ser-Ser-Val-Ser-Tyr ；
CDR2 =Asp-Thr-Ser ；CDR3 =Gln-Gln-Trp-Ser-Gly-Asn-Pro-Pro-Met-Tyr-Thr ； 所述重链可变区的3个互补决定区(OTR)序列，如SEQ ID NO. 2划线部分所示，具 体为CDRl =Gly-Phe-Ala-Phe-Ser-Asn-Tyr-Asp ；CDR2 Jle-Ser-Ser-Gly-Gly-Thr-Tyr-Ala ；CDR3 Thr-Ser-His-Asp-Tyr-Gly-Ser-Thr-Tyr-Arg-Trp-Tyr-Phe-Asp-Val。4.基因工程抗体设计基于抗SEB mAb FMU_SEB_No. 2的表达、纯化以及序列分析，设计构建以下生物制
P BFI1)单链抗体的构建可将本发明的FMU-SEB-No. 2mAb轻、重链可变区基因通过 linker连接，插入原核或真核表达载体，转化宿主菌或转染真核细胞，用于制备可对SEB中 毒有治疗作用的单链抗体。2)人-鼠抗SEB嵌合抗体的构建可将本发明的FMU-SEB-No. 2mAb轻、重链可变 区基因插入通用型嵌合抗体表达载体中，获得含嵌合基因的载体转染真核细胞，用于制备 可对SEB中毒有治疗作用的嵌合抗体。3)人源化抗体的构建可将本发明的FMU-SEB-No. 2mAb轻、重链可变区基因的⑶R 区移植到人源抗体可变区的骨架区(FR)中，形成互补决定区(CDR)移植抗体(CDR-grafted antibody)，也禾尔 H勾 Jity[本(reshaping antibody) ^iJvMWMiW (humanized antibody)。利用CDR移植技术改造抗体，可以获得既保持鼠源性亲本mAb特异性，又更加接近 人抗体的新型抗体，用于制备可对SEB中毒有治疗作用的人源化抗体。4)可根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列，制备针对SEB功能表位的其 它生物制品。5)可应用本发明的高亲和力FMU-SEB-No. 2mAb制备测定环境中SEB含量的ELISA 试剂盒，可望在反恐、食品检验中有广泛的应用价值。
权利要求
一种抗SEB单克隆抗体FMU SEB No.2的轻链和重链可变区，其特征在于，所述轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为CDR1Ser Ser Val Ser Tyr；CDR2Asp Thr Ser；CDR3Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Pro Met Tyr Thr；所述重链可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为CDR1Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr Asp；CDR2Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Ala；CDR3Thr Ser His Asp Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val。
2.如权利要求1所述的抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No.2的轻链和重链可变区，其特征 在于，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2 所示。
3.如权利要求1所述的抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No.2的轻链和重链可变区，其特 征在于，编码轻链可变区的基因序列如SEQ. ID. NO. 3所示，编码重链可变区的基因序列如 SEQ. ID. NO. 4 所示。
4.权利要求1所述的抗SEB单克隆抗体FMU-SEB-No.2的轻链和重链可变区应用于构 建针对SEB的基因工程抗体或诊断试剂的制备。全文摘要
本发明公开了FMU-SEB-No.2单克隆抗体(mAb)的轻链和重链可变区，FMU-SEB-No.2mAb轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。通过采用天然B型葡萄球菌肠毒素(SEB)免疫Balb/c小鼠，制备了一组小鼠抗SEB mAbs，筛选出能稳定分泌高亲和力抗SEB mAb的杂交瘤细胞株，制备腹水获得高亲和力的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2。确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；为研制和开发抗SEB嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。
文档编号C12N15/11GK101962406SQ20101029508
公开日2011年2月2日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者孙元杰, 宋朝君, 李永明, 杨琨, 董邦权, 金伯泉 申请人:中国人民解放军第四军医大学