衍生自噬纤维菌属物种(CYTOPHAGA SP.)淀粉酶|(CSPAMY2)的α淀粉酶的α淀粉酶变体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了涉及变体α-淀粉酶的组合物和方法。所述变体α-淀粉酶可用于例如淀粉液化和糖化、用于清洁衣物、餐具和其他应用中的含淀粉污渍、用于纺织物处理(例如退浆)、在动物饲料中用于改善消化率以及用于烘培和酿造。
【专利说明】衍生自趟纤维菌属物种（C^OPHAGASP.)淀粉酶I(CSPAMY2)的a淀粉酶的a淀粉酶变体
[000。 优先权
[0002] 本专利申请要求于2012年6月8日提交的美国临时专利申请No. 61/657,501的 优先权，该专利申请全文据此W引用方式并入。
【技术领域】
[0003]本发明公开了涉及变体a-淀粉酶的组合物和方法。所述变体a-淀粉酶可用于 例如淀粉液化和糖化、清洁含淀粉污溃、纺织物退浆、烘赔和酿造。
【背景技术】
[0004]淀粉由直链淀粉（15-30%w/w)和支链淀粉（70-85%w/w)的混合物组成。直链 淀粉由a-1，4-连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量（MW)为约60, 000至约800, 000。支 链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有a-1，6分支点的支链聚合物；其MW可高达一亿。
[0005] 浓缩右旋糖浆形式的得自淀粉的糖目前通过酶催化法制备，所述方法涉及；（1) 用a-淀粉酶将固体淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度为约7-10的糊精，W及（2)用 淀粉葡糖巧酶（也称为葡萄糖淀粉酶或GA)将所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖化。所 得的糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称为异糖 浆（isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖浆也可用微生物（如酵母）发酵W产生 商品，包括例如己醇、巧樣酸、乳酸、玻巧酸、衣康酸、谷氨酸一轴、葡糖酸盐、赖氨酸、其他有 机酸、其他氨基酸和其他生物化学品。可同时进行发酵和糖化（即SSF工艺）来实现更大 的经济性和效率。
[0006]a-淀粉酶通过随机裂解内部a-1，4-糖巧键来水解淀粉、糖原和相关多糖。特别 是来自杆菌属炬acilli)的a-淀粉酶已被用于多种不同的用途，包括淀粉液化和糖化、纺 织物退浆、造纸和纸浆工业中的淀粉改性、酿造、烘赔、食品工业的糖浆的生产、发酵工艺的 原料的生产W及用于动物饲料W提高可消化性。该些酶也可用于在盘碟洗涂和衣物洗涂过 程中除去含淀粉污垢和污溃。
【发明内容】
[0007] 本发明的组合物和方法涉及变体淀粉酶多肤及其使用方法。在W下分别带编号的 段落中概述了本发明组合物和方法的各方面和实施例。
[000引1. 一种衍生自亲本a-淀粉酶多肤的变体a-淀粉酶多化所述变体a-淀粉酶 多肤在有效氨基酸位置处包含至少一个可组合突变；其中；（i)所述可组合突变为与亲本 a-淀粉酶相比，改善了变体a-淀粉酶的至少一种所需特性，而与亲本a-淀粉酶相比， 不显著降低变体a-淀粉酶的表达、活性或稳定性的突变，（ii)所述有效位置为可用多种 不同的氨基酸残基置换的氨基酸位置，该些置换的每个均导致符合（i)的要求的变体淀粉 酶，并且（iii)所述可组合突变列在列表A、B、C、D、E或F中或在表格D中列出，其使用SEQ IDNO:I进行编号。
[0009] 2.在段落I的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的每一者产 生变体淀粉酶，其中关于（i)蛋白质表达、（ii)活性和（iii)洗涂剂稳定性或热稳定性，相 对于亲本淀粉酶的最低性能指数（PI)大于或等于0.9,并且关于（i)、（ii)或（iii)中的 任一者的PI大于或等于1.0。
[0010] 3.在段落1的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的每一者产 生变体淀粉酶，其中关于（i)蛋白质表达、（ii)活性和（iii)洗涂剂稳定性或热稳定性，相 对于亲本淀粉酶的最低性能指数（PI)大于或等于0.8,并且关于（i)、（ii)或（iii)中的 任一者的PI大于或等于1.2。
[0011] 4.在段落1的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的每一者产 生变体淀粉酶，其中关于（i)蛋白质表达、（ii)活性和（iii)洗涂剂稳定性或热稳定性，相 对于亲本淀粉酶的最低性能指数（PI)大于或等于0.5,并且关于（i)、（ii)或（iii)中的 任一者的PI大于或等于1.5。
[0012] 5.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的 每一者具有适宜性得分+++、++++或+++++，参见表C。
[0013] 6.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的 每一者具有适宜性得分++++或+++++，参见表C。
[0014] 7.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的 每一者具有适宜性得分+++++，参见表C。
[0015] 8.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，所述至少一个可组合突变的 每一者具有1或2的有效性得分，参见表B。
[0016] 9.根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，所述变体淀粉酶具有多个可组合 突变。
[0017] 10.在一些实施例中，前述段落任一者的变体淀粉酶还包含对应于选自Arg-178、 Gly-179、T虹-180和Gly-181的残基的缺失，该些残基使用SEQIDN0:1进行编号。
[0018] 11.在一些实施例中，前述段落任一者的变体淀粉酶还包含对应于残基Arg-178 和Gly-179的缺失，该些残基使用SEQIDN0:1进行编号。
[0019] 12.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本a-淀粉酶或变体 a-淀粉酶与SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 2的氨基酸序列具有至少60 %的氨基酸序列同一 性。
[0020] 13.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本a-淀粉酶或变体 a-淀粉酶与SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 2的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一 性。
[0021] 14.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本a-淀粉酶或变体 a-淀粉酶与SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 2的氨基酸序列具有至少80 %的氨基酸序列同一 性。
[0022] 15.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本a-淀粉酶或变体 a-淀粉酶与SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 2的氨基酸序列具有至少90 %的氨基酸序列同一 性。
[0023] 16.在另一方面，提供包含段落1-15中任一者的变体淀粉酶的组合物。
[0024] 17.在段落16的组合物的一些实施例中，所述组合物可有效用于从衣物、餐具或 纺织品移除含淀粉污溃。
[00巧]18.在段落16或17的组合物的一些实施例中，还包含表面活性剂。
[0026] 19.在段落16-18的组合物的一些实施例中，所述组合物为洗涂剂组合物。
[0027] 20.在段落16-19的组合物的一些实施例中，所述组合物是衣物洗涂剂或衣物洗 涂剂添加剂。
[0028] 21.在段落16-20的组合物的一些实施例中，所述组合物是手动或自动餐具洗涂 剂。
[0029] 22.在一些实施例中，段落16-21的组合物还包含一种或多种另外的酶，所述另 外的酶选自；蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、 脂肪酶、磯脂酶、醋酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、 还原酶、氧化酶、酷氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、稼酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶 (malanase)、目-葡聚糖酶、阿拉伯糖巧酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和除了段落1-15中 任一者的淀粉酶之外的淀粉酶。
[0030] 23.在一些实施例中，段落16的组合物是用于液化淀粉。
[0031] 24.在一些实施例中，段落16的组合物是用于糖化包含淀粉的组合物、用于液化 后的SSF或用于无预先液化的直接SSF。
[0032] 25.在一些实施例中，段落16的组合物是用于制备发酵饮料。
[0033] 26.在一些实施例中，段落16的组合物是用于制备烘培食品。
[0034] 27.在一些实施例中，段落16的组合物是用于纺织物退浆。
[0035] 28.在另一方面，提供一种用于从表面移除含淀粉污溃或污垢的方法，所述方法包 括；在包含有效量的段落1-15任一者的变体淀粉酶的含水组合物的存在下接触所述表面， W及让所述多肤水解所述含淀粉污溃中存在的淀粉组分W产生溶解于所述含水组合物中 的较小淀粉衍生分子，W及清洗所述表面，从而从所述表面移除所述含淀粉污溃。
[0036] 29.在段落28的方法的一些实施例中，所述含水组合物还包含表面活性剂。
[0037] 30.在段落28-29的方法的一些实施例中，所述表面是纺织物表面。
[0038] 31.在段落28-29的方法的一些实施例中，所述表面是在餐具上。
[0039] 32.在段落28-29的方法的一些实施例中，所述表面为有污垢的硬质表面。
[0040] 33.在段落28-32的方法的一些实施例中，所述组合物还包含至少一种另外的酶， 所述另外的酶选自蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚 糖酶、脂肪酶、磯脂酶、醋酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白 酶、还原酶、氧化酶、酷氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、稼酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁 酶、目-葡聚糖酶、阿拉伯糖巧酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和除了段落1-15中任一者的 淀粉酶之外的淀粉酶。
[0041] 34.在另一方面，提供糖化包含淀粉的组合物W制备包含葡萄糖的组合物的方法， 其中所述方法包括：（i)使包含淀粉的所述溶液与有效量的段落1-15任一者的变体淀粉酶 接触；W及（ii)糖化包含淀粉的溶液W制备包含葡萄糖的组合物；其中所述变体淀粉酶催 化所述淀粉溶液到葡萄糖的糖化。
[0042] 35.在段落34的方法的一些实施例中，包含淀粉的组合物包含液化淀粉、糊化淀 粉或颗粒淀粉。
[0043] 36.在段落34或35的方法的一些实施例中，在约3(TC至约75C的温度范围下进 行糖化。
[0044] 37.在段落36的方法的一些实施例中，所述温度范围为47C- 74C。
[0045] 38.在段落34-37任一者的方法的一些实施例中，在抑2. 0-7. 5的抑范围内进行 糖化。
[004引 39.在段落38的方法的一些实施例中，所述抑范围是抑3. 5-5. 5。
[0047] 40.在段落39的方法的一些实施例中，所述抑范围是抑3. 5 - 4. 5。
[0048] 41.在一些实施例中，段落34-40任一者的方法还包括使所述葡萄糖组合物发酵 W制备发酵最终（endoffermentation,EOF)产物。
[0049] 42.在段落41的方法的一些实施例中，所述发酵是同时糖化和发酵（SS巧反应。
[0050] 43.在段落41或42的方法的一些实施例中，在抑2-8下并且在25°C- 70°C的温 度范围内进行所述发酵48 - 70小时。
[0051] 44.在段落41-43任一者的方法的一些实施例中，所述EOF产物包含己醇。
[0052] 45.在段落41-44任一者的方法的一些实施例中，所述EOF产物包含8-18% (v/v) 的己醇。
[0053] 46.在段落41-45的方法的一些实施例中，所述方法还包括使麦芽浆和/或麦芽汁 与淀粉酶接触。
[0054] 47.在段落46的方法的一些实施例中，所述方法还包括；（a)制备麦芽浆；化） 过滤所述麦芽浆W得到麦芽汁；W及（C)使所述麦芽汁发酵W获得发酵饮料，其中将段落 1-16和74-80中的任一者的变体淀粉酶添加至；（i)步骤（a)的麦芽浆和/或（ii)步骤 化）的麦芽汁和/或QiD步骤（C)的麦芽汁。
[005引 48.在段落41-47任一者的方法的一些实施例中，所述EOF产物包含代谢物。
[0056] 49.在段落48的方法的一些实施例中，所述代谢物是巧樣酸、乳酸、玻巧酸、谷氨 酸一轴、葡糖酸、葡糖酸轴、葡糖酸巧、葡糖酸钟、葡糖酸5 -内醋、异抗坏血酸轴、Q-3脂肪 酸、下醇、氨基酸、赖氨酸、衣康酸、1，3-丙二醇或异戊二帰。
[0057] 50.在一些实施例中，段落34-49任一者的方法还包括将葡萄糖淀粉酶、己糖激 酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磯酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、目-淀粉酶、不是所 述变体a-淀粉酶的a-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉 酶、氧化还原酶、醋酶、转移酶、果胶酶、a-葡糖巧酶、目-葡糖巧酶或它们的组合添加至所 述淀粉溶液。
[0058] 51.在段落50的方法的一些实施例中，添加所述葡萄糖淀粉酶达到0. 1 -2葡萄糖 淀粉酶单位（GAU)/gdso
[0059] 52.在段落34-51任一者的方法的一些实施例中，所述淀粉酶由宿主细胞表达和 分泌。
[0060] 53.在段落52的方法的一些实施例中，使所述包含淀粉的组合物与所述宿主细胞 接触。
[0061] 54.在段落52或53的方法的一些实施例中，所述宿主细胞还表达和分泌葡萄糖淀 粉酶或其他酶。
[0062] 55.在段落52-54任一者的方法的一些实施例中，所述宿主细胞能使所述组合物 发酵。
[0063] 56.在另一方面，提供通过段落34-55中任一者的方法制备的包含葡萄糖的组合 物。
[0064] 57.在另一方面，提供通过段落34-55中任一者的方法制备的液化淀粉。
[0065] 58.在另一方面，提供通过段落34-55中任一者的方法制备的发酵饮料。
[0066] 59.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在制备包含葡萄糖的组合物中的 用途。
[0067] 60.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在制备液化淀粉中的用途。
[0068] 61.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在制备发酵饮料中的用途。
[0069] 62.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在清洁含淀粉污溃中的用途。
[0070] 63.在另一方面，提供段落1-15任一者的淀粉酶在纺织物退浆中的用途。
[0071] 64.在根据段落34-55中任一者的方法、段落58的发酵饮料或段落61的用途的 一些实施例中，所述发酵饮料或发酵最终产物选自（i)啤酒，所述啤酒选自全麦芽啤酒、根 据"ReinheitsgeboU纯净法）"酿造的啤酒、爱尔啤酒、IPA、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒 (Happoshu)(第二啤酒）、第H啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、 波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒（stout)、麦芽酒、无酒精啤酒和无酒精麦芽酒；和（ii)谷 物或麦芽饮料，选自水果味麦芽饮料、酒味麦芽饮料和咖啡味麦芽饮料。
[0072] 65.在另一方面，提供制备食品组合物的方法，包括将；（i) 一种或多种食品成分 与（ii)段落1-15任一者的变体a-淀粉酶合并，其中其变体a-淀粉酶催化所述食品成 分中存在的淀粉组分水解而产生葡萄糖。
[0073] 66.在段落65的方法的一些实施例中，所述食品组合物选自食品、烘赔组合物、食 品添加剂、动物食品、饲料产品、饲料添加剂、油、肉和猪油。
[0074] 67.在段落65-66中任一者的方法的一些实施例中，所述一种或多种食品成分包 含烘培成分或添加剂。
[00巧]68.在段落65-67中任一者的方法的一些实施例中，所述一种或多种食品成分选 自粉；抗变陈淀粉酶；磯脂酶；磯脂；生麦芽糖a-淀粉酶或其具有生麦芽糖a-淀粉酶活 性的变体、同源物或突变体；烘赔食品用木聚糖酶；和脂肪酶。
[0076] 69.在段落65的方法的一些实施例中，所述一种或多种食品成分选自；（i)来自嗜 热脂肪芽抱杆菌炬acillusStearothermo地ilus)的生麦芽糖a-淀粉酶、（ii)来自芽抱 杆菌炬acillus)、曲霉（Aspergillus)、嗜热丝抱菌（Thermomyces)或木霉（Trichoderma) 的烘赔食品用木聚糖酶、（iii)来自异抱镶抱菌(Pusariumheterosporum)的糖脂酶。
[0077] 70.在段落65-69中任一者的方法的一些实施例中，所述食品组合物包含生面团 或生面团产品，优选经加工的生面团产品。
[0078] 71.在一些实施例中，段落65-70中任一者的方法还包括烘赔所述食品组合物W 制备烘赔物。
[0079] 72.在一些实施例中，段落65-70中任一者的方法还包括；（i)提供淀粉介质； (ii)向所述淀粉介质添加淀粉酶；W及（iii)在步骤化）期间或之后给所述淀粉介质加热 W制备烘赔产品。
[0080] 73.在另一方面，提供使纺织物退浆的方法，包括使退浆组合物与上浆纺织物接触 足W使所述纺织物退浆的时间，其中所述退浆组合物包含段落1-15中任一者的变体a-淀 粉酶。
[0081] 74.在另一方面，提供分离的编码段落1-15任一者的多肤的多核巧酸。
[0082] 75.在另一方面，提供包含段落74的多核巧酸的表达载体。
[0083] 76.在另一方面，提供包含段落75的表达载体的宿主细胞。
[0084] 通过本发明的描述和附图，所述组合物和方法的该些方面和其他方面W及实施例 将显而易见。
[00巧]序列的简要说明
[0086]SEQIDNO: 1示出了瞻纤维菌属物种（切tophagasp.)淀粉酶（CspAmy2)的成熟 形式的氨基酸序列。
[0087]SEQIDNO: 2示出了具有精氨酸178和甘氨酸179缺失的变体瞻纤维菌属物种淀 粉酶（CspAmy2-vl)的成熟形式的氨基酸序列。
[0088]SEQIDNO:3示出了具有信号肤的瞻纤维菌属物种淀粉酶（CspAmy2-vl)的变体形 式的未成熟/前体形式的氨基酸序列。
[0089]SEQIDN0:4 示出 了编码CspAmy2-vl淀粉酶（SEQIDN0:2)的合成DNA片段 (CspAmy2-vlDNA)的核巧酸序列。
【具体实施方式】
[0090] 本发明描述了涉及变体淀粉酶的组合物和方法。所述变体是综合各种实验方法发 现的，如所附的"实例"中详细描述的。方法包括利用位点评价文库（SEL)和基于结构的分 析。变体淀粉酶的示例性应用是用于淀粉液化和糖化、用于清洁衣物、餐具和其他应用中的 含淀粉污溃、用于纺织物处理（例如退浆）、在动物饲料中用于改善消化率W及用于烘培和 酿造。所述组合物和方法的该些及其他方面在下文详细描述。
[0091] 在描述本发明组合物和方法的各个方面和实施例之前，描述了如下定义和缩写。
[0092] 1.定父巧缩写
[0093] 根据此详细描述，应用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则 单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括多个指代物。因此，例如，提及"酶"包括多个此种 酶，而提及"剂量"，包括提及一个或多个剂量W及本领域技术人员已知的其等同物，等等。
[0094] 本文档被组织成多个章节，W便于阅读；然而，读者将会知道，在一个章节中进行 的陈述可W应用到其他章节。因此，本公开不同章节使用的标题不应理解为限制性的。
[0095] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通 常所理解的含义。下面提供如下的术语。
[0096] 1. 1.缩写巧首字母缩略词
[0097] 如下缩写/首字母缩略词具有如下含义，除非另外规定：
[0098]ABTS 2, 2-连氮基-双-3-己基苯并喔哇晰-6-賴酸
[0099]AE或AEO 醇己氧基化物
[0100]AES或AEOS 醇己氧基硫酸盐
[0101] AkAA 白曲霉（Aspergilluskawachii)a_ 淀粉酶
[010引 AnGA 黑曲霉（Aspergillusniger)葡萄糖淀粉酶
[0103] AOSa-帰姪賴酸盐
[0104] AS 焼基硫酸盐
[010引 cDNA 互补DNA
[0106] CMC 駿甲基纤维素
[0107] DE 右旋糖当量
[0108] DNA 脱氧核糖核酸
[0109] D化 具有n个亚单元的多糖聚合度
[0110] ds或DS干固形物
[0111] DTMPA 二亚己基H胺五己酸
[011引 EC 酶学委员会
[0113] 邸TA 己二胺四己酸
[0114] EO 环氧己焼（聚合物片段）
[011引 EOF 发酵结束
[0116] GA 葡萄糖淀粉酶
[0117] GAU/gds 葡萄糖淀粉酶活性单位/克干固形物
[0118] HFCS 高果糖玉米糖浆
[0119] HgGA 灰腐质霉（Humicolagrisea)葡萄糖淀粉酶
[0120] IPTG 异丙基目-D-硫代半乳糖巧
[0121] IRS 不溶性残留淀粉
[0122] kDa 千道尔顿
[0123] LAS 直链焼基苯賴酸盐
[0124] LAT>BLA 地衣芽抱杆菌炬.Iicheniformis)淀粉酶
[012引 MW 分子量
[0126] MWU 改良的伍格母单位；1. 6Xl(T5mg/MWU=活性单位
[0127] NCBI 美国国家生物技术信息中也
[0128] NOBS 壬醜基氧基苯賴酸盐
[0129] NTA 次氨基己酸
[0130] OxAm 化rastarHPAM5000L(美国丹尼斯科公司值aniscoUSInc.))
[0131] PAHBAH 对轻基苯甲醜脱
[013引 PEG 聚己二醇
[0133] Pl 等电点
[0134] PI 性能指数
[013引 ppm 百万分率，例如yg蛋白质/g干固形物
[0136] PVA 聚（己帰醇）
[0137] PVP 聚（己帰化咯焼丽）
[013引 RCF 相对离也/向也力（即X重力）
[0139] RNA 核糖核酸
[0140]SAS 链焼賴酸盐
[0141]SDS-PAG 十二焼基硫酸轴聚丙帰醜胺凝胶电泳
[0142]SSF 同时糖化和发酵
[0143]SSU/g固形物 可溶性淀粉单位/克干固形物
[0144]sp. 物种
[0145]TAED 四己醜基己二胺
[0146]Tm 解链温度
[0147]TrGA 里氏木霉（Trichodermareesei)葡萄糖淀粉酶
[0148]w/v 重量/体积
[0149]w/w 重量/重量
[0150]v/v 体积/体积
[0巧1] Wt% 重量％
[0152] V 摄氏度
[0巧引 &0 水
[0154] 化0或DI 去离子水
[015引（11&0 Milli-Q过滤的去离子水
[0156] g或卵克
[0157]Ug 微克
[015引mg 毫克
[0159]kg 千克
[0160]Ul和Ul 微升
[0161] 血和ml 晕升
[0162]mm 毫米
[0163] Um 微米
[0164]M 摩尔
[016引ml 毫摩尔
[0166]UM 微摩尔
[0167]U 单位
[016引sec 砂
[0169]min 分钟
[0170]hr 小时
[0171]DO 溶氧
[0172]Ncm 牛顿厘米
[017引化地己醇
[0174]eq. 当量
[0175]N 当量浓度
[0176]uPWA 源自沃斯氏热球菌（Pyrococcuswoesei)的变体a-淀粉酶
[0177]PWA 来自沃斯氏热球菌的a-淀粉酶
[017引MWCO 分子量筛截
[0179]SSI?L 斯坦福同步加速器福射光源（StanfordSync虹otronRadiation Lightsource)
[0180] PDB蛋白质数据库
[0181]CA巧 碳水化合物活性酶数据库
[0182]Tris-HClH(轻甲基）氨基甲焼盐酸盐
[0183] 肥阳S 4-(2-轻己基）-1-脈嗦己賴酸 阳184] 1. 2.定父
[0185] 术语"淀粉酶"或"淀粉分解酶"是指除其他方面外还能够催化淀粉的降解的 酶。a-淀粉酶为裂解淀粉中的a-D-(l- 4)0-糖巧键的水解酶。一般来讲，a-淀粉酶 巧C3. 2. 1. 1 ;a-D-(1 - 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶）定义为W随机方式裂解淀粉分子内的 a-D- (1 - 4) 0-糖巧键从而生成含有H个或更多个（1-4) -a-连接的D-葡萄糖单元的多 糖的内切作用酶。相反地，外切淀粉分解酶如目-淀粉酶巧C3. 2. 1. 2 ;a-D-(1 - 4)-葡 聚糖麦芽糖水解酶）和一些产物特异性淀粉酶如生麦芽糖a-淀粉酶巧C3. 2. 1. 133)从 底物的非还原端裂解多糖分子。目-淀粉酶、a-葡萄糖巧酶巧C3. 2. 1. 20 ;a-D-葡糖巧 葡萄糖水解酶）、葡萄糖淀粉酶巧C3. 2. 1. 3 ;a-D-(1 - 4)-葡聚糖葡糖水解酶）和产物 特异性淀粉酶如麦芽四糖巧酶巧C3. 2. 1. 60)和麦芽六糖巧酶巧C3. 2. 1. 98)可产生特定 长度的麦芽低聚糖或特定麦芽低聚糖的富集糖浆。
[0186] 本文的"酶单位"是指在规定的测定条件下每一定时间所形成的产物的量。例如， "葡萄糖淀粉酶活性单位"佑AU)定义为在6(TC、抑4. 2下每小时从可溶性淀粉底物（4% D巧产生Ig葡萄糖的酶量。"可溶性淀粉单位"(SSU)是在抑4. 5、5(TC下每分钟从可溶性 淀粉底物（4%D巧产生Img葡萄糖的酶量。DS是指"干固形物"。
[0187] 术语"淀粉"指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何材料，由具有式（CeHwOs) y(其中X可W是任何数字）的直链淀粉和支链淀粉构成。所述术语包括基于植物的材料， 如谷粒、谷物、草、块茎和根，并且更具体地讲是从小麦、大麦、玉米、黑麦、水稻、高梁、慷、木 墓、小米、蜀泰、马铃墓、甘墓和木墓粉获得的材料。术语"淀粉"包括颗粒淀粉。术语"颗粒 淀粉"是指生的即未蒸煮过的淀粉，例如尚未经受糊化的淀粉。
[0188] 关于多肤的术语"野生型"、"亲本"或"参考"是指不在一个或多个氨基酸位置处 包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肤。类似地，关于多核巧酸的术语"野生 型"、"亲本"或"参考"是指不包括人为制造的核巧改变的天然存在的多核巧酸。然而，应注 意，编码野生型多肤、亲本多肤或参考多肤的多核巧酸不局限于天然存在的多核巧酸，而涵 盖编码野生型多肤、亲本多肤或参考多肤的任何多核巧酸。
[0189] 对野生型多肤的提及应理解为包括所述多肤的成熟形式。"成熟"多肤或其变体是 其中信号序列不存在，例如信号序列在所述多肤的表达期间或之后从所述多肤的不成熟形 式切除的多肤或变体。
[0190] 关于多肤的术语"变体"是指因其包括一个或多个天然存在的或人为的氨基酸置 换、插入或缺失而不同于指定的野生型多肤、亲本多肤或参考多肤的多肤。类似地，关于多 核巧酸的术语"变体"是指核巧酸序列不同于指定的野生型多核巧酸、亲本多核巧酸或参考 多核巧酸的多核巧酸。野生型、亲本或参考多肤或多核巧酸的身份从上下文来看将是显而 易见的。
[0191]就本发明a-淀粉酶而言，"活性"是指a-淀粉酶活性，其可如本文所述进行测 量。
[0192] 当关于对象细胞、核酸、蛋白质或载体而使用时，术语"重组"指所述对象已从其天 然状态经过修饰。因此，例如，重组细胞表达未在天然（非重组）形式的细胞中存在的基因， 或者W不同于自然界中存在的水平或条件表达天然基因。重组核酸与天然序列相差一个或 多个核巧酸和/或有效连接（oper油Iylinked)至异源序列，如表达载体中的异源启动子。 重组蛋白可与天然序列相差一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码淀粉酶的 核酸的载体是重组载体。
[0193] "组合变体"是包含两个或更多个突变，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等置换、缺失 和/或插入的变体。
[0194] "可组合突变"是任何可用于制备组合变体的氨基酸位置处的突变。可组合突变改 善分子（在该种情况下，为淀粉酶）的至少一种所需特性，而不明显降低表达、活性或稳定 性。可组合突变可分组如下：
[0195] 级1 ;产生该样的变体的突变，其中相对于限定的亲本蛋白质在W下方面的最小 性能指数（PI)大于或等于0.9;a)蛋白质表达；（ii)pH8(25°C)或抑IO(SOC)下的 CS-28微样片活性，或Ceralpha测定法中的活性，或玉米粉或玉米淀粉应用测定法中的活 性；W及（iii)pH5.0或pH5. 7下的洗涂剂稳定性或热稳定性，并且此外对于该些测试中 的任一项具有大于或等于1. 0的PI。
[0196] 组卫；产生该样的变体的突变，其中相对于限定的亲本蛋白质在W下方面的最小 性能指数（PI)大于或等于0.8;(リ蛋白质表达；（ii)pH8(25°C)或抑10(50°C)下的 CS-28微样片活性，或Ceralpha测定法中的活性，或玉米粉或玉米淀粉应用测定法中的活 性；W及（iii)pH5.0或pH5. 7下的洗涂剂稳定性或热稳定性，并且此外对于该些测试中 的任一项具有大于或等于1. 2的PI。
[0197] ILG;产生该样的变体的突变，其中相对于限定的亲本蛋白质在W下方面的最小 性能指数（PI)大于或等于〇.5;a)蛋白质表达；（ii)pH8(25°C)或抑IO(SOC)下的 CS-28微样片活性，或Ceralpha测定法中的活性，或玉米粉或玉米淀粉应用测定法中的活 性；W及（iii)pH5.0或pH5. 7下的洗涂剂稳定性或热稳定性，并且此外对于该些测试中 的任一项具有大于或等于1. 5的PI。
[019引可组合突变的特性和概况在下表中汇总。 阳19引 表A.毎纽巧纽合突巧的巧能特巧巧概况
[0200]
【权利要求】
1.一种衍生自亲本a-淀粉酶多肽的变体a-淀粉酶多肽，所述变体a-淀粉酶多肽 在有效氨基酸位置处包含至少一个可组合突变；其中： (i) 所述可组合突变为与所述亲本a_淀粉酶相比，改善所述变体a_淀粉酶的至少一 种所需特性，而与所述亲本a-淀粉酶相比，不显著降低所述变体a-淀粉酶的表达、活性 或稳定性的突变， (ii) 所述有效位置是可用多个不同的氨基酸残基置换的氨基酸位置，所述置换的每一 者可导致符合（i)的要求的变体淀粉酶，并且 (iii) 所述可组合突变在列表A、B、C、D、E或F或在表格D中列出，其使用SEQIDN0:1 进行编号。
2. 根据权利要求1所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变产生变体淀粉酶，其中关 于a)蛋白质表达、ai)活性和aii)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于所述亲本淀粉酶 的最低性能指数（pi)大于或等于〇.9,并且关于a)、ai)或an)中的任一者的所述pi 大于或等于1.0。
3. 根据权利要求1所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变产生变体淀粉酶，其中关 于a)蛋白质表达、ai)活性和an)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于所述亲本淀粉酶 的最低性能指数（pi)大于或等于〇.8,并且关于a)、ai)或an)中的任一者的所述pi 大于或等于1.2。
4. 根据权利要求1所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变产生变体淀粉酶，其中关 于a)蛋白质表达、ai)活性和an)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于所述亲本淀粉酶 的最低性能指数（pi)大于或等于〇.5,并且关于a)、ai)或an)中的任一者的所述pi 大于或等于1.5。
5. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变具有适宜性得分 +++>++++ 或 +++++,参见表Co
6. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变具有适宜性得分 ++++或+++++,参见表Co
7. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变具有适宜性得分 +++++，参见表C。
8. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述可组合突变具有有效性得分 1或2,参见表B。
9. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，所述变体淀粉酶具有多个可组合突 变。
10. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，所述变体淀粉酶还包含对应于选自 Arg-178、Gly-179、Thr-180和Gly-181的残基的缺失，所述残基使用SEQIDNO: 1进行编 号。
11. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，所述变体淀粉酶还包含对应于残基 Arg-178和Gly-179的缺失，所述残基使用SEQIDNO: 1进行编号。
12. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本a-淀粉酶或所述变 体a-淀粉酶与SEQIDNO: 1或SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少60 %的氨基酸序列同 一性。
13. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本a-淀粉酶或所述变 体a-淀粉酶与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少70 %的氨基酸序列同 一性。
14. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本a-淀粉酶或所述变 体a-淀粉酶与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同 一性。
15. 根据前述权利要求任一项所述的变体淀粉酶，其中所述亲本a-淀粉酶或所述变 体a-淀粉酶与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少90 %的氨基酸序列同 一性。
16. -种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-15中任一项所述的变体淀粉酶。
17. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物对于从衣物、餐具或纺织物除去 含淀粉污渍是有效的。
18. 根据权利要求16或17所述的组合物，所述组合物还包含表面活性剂。
19. 根据权利要求16-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物为洗涤剂组合物。
20. 根据权利要求16-19中任一项所述的组合物，其中所述组合物为衣物洗涤剂或衣 物洗涤剂添加剂。
21. 根据权利要求16-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物是人工或自动餐具 洗涤剂。
22. 根据权利要求16-21中任一项所述的组合物，所述组合物还包含一种或多种另外 的选自如下的酶：蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚 糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白 酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁 酶、0 -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和除了权利要求1-15中任一 项所述的淀粉酶之外的淀粉酶。
23. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于液化淀粉的。
24. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于糖化包含淀粉的组合物、 用于液化后的SSF或用于无预先液化的直接SSF的。
25. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于制备发酵饮料的。
26. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于制备烘培食品的。
27. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是用于纺织物退浆的。
28. -种从表面除去含淀粉污渍或污垢的方法，所述方法包括： 在包含有效量的根据权利要求1-15任一项所述的变体淀粉酶的含水组合物的存在下 接触所述表面， 让所述多肽水解所述含淀粉污渍中存在的淀粉组分以产生溶解于所述含水组合物中 的较小淀粉衍生分子，以及 清洗所述表面， 从而从所述表面上移除所述含淀粉污渍。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述含水组合物还包含表面活性剂。
30. 根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述表面为纺织物表面。
31. 根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述表面是在餐具上的。
32. 根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述表面为有污垢的硬质表面。
33. 根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含至少一种另外 的选自如下的酶：蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚 糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白 酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁 酶、0 -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和除了根据权利要求1-15中 任一项所述的淀粉酶之外的淀粉酶。
34. -种糖化包含淀粉的组合物以制备包含葡萄糖的组合物的方法，其 中所述方法包括： (i) 使所述包含淀粉的溶液与有效量的根据权利要求1-15任一项所述的变体淀粉酶 接触；以及 (ii) 糖化所述包含淀粉的溶液以制备所述包含葡萄糖的组合物；其中所述变体淀粉 酶催化所述淀粉溶液到葡萄糖的糖化。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述包含淀粉的组合物包含液化淀粉、糊化淀 粉或颗粒淀粉。
36. 根据权利要求34-35中任一项所述的方法，其中所述糖化在约30°C至约75°C的温 度范围内进行。
37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述温度范围为47°C_74°C。
38. 根据权利要求34 - 37中任一项所述的方法，其中所述糖化在pH 2. 0-7. 5的pH范 围内进行。
39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述pH范围为pH3. 5 - 5. 5。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述pH范围为pH 3. 5 - 4. 5。
41. 根据权利要求34-40中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述葡萄糖组合物 发酵以制备发酵最终（EOF)产物。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述发酵是同时糖化和发酵（SSF)反应。
43. 根据权利要求41或42所述的方法，其中所述发酵在pH2-8下并且在25°C-70°C 的温度范围内进行48-70小时。
44. 根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含乙醇。
45. 根据权利要求41 - 44中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含8-18% (v/v) 乙醇。
46. 根据权利要求41 - 45中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使麦芽浆和/或 麦芽汁与淀粉酶接触。
47. 根据权利要求46所述的方法，其中所述方法还包括： (a) 制备麦芽楽； (b) 过滤所述麦芽浆以得到麦芽汁；以及 (c) 使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料， 其中将根据权利要求1-16和74-80中任一项所述的变体淀粉酶添加至： (i)步骤（a)的麦芽浆和/或 (ii) 步骤（b)的麦芽汁和/或 (iii) 步骤（C)的麦芽汁。
48. 根据权利要求41-47中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含代谢物。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述代谢物是柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一 钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸S-内酯、异抗坏血酸钠、Q-3脂肪酸、 丁醇、氨基酸、赖氨酸、衣康酸、1，3-丙二醇或异戊二烯。
50. 根据权利要求34 - 49中任一项所述的方法，所述方法还包括将葡萄糖淀粉酶、己 糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、3 -淀粉酶、不 是所述变体a-淀粉酶的a-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀 粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、a-葡糖苷酶、葡糖苷酶或它们的组合添加至 所述淀粉溶液。
51. 根据权利要求50所述的方法，其中添加所述葡萄糖淀粉酶达到0. 1 - 2个葡萄糖淀 粉酶单位（GAU)/gds。
52. 根据权利要求34-51中任一项所述的方法，其中所述淀粉酶由宿主细胞表达和分 泌。
53. 根据权利要求52所述的方法，其中使所述包含淀粉的组合物与所述宿主细胞接 触。
54. 根据权利要求52或53所述的方法，其中所述宿主细胞还表达和分泌葡萄糖淀粉酶 或其他酶。
55. 根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞能使所述组合物发 酵。
56. -种组合物，所述组合物包含通过根据权利要求34-55中任一项所述的方法制备 的葡萄糖。
57. -种液化淀粉，所述液化淀粉通过根据权利要求34-55中任一项所述的方法制备。
58. -种发酵饮料，所述发酵饮料通过根据权利要求34-55中任一项所述的方法制备。
59. 根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶的用途，其用于制备包含葡萄糖的组合 物。
60. 根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶的用途，其用于制备液化淀粉。
61. 根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶的用途，其用于制备发酵饮料。
62. 根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶的用途，其用于清洁含淀粉污渍。
63. 根据权利要求1-15中任一项所述的淀粉酶的用途，其用于纺织物退浆。
64. 根据权利要求34-55中任一项所述的方法、根据权利要求58所述的发酵饮料或根 据权利要求61所述的用途，其中所述发酵饮料或发酵最终产物选自 (i) 选自如下的啤酒：全麦芽啤酒、根据"纯净法"酿造的啤酒、爱尔啤酒、IPA、拉格啤 酒、苦啤酒、低麦芽啤酒（第二啤酒）、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡 路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒和无酒精麦芽酒；以及 (ii) 选自如下的谷物或麦芽饮料：水果味麦芽饮料、酒味麦芽饮料和咖啡味麦芽饮 料。
65. -种制备食品组合物的方法，所述方法包括：将如下物质合并： (i) 一种或多种食品成分，和 (ii) 根据权利要求1-15中任一项所述的变体a-淀粉酶，其中所述其变体a-淀粉酶 催化所述食品成分中存在的淀粉组分的水解而产生葡萄糖。
66. 根据权利要求65所述的方法，其中所述食品组合物选自食品、烘焙组合物、食品添 加剂、动物食品、饲料产品、饲料添加剂、油、肉和猪油。
67. 根据权利要求65-66中任一项所述的方法，其中所述一种或多种食品成分包含烘 培成分或添加剂。
68. 根据权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述一种或多种食品成分选自粉； 抗变陈淀粉酶；磷脂酶；磷脂；生麦芽糖a-淀粉酶或其具有生麦芽糖a-淀粉酶活性的变 体、同源物或突变体；烘焙食品用木聚糖酶；和脂肪酶。
69. 根据权利要求65所述的方法，其中所述一种或多种食品成分选自： (i) 来自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus)的生麦芽糖a-淀粉酶， (ii) 来自芽孢杆菌属（Bacillus)、曲霉属（Aspergillus)、嗜热丝孢菌属 (Thermomyces)或木霉属（Trichoderma)的烘焙食品用木聚糖酶， (iii) 来自异孢镰孢菌（Fusariumheterosporum)的糖脂酶。
70. 根据权利要求65-69中任一项所述的方法，其中所述食品组合物包含生面团或生 面团产品，优选经加工的生面团产品。
71. 根据权利要求65-70中任一项所述的方法，所述方法还包括烘焙所述食品组合物 以制备烘焙物。
72. 根据权利要求65-70中任一项所述的方法，其中所述方法还包括： (i) 提供淀粉介质； (ii) 向所述淀粉介质添加淀粉酶；以及 (iii) 在步骤（b)期间或之后给所述淀粉介质加热以制备烘焙产品。
73. -种使纺织物退浆的方法，所述方法包括使退浆组合物与上浆纺织物接触足以使 所述纺织物退浆的时间，其中所述退浆组合物包含根据权利要求1-15中任一项所述的变 体a-淀粉酶。
74. -种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-15中任一项所述的多 肽。
75. -种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求74所述的多核苷酸。
76. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求75所述的表达载体。
【文档编号】C12N9/26GK104379738SQ201380030152
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年6月3日 优先权日:2012年6月8日
【发明者】L·G·卡斯康-佩雷拉, D·A·埃斯特尔, M·科尔克曼 申请人:丹尼斯科美国公司