专利名称：现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种刺参腐皮综合症病原(灿烂弧菌)的LAMP检测方法，尤其是一种 操作简便、成本低廉、检测准确，可在现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法及试剂盒。
背景技术：
刺参腐皮综合症为暴发性流行病，其传染率高，死亡率高达90%以上，一直危害着 海参养殖。研究表明，灿烂弧菌是刺参腐皮综合症的主要病原，尽早检测出灿烂弧菌是有效 防治刺参腐皮综合症的先决条件。目前，对于灿烂弧菌的检测方法有免疫荧光技术(FAT)、 酶联免疫吸附(ELISA)、分子检测技术(PCR、RFLP、AFLP、RAPD)等，但大多需要昂贵的仪器 设备和试剂，或者需要较长的检测时间和足够数量的病原，因受条件限制而不利于早期检 测，也不利于在基层养殖户中开展。LAMP检测方法是一种全新的恒温核酸扩增方法，因不 需要昂贵的精密仪器，只在一个管内即可以完成全部检测，具有简便、快速、准确、廉价等优 点，现在已有用LAMP法检测水产动物和水产养殖环境中病原菌的报道。首次用LAMP法检测 水产动物病原菌是迟钝爱德华氏菌，SAVAN等2004年根据迟钝爱德华氏菌的溶血素基因序 列设计4条引物，成功地扩增了迟钝爱德华氏菌的溶血素基因，检测出从日本鳗鲡等4种水 产动物和养殖水体中分离的5株迟钝爱德华氏菌。将LAMP法和PCR方法的灵敏性进行比 较，结果发现LAMP法对迟钝爱德华氏菌的最低检测极限为10CFU · πιΓ1，比PCR法灵敏100 倍。但是，检测非迟钝爱德华氏菌病原菌，都没有产生特异性扩增，从而证明LAMP法检测具 有很强的特异性。迄今为止，还没有关于将LAMP法应用于检测刺参腐皮综合症病原(灿烂 弧菌)的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术检测刺参腐皮综合症病原所存在的技术问题，提供一 种操作简便、成本低廉、检测准确，可在现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法及试剂品.ο
本发明的技术解决方案是一种现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法，其特 征在于依次按如下步骤进行
a.分别取海参样品0.08 0. 12克，置于多个不同编号的样品采集管中，将样品磨 碎至浆状；
b.分别蘸取不同编号样品采集管中的浆状海参样品，再置入对应编号且内装膜片 的采样管中并将膜片润湿；
c.分别吸取无水乙醇2 3滴滴于不同编号的采样管内及内装有膜片的阳性对照 管和内装有膜片的阴性对照管中，搅动各管内膜片30秒；
d.将c步骤所得膜片分别转移到对应编号且内装高纯水的膜片漂洗管内，将膜片 漂洗管震荡3 4分钟；
e.将漂洗管内的膜片分别转移到相应编号且内装有TE缓冲液的核酸变性管内，95°C保温4分钟，然后再迅速置于冷水或室温条件下2分钟；
f.再将上述核酸变性管内的膜片转移到相应编号的扩增检测管内，将扩增检测管 置于61 63°C保温60分钟；85 90°C条件下保温5分钟，然后迅速将扩增检测管上下 反复甩动1分钟；所述扩增检测管内装有扩增反应液，扩增反应液组成成分如下反应引物 VS-F3 和 VS-B3 各 0. 2 μ mol/L, VS-FIP 和 VS-BIP 各 1. 6 μ mol/L, pH8. 8 的 TrisHCl 20mmol/ L, KCl 10mmol/L, MgS046mmol/L, (NH4)2SO4IOmmo 1/L, Triton X-1000. 1%, Betainel. 6mol/ L，dNTP 1.6mmol/L,8U Bst DNA聚合酶；所述扩增检测管盖内由石蜡和聚乙二醇的混合物 将0. 1μ 1核酸染料固定在管盖的上方；编号为阳性对照管的扩增检测管内的扩增反应液 中还含有海参腐皮综合症致病病原的核酸DNA质粒标准液(10_4个拷贝)；所述反应引物的 DNA序列如下
VS-F3 5’ -TGGTCCCCCCATATTCAGAC ；
VS-B3 :5， -AAGTACCCCGAGGAAGAGAA
VS-FIP :5’ -GCCCCGTAACCGACACATCATTTTAGGATATCACGTGTCCCGC ；
VS-BIP
5’ -GGCACTTTCCAGAGCCTTCGTTTTTAGATTCCGAAAGTAGCGGC ；
g.用力向下甩动扩增检测管，目测、对比扩增检测管底部反应液颜色。
一种现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法用试剂盒，其特征在于
有多个不同编号内装剪裁成小片的FTA卡膜片的采样管；
有1管内装无水乙醇的试液管；
有多个不同编号内装高纯水的膜片漂洗管；
有多个不同编号内装TE缓冲液的核酸变性管；
有多个不同编号内装扩增反应液的扩增检测管，所述扩增反应液组成成分如 下反应引物 VS-F3 和 VS-B3 各 0. 2ymol/L，VS-FIP 和 VS-BIP 各 1.6ymol/L，pH8. 8 的 TrisHCl 20mmol/L,KCl 10mmol/L,MgS046mmol/L, (NH4)2S0410mmol/L, Triton X-1000. 1%, Betainel. 6mol/L, dNTP 1. 6mmol/L,8U Bst DNA聚合酶；所述扩增检测管盖内由石赌和聚 乙二醇的混合物将0. 1 μ 1核酸染料固定在管盖的上方；编号为阳性对照管的扩增检测管 内的反应液中还含有海参腐皮综合症致病病原的核酸DNA质粒标准液(10_4个拷贝)；所述 反应引物的DNA
序列如下
VS-F3 :5’ -TGGTCCCCCCATATTCAGAC ；
VS-B3 :5，-AAGTACCCCGAGGAAGAGAA ；
VS-FIP :5’ -GCCCCGTAACCGACACATCATTTTAGGATATCACGTGTCCCGC ；
VS-BIP
5’ -GGCACTTTCCAGAGCCTTCGTTTTTAGATTCCGAAAGTAGCGGC。
本发明是利用LAMP方法，针对灿烂弧菌设计了两对引物、具体的操作步骤及试剂 盒，用以检测刺参腐皮综合症病原(灿烂弧菌)。不需要昂贵的仪器设备和很长的检测时 间，即使在病原极少的情况下也能够检测出来，具有操作简便、成本低廉、检测准确等优点， 可以做到实时监控，及时发现疫情，减少疫病的发病趋势，早期预防病原蔓延，避免给养殖 户带来更大的损失。
具体实施例方式
本发明实施例的试剂盒外有试剂盒外包装(78X78X50)，试剂盒中有
1.编号分别为I、II、III、IV、V的5个样品采集管；
2. 5只研磨棒；
3. 25 根牙签；
4.编号分别为I、II、III、IV、V、(+)(阳性对照)、(_)(阴性对照)的7个样品采 样管，内装剪裁成小片的FTA卡膜片；
5. 1 根吸管；
6. 1管内装无水乙醇的试液管；
7.编号分别为I、II、III、IV、V、(+)(阳性对照)、(_)(阴性对照)内装内装高纯 水的7个膜片漂洗管；
8.编号分别为I、II、III、IV、V、⑴(阳性对照)、(_)(阴性对照)内装TE缓冲 液(含IOmM Tris-HCl禾Π ImM EDTA, ρΗ8. 0)的7个核酸变性管；
9.编号分别为1、11、111、1￥、￥、(+)(阳性对照)、(-)(阴性对照)内装扩增反应液 的7个扩增检测管，所述扩增反应液组成成分如下反应引物VS-F3和VS-B3各0. 2 μ mol/ L，VS-FIP 和 VS-BIP 各 1. 6μ mol/L，pH8. 8 的 TrisHC120mmol/L，KCl 10mmol/L,MgS046mmol/ L, (NH4)2S041Ommo1/L,Triton X-1000. 1 %,Betainel. 6mol/L,dNTP 1. 6mmol/L,8U Bst DNA 聚合酶；所述扩增检测管盖内由石蜡和聚乙二醇的混合物将0. 1μ 1核酸染料GeneFinder 固定在管盖的上方；石蜡和聚乙二醇混合物的重量配比可以是4 9 1，以能封住核酸染 料GeneFinder 及具有合适的熔点为准；编号为阳性对照管的扩增检测管内的反应液中还 含有海参腐皮综合症致病病原的核酸DNA质粒标准液(10_4个拷贝)；所述反应引物的DNA 序列如下
VS-F3 :5’ -TGGTCCCCCCATATTCAGAC ；
VS-B3 :5，-AAGTACCCCGAGGAAGAGAA ；
VS-FIP :5’ -GCCCCGTAACCGACACATCATTTTAGGATATCACGTGTCCCGC ；
VS-BIP
5’ -GGCACTTTCCAGAGCCTTCGTTTTTAGATTCCGAAAGTAGCGGC。
所述反应引物是根据海参腐皮综合症致病病原(灿烂弧菌)基因保守区序列按照 LAMP的要求设计的，引物设计的软件为PrimerExplore 4. 0。
海参腐皮综合症致病病原(灿烂弧菌)的核酸DNA质粒标准液的制备方法是在 PCR反应后，用PCR产物胶回收试剂盒回收相关片段，然后将相关片段连接到质粒载体上， 转入大肠杆菌E. coli中，经氨苄培养基平板扩大培养，挑去阳性克隆并进行测序验证，提 取阳性克隆的质粒并稀释到IO4个拷贝，即可作为阳性对照标准液。
10.高22mm的泡沫板，其大小与试剂盒的底面大小相同，有四行、六列孔，孔径应 与上述试剂管管径匹配；
11.试剂盒使用说明书1份。
本发明实施例的检测方法是
使用本发明的检测试剂盒，按下列步骤进行
a.分别取海参个体(小白点、小型苗种)或成参口器或肛门样品0.08 0. 12克， 置于编号为I、II、III、IV、V的5个样品采集管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；
b.分别用牙签蘸取蘸取不同编号样品采集管中的浆状海参样品，再置入对应编号 分别为I、II、III、IV、V的采样管中并将膜片润湿；
c.用吸管吸取无水乙醇2 3滴，分别滴于编号为I、II、III、IV、V、(+)、㈠的 样品采样管内，用牙签搅动各管内膜片30秒；
d.用牙签将c步骤所得膜片分别转移到编号I、II、III、IV、V、(+)、(-)的膜片漂 洗管内，将每个膜片漂洗管震荡3 4分钟；
e.将每个漂洗管内的膜片分别转移到编号为I、II、III、IV、V、(+)、(-)的核酸变 性管内，95°C保温4分钟，然后再迅速置于冷水或室温条件下2分钟；
f.再将上述核酸变性管内的膜片转移到编号为I、II、III、IV、V、(+)、
(-)的扩增检测管内，将扩增检测管置于61 63°C保温60分钟；85 90°C条件 下保温5分钟，可以用水浴锅、金属浴、关闭热盖功能的PCR仪保温；然后迅速将扩增检测管 上下反复甩动1分钟，使反应液与管盖上的核酸染料充分混勻；
g.用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的反应液集聚于扩增检测管底 部，用眼睛观察、对比扩增检测管底部反应液颜色。
检测结果判别标准
阳性对照显示为绿色，阴性对照显示为橙黄色，否则应判定实验结果无效。
样品检测结果的判断应比对阳性对照和阴性对照进行；如果样品的反应液显示绿 色则表示该样品的海参腐皮综合症检测判定结果为阳性；如果样品的反应液显示橙黄色则 表示该样品的海参腐皮综合症检测判定结果为阴性。
说明
1.阳性对照显示的绿色强弱代表了导致海参腐皮综合症灿烂弧菌的多少，绿色越 强说明样品携带导致海参腐皮综合症的病原菌的量越多。
2.在试剂盒顶盖内侧可贴上用来对比的图片，请参照使用；图片中加号“++++”、 “+++”、“++”、“ + ”表示阳性的强弱，加号越多表示样品携带导致海参腐皮综合症的病原菌含量越多。
本试剂盒及检测方法所使用的试剂和材料石蜡、聚乙二醇均购自大连聚龙公 司FTA卡购自英国whatman公司；Bst DNA聚合酶、Betaine购自NEB公司；核酸染料 GeneFinder 购自厦门百维信生物科技有限公司；MgSO4和dNTP购自大连宝生物公司，同时 上述试剂盒的反应引物也由大连宝生物公司合成。
权利要求
1.一种现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法，其特征在于依次按如下步骤进行a.分别取海参样品0.08 0. 12克，置于多个不同编号的样品采集管中，将样品磨碎至 浆状；b.分别蘸取不同编号样品采集管中的浆状海参样品，再置入对应编号且内装膜片的采 样管中并将膜片润湿；c.分别吸取无水乙醇2 3滴，滴于不同编号的采样管内及内装有膜片的阳性对照管 和内装有膜片的阴性对照管中，搅动各管内膜片30秒；d.将c步骤所得膜片分别转移到对应编号且内装高纯水的膜片漂洗管内，将膜片漂洗 管震荡3 4分钟；e.将漂洗管内的膜片分别转移到相应编号且内装有TE缓冲液的核酸变性管内，95°C 保温4分钟，然后再迅速置于冷水或室温条件下2分钟；f.再将上述核酸变性管内的膜片转移到相应编号的扩增检测管内，将扩增检测管置于 61 63°C保温60分钟；85 90°C条件下保温5分钟，然后迅速将扩增检测管上下反复甩 动1分钟；所述扩增检测管内装有扩增反应液，扩增反应液组成成分如下反应引物VS-F3 和 VS-B3 各 0. 2ymol/L，VS-FIP 和 VS-BIP 各 1. 6ymol/L，pH8. 8 的 TrisHCl 20mmol/L,KCl 10mmol/L, MgS046mmol/L, (NH4)2S041 Ommol/L, Triton X—1000. 1 %, Betainel. 6mol/L, dNTP 1.6mmol/L,8U Bst DNA聚合酶；所述扩增检测管盖内由石蜡和聚乙二醇的混合物将0. 1 μ 1 核酸染料固定在管盖的上方；编号为阳性对照管的扩增检测管内的扩增反应液中还含有海 参腐皮综合症致病病原的核酸DNA质粒标准液10_4个拷贝；所述反应引物的DNA序列如下VS-F3 :5’ -TGGTCCCCCCATATTCAGAC ；VS-B3 :5’ -AAGTACCCCGAGGAAGAGAAVS-FIP :5’ -GCCCCGTAACCGACACATCATTTTAGGATATCACGTGTCCCGC ；VS-BIP 5' -GGCACTTTCCAGAGCCTTCGTTTTTAGATTCCGAAAGTAGCGGC ；g.用力向下甩动扩增检测管，目测、对比扩增检测管底部反应液颜色。
2.一种如权利要求1所述现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法用试剂盒，其特征 在于有多个不同编号内装剪裁成小片的FTA卡膜片的采样管；有1管内装无水乙醇的试液管；有多个不同编号内装高纯水的膜片漂洗管；有多个不同编号内装TE缓冲液的核酸变性管；有多个不同编号内装扩增反应液的扩增检测管，所述扩增反应液组成成分如下 反应引物 VS-F3 禾口 VS-B3 各 0. 2 μ mol/L, VS-FIP 禾口 VS-BIP 各 1. 6 μ mol/L, pH8. 8 的 TrisHCl 20mmol/L, KCllOmmo 1/L, MgS046mmol/L, (NH4)2S041 Ommol/L, Triton X-1000. 1%, Betainel. 6mol/L, dNTP 1. 6mmol/L,8U Bst DNA聚合酶；所述扩增检测管盖内由石赌和聚 乙二醇的混合物将0. 1 μ 1核酸染料固定在管盖的上方；编号为阳性对照管的扩增检测管 内的反应液中还含有海参腐皮综合症致病病原的核酸DNA质粒标准液10_4个拷贝；所述反 应引物的DNA序列如下VS-F3 :5’ -TGGTCCCCCCATATTCAGAC ；VS-B3 :5’ -AAGTACCCCGAGGAAGAGAA ；VS-FIP :5’ -GCCCCGTAACCGACACATCATTTTAGGATATCACGTGTCCCGC ； VS-BIP ·5 ‘ -GGCACTTTCCAGAGCCTTCGTTTTTAGATTCCGAAAGTAGCGGC。
全文摘要
本发明公开一种现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法及试剂盒，是利用LAMP方法，针对灿烂弧菌设计了两对引物、具体的操作步骤及试剂盒，反应引物的DNA序列如下VS-F35’-TGGTCCCCCCATATTCAGAC；VS-B35’-AAGTACCCCGAGGAAGAGAA；VS-FIP5’-GCCCCGTAACCGACACATCATTTTAGGATATCACGTGTCCCGC；VS-BIP5’-GGCACTTTCCAGAGCCTTCGTTTTTAGATTCCGAAAGTAGCGGC。不需要昂贵的仪器设备和很长的检测时间，即使在病原极少的情况下也能够检测出来，具有操作简便、成本低廉、检测准确等优点，可以做到实时监控，及时发现疫情，减少疫病的发病趋势，早期预防病原蔓延，避免给养殖户带来更大的损失。
文档编号C12Q1/68GK102031302SQ201010501690
公开日2011年4月27日 申请日期2010年10月11日 优先权日2010年10月11日
发明者丁勇, 刘彤, 宋晓阳, 李勃, 王洪军, 郝佳, 陈文博 申请人:大连市水产技术推广总站