用于核苷合成的热稳定生物催化剂结合物的制作方法

专利名称：用于核苷合成的热稳定生物催化剂结合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。
背景技术：
(脱氧)核苷是由结合于核糖或脱氧核糖的碱基如嘌呤或嘧啶组成的糖基胺，核糖或脱氧核糖是环状戊糖。它们的实例包括胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷。核苷类似物被广泛用作抗病毒剂和抗癌剂，因为它们在RNA或DNA合成中能够用作反转录酶抑制剂或链终止剂[I]。化学合成核苷类似物已经被立体选择性地实现，但要使用昂贵或污染试剂[2]并涉及可能费时的多阶段过程。生物催化步骤很好地替代了核苷的化学合成，原因是生物催 化反应具有区域选择性和立体选择性，并且可使得降低副产物的含量。特别关注的生物催化步骤是借助催化一般可逆反应的酶在供糖核苷和受体碱基之间的酶促转糖基作用[3]，如图I和2中所述。核苷磷酸化酶是广泛分布于哺乳动物细胞和细菌中并在核苷代谢补救途径中起关键作用的转移酶。它们具有双重功能。在一方面，它们在无机磷酸盐存在下催化核糖核苷或脱氧核糖核苷的糖苷键的可逆切割，目的是生成碱基和核糖-I-磷酸或脱氧核糖-I-磷酸。应用嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的这些酶促反应显示于图I中。在另一方面，这些酶催化嘌呤或嘧啶碱基和核苷之间的磷酸依赖的戊糖转移，即转糖基反应，以产生具有不同碱基的核苷。图2示出了使用核苷磷酸化酶一锅法合成的实例。当嘧啶和嘌呤核苷磷酸化酶结合使用时，有可能将糖从供体嘧啶核苷转移至嘌呤或嘧啶受体碱基，以及从供体嘌呤核苷转移至嘧啶或嘌呤受体碱基，具体取决于使用的起始材料[4]。因此，不同来源(主要是细菌)的核苷磷酸化酶已经被开发用作酶促合成核苷类似物的工具。在天然情况下，这些酶已经被报道存在于多种微生物株系中，特别是在嗜热细菌(即在45°C和80°C之间的温度下旺盛生长的细菌)，它们在许多工作中已经被用作核苷磷酸化酶的来源，用于通过酶促转糖基作用获得修饰的核苷。然而，虽然在这些研究中目标产物产率非常高，但转糖基作用所需的酶活性的量或比率不是最佳的[5]。它们或者需要相当长的反应时间(多达数日)或者需要增加所使用的细菌生物量，以达到所需的转化深度。另外，当发生转糖基过程时会出现另一个问题大量底物和产物难以溶解，它们中的许多在室温下难溶于水性介质。虽然该问题可能通过使用较高温度解决，但是这需要酶在这些更苛刻的反应条件中足够稳定。古菌是一组单细胞微生物，是二个生命域之一；其他两个是细菌和真核生物。它们以前在细菌分类单位下称为古细菌，但现在被认为是独立的和不同的。古菌域现在分成两个主要的门广古菌门(Euryarchaeota)和泉古菌门(Crenarchaeota)。广古菌门包括产甲烷菌、极度嗜盐菌、嗜热嗜酸菌和少数超嗜热菌的组合。相比之下，泉古菌门仅包括超嗜热菌。超嗜热菌是那些在极度热环境(60°C以上，最适超过80°C)旺盛生长的生物。
Cacciapuoti et al. [6_8]描述了来自超嗜热古菌的两种嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase),其具体地公开了来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的5，-脱氧-5’-甲硫基腺苷磷酸化酶IKSsMTAPII，EC2. 4. 2. 28)和来自强烈炽热球菌(Pyrococcusfuriosus)的嘌呤核苷磷酸化酶(PfPNP)。该强烈炽热球菌酶最初被注释为MTAPII，但是它由于不能切割甲硫基腺苷而被重新命名为PNP。硫磺矿硫化叶菌属于泉古菌门，而强烈炽热球菌属于广古菌门。上文的EC代码是国际生物化学与分子生物学联合会提供的常规的酶命名法，该酶命名法根据酶催化的反应将酶分类。从超嗜热菌表征的大多数酶在接近宿主生物的最适生长温度的温度下有最佳的活性。当将其在嗜温宿主像大肠杆菌(Escherichia coli )中克隆和表达时,超嗜热酶通常保持它们的热特性。有时，所述的酶在远高于宿主生物最适生长温度的温度下有最佳活性。还有时，酶被描述为在比宿主生物最适生长温度低10°C到20°C的温度下有最佳活性 [10-11]。然而，当在嗜温宿主中表达时，硫磺矿硫化叶菌5’-甲硫基腺苷磷酸化酶(一种包含六个亚基间二硫键的六体酶)会形成不正确的二硫键，并且其稳定性和耐热性比天然酶弱[12]。热变形菌纲(Thermoprotei)是泉古菌门中超嗜热的纲。从古菌热变形菌纲(Archaea Thermoprotei class)测序且可获的基因组中，发现仅3条嘌呤-核苷磷酸化酶(EC 2.4. 2. I)的序列和仅3条尿苷磷酸化酶(EC2. 4. 2. 3)的序列。这6个蛋白质已经分别以如下登记号录入UniProtKB/TrEMBL中A1RW90 (AlRW90_THEro)，来自下垂热丝菌(Thermofilum pendens)(菌株 Hrk 5)的假设蛋白质；Q97Y30 (Q97Y30_SULS0),来自硫磺矿硫化叶菌的假设蛋白质；A3DME1 (A3DME1_STAMF)来自的海葡萄嗜热菌(Staphylothermusmarinus)(菌株 ATCC 43588/DSM 3639/F1)的假设蛋白质；Q9YA34 (Q9YA34_AERPE)，来自敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)的假设蛋白质；A2BJ06 (A2BJ06_HYPBU),来自丁醇栖高温菌(Hyperthermus butylicus)(菌株 DSM 5456/JCM 9403)的假设蛋白质；以及 D9PZN7(D9PZN7_ACIS3)，来自 Acidilobus saccharovorans(菌株DSM 16705/VKM B-2471/345-15)的假设蛋白质。所有这些序列都处于未经检验的注释状态，这意味着它们在古菌中的存在仅经过计算机验证。即使许多基因可以成功地在大肠杆菌中以高产率表达，来自超嗜热菌的几个蛋白质表达很弱或根本不表达，部分原因是由于稀有密码子的使用。实际上，据我们所知，仍没有人成功表达上述基因的任一个。考虑到以上偏见，考虑到所述技术困难，本发明人意外地能够制备有活力的重组载体，并且重要的是获得了在高于60°C的温度下有最适活性的重组磷酸化酶。本发明的热稳定的和化学稳定的催化剂是嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase，E. C. 2. 4. 2. I)和尿苷磷酸化酶(UPase, E. C. 2. 4. 2. 3)，它们源自古菌热变形菌纲，其中所述PNPase来自硫磺矿硫化叶菌(SEQ ID NO. 7)，所述 UPase 来自敏捷气热菌(SEQ ID NO. 8)。具体而言，意外地发现，源自所述超嗜热的热变形菌纲的重组核苷磷酸化酶具有独特的结构-功能性质，如增加的热稳性、高催化效率以及在温度接近或高于100°c时最适的酶活性。这些重组酶可以以细胞裂解物的形式以及以粗提取物或纯化的提取物的形式有利地用于转糖基反应，用于工业生产天然的和修饰的核苷类似物。它们特别功能多样，因为它们可以在水性介质、有机溶剂、在60°c和120°C之间的温度时或者均具有这些参数的组合时催化转糖基作用，使得可以以可接受的生产率、反应时间，使用经济用量的所述酶制备许多的且不同类型的核苷。重要地，本发明中描述的生物催化剂可以用于需要存在有机溶齐U、高于60°c的温度或两者同时存在的条件下的生物转化反应，目的是溶解所述底物或反应产物。这些磷酸化酶在底物不溶于水的的反应中是理想的。这些磷酸化酶的另一优点在于它们耐受有机溶剂以及在于它们可以重复用于多个反应循环。更有利地，本发明提供了可用于一锅法合成核苷的热变形菌纲核苷磷酸化酶的结合物。所述酶可以在一步骤(一锅)或两步骤合成方法中用于产生天然的核苷或核苷类似物。在一步骤合成中，嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶被用于同一批中，目的是将连接于糖的碱基更换为另一个选择的碱基。在两步骤合成中，嘧啶核苷磷酸化酶被用于释放嘧啶核苷的糖，然后将I-磷酸-糖分离，随后在另一个容器中使用嘌呤核苷磷酸化酶将嘌呤碱基连接到糖。

发明内容
本发明涉及一种重组表达载体，包含a)编码嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase，E. C. 2. 4. 2. I)的序列；b)编码尿苷磷酸化酶(UPase，E. C. 2. 4. 2. 3)的序列；c)或前述两者；所述序列每一个可操作地连接于指导在合适的表达宿主中产生所述磷酸化酶的一个或多个控制序列；所述序列源自于古菌热变形菌纲，其特征在于PNPase来自硫磺矿硫化叶菌(SEQID NO. 7)、UPase 来自敏捷气热菌(SEQ ID NO. 8)。另外，本发明涉及一种在磷酸离子存在下在供糖核苷和受体碱基之间的转糖基方法，特征在于所述方法包括使用敏捷气热菌的尿苷磷酸化酶(UPase)(NCBI 参考序列(National Center for Biotechnology Information ReferenceSequence) :NC_000854. 2)、硫磺矿硫化叶菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase) (NCBIRefSeq:NC_002754. I)或它们的结合物。


图I示出了由核苷磷酸化酶催化的两个酶促反应的实例。上方的第一个反应是通过经氧鎗样中间体的SnI样机制发生的磷酸解，以产生a-核糖-I-磷酸。第二个反应通过其中磷酸被碱基取代的SN2机制发生[13]，从而提供￠-核苷。在该方案中，尿苷核苷磷酸化酶催化尿苷的C-N糖苷键的磷酸解切割，形成核糖-I-磷酸和尿嘧啶。在无机正磷酸盐(Pi)作为第二底物存在时，嘌呤核苷磷酸化酶(腺苷核苷磷酸化酶)催化切割糖苷键，以生成嘌呤碱基和核糖(脱氧核糖)-1_磷酸。对于天然底物，该反应是可逆的。图2.使用核苷磷酸化酶进行一锅法合成的方案。图3示出克隆之前起始表达载体pt:_no2/i.)-_rop(:)K的遗传学图谱。载体长度为6315核苷酸。17启动子碱基209-225 ;!7启动子引发位点碱基209-228 ;1迎操纵基因(IacO):碱基228-252 ;核糖体结合位点(RBS):碱基282-288 ;His_补片(His-patch，HP)硫氧还蛋白ORF :碱基298-627 ；TrxFus正向引发位点碱基607-624 ；EK识别位点碱基643-657 ;TOPO*识别位点I :碱基670-674 ;悬突碱基675-678 ;TOPOWW别位点2 :碱基679-683 ;V5表位碱基700-741 ;多组氨酸(6XHis)区碱基751-768 ；T7反向引发位点碱基822-841 ;!7转录终止区碱基783-911 启动子碱基1407-1505 ;氨苄西林(bla)抗性基因(ORF):碱基 1506-2366 ；pBR322 起始位点碱基 2511-3184 ；R0P ORF :碱基3552-3743 (互补链)lacl ORF :碱基 5055-6146 (互补链)。图4示出了 5个温度与3个pH值组合的“Doehlert矩阵”，形成温度和pH的7个组合。图5.显示pH和温度对UPase活性的交互效应的等高线图。使用“Minitab”软件，将数据以响应面方法(Response Surface Methodology) (RSM)进行统计分析。该酶表现出高嗜热的；其活性增加迅速直至最高测定温度(100°C )，活性在pH中性附近(6. 5-7. 5)，优选7.0，呈现明显的pH最适。图6.显示pH和温度对PNPase活性的交互效应的等高线图。使用“Minitab”软件，将数据以响应面方法(Response Surface Methodology)(RSM)进行统计分析。该酶表现出高嗜热的；其活性增加迅速直至最高测定温度(100°C)，所述活性在pH中性附近(6. 5-7. 0) 呈现明显的pH最适。图7示出了硫磺矿硫化叶菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的编码区的DNA序列(SEQ ID NO. 7)，又称 deoD 基因。GenBank 登记号 AE006766。图8示出了敏捷气热菌的嘧啶核苷磷酸化酶(UPase)的编码区的DNA序列(SEQ IDNO. 8)，又称 udp 基因。GenBank 登记号 NC000854。
具体实施例方式本发明涉及包含如下序列的重组表达载体a)编码嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase, E. C. 2. 4. 2. I)的序列；b)编码尿苷磷酸化酶(UPase, E. C. 2. 4. 2. 3)的序列；c)或前述两者；所述序列每一个可操作地连接于指导在合适的表达宿主中产生所述磷酸化酶的一个或多个控制序列；所述序列源自于古菌热变形菌纲，其特征在于PNPase来自硫磺矿硫化叶菌(SEQ ID NO. 7)，UPase来自敏捷气热菌(SEQ ID NO. 8)。敏捷气热菌和硫磺矿硫化叶菌是能够在高温(超过90°C )下生长的超嗜热菌古菌。古菌是属于不同于真核生物和原核生物的第三类生物。它们被认为源于原始生物，是既未进化又不适应常温环境的特殊生物。在它们的细胞内天然环境中的UPase和PNPase不能以产业水平所需的高产率合成核苷或核苷类似物。为了克服该严重局限，发明人使用重组DNA技术设计了包含udp和deoD基因以及合适元件的表达载体，以在选择的宿主如细菌中过表达核苷磷酸化酶。所设计的表达载体还有利于不同磷酸化酶的溶解和纯化。本发明的载体包含编码不同核苷磷酸化酶的核苷酸序列和使得所述载体在所述宿主细胞中有选择性且可自主复制的核苷酸序列。所述重组表达载体的构建是使用常规重组DNA技术进行的，即在无细胞系统中将DNA区段连接起来的操作。术语“载体”是指另一合适大小的DNA片段可以整合(克隆)到其中而不失去载体的自我复制能力的源自病毒、质粒或闻等生物的细胞的DNA分子。实例有质粒、粘粒和酵母人工染色体。载体通常是包含多种来源的DNA序列的重组体分子。术语“表达载体”是指进一步包含所需控制或调节序列以使得可转录和翻译所克隆的一个或多个基因的载体。环状或线性DNA载体可用于本发明。
为了使本发明的载体在宿主细胞中有选择性且可自主复制，所选择的载体必需和所选择的宿主细胞相容。在优选的实施方案中，使得所述载体在大肠杆菌中有选择性且可自主复制的核苷酸序列是使得所选择的大肠杆菌菌株的T7 RNA聚合酶结合于启动子的T7启动子编码基因。术语“选择性的”是指载体在后代细菌中保持稳定。所述的选择是根据在所述载体中引入合适的选择性标记物基因通过严格的介质条件实现的，其中所述基因的表达使得可以鉴定出已经以所述载体转化的细胞。所述选择性标记物基因通常是抗生素抗性基因。用于本发明的优选的选择性标记物基因有卡那霉素、四环素、羧苄西林和更优选的氨节西林。本发明还涉及包含上述任一种重组表达载体或在同一宿主细胞中含有两种重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”是指以包含PNPase或UPase核苷酸序列的重组表达载体转化的 细胞。所述重组DNA载体的另一方面使得所述宿主细胞产生核苷磷酸化酶，并且当培养基条件合适时，所述核苷磷酸化酶催化核苷的获得。在本发明的具体实施方案中，将分别来自硫磺矿硫化叶菌和敏捷气热菌的PNPase和UPase基因引入所述DNA表达载体中。图7和图8列出了本发明相关的核酸和氨基酸序列，分别是硫磺矿硫化叶菌deoD的核酸序列(SEQID NO. 7)和敏捷气热菌udp的核酸序列(SEQ ID NO. 8)。本领域技术人员会适当地选择由初始载体和宿主细胞株构成的表达体系来使核苷的产生最大化。在一个实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。在一个具体实施方案中，所述大肠杆菌属于BL21细菌菌株。用于大肠杆菌BL21的合适表达载体有例如pET载体、trcHis载体和pUB载体(它们都获自Invitrogen)；以及PGEX载体和GST载体(获自Amersham)。大肠杆菌DH5 a细菌菌株与pUC载体的结合以及大肠杆菌F’与PSL载体、PEZZ载体或M13载体的结合(它们都获自Amersham)也可用于本发明中。在一个实施方案中，所述宿主细胞被处理或者为裂解物的形式。本发明还涉及一种在磷酸离子存在下在供糖核苷和受体碱基之间的转糖基方法，其特征在于所述方法包括使用敏捷气热菌的尿苷磷酸化酶(UPase)(NC_000854. 2)、硫磺矿硫化叶菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase) (NC_002754. I)或它们的结合物。术语“供糖核苷”是指由经P -糖苷键结合于核糖或脱氧核糖的核碱基(通常简称为碱基)组成的糖胺。“供糖核苷”的实例包括但不限于胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷，以及那些含D-核糖或2’ -脱氧核糖的天然核苷或修饰核苷；包含2’、3’和/或5’位修饰的核糖基团的核苷；和其中糖是P-D-阿拉伯糖、a-L-木糖、3’ _脱氧核糖、3’，5’ -双脱氧核糖、2’，3’ -双脱氧核糖、5’ -脱氧核糖、2’，5’ -双脱氧核糖、2’ -氨基-2’ -脱氧核糖、3’ -氨基-3’ -脱氧核糖或2’ -氟-2’ -脱氧核糖的核苷。术语“受体碱基”是指核碱基、核苷酸碱基、含氮碱基或简称为碱基。在自然界，碱基是DNA或RNA的一部分。主要的核碱基有胞嘧啶(DNA和RNA)、鸟嘌呤(DNA和RNA)、腺嘌呤(DNA和RNA)、胸腺嘧啶(DNA)和尿嘧啶(RNA)，分别简写为C、G、A、T和U。在本发明中，术语“受体碱基”意欲还包括修饰核碱基和核碱基类似物。在DNA中，最常见的修饰碱基是5-甲基胞苷(m5C)。在RNA中，有许多修饰碱基，包括假尿苷(屯)、二氢尿苷(D)、肌苷(I)、核糖胸苷(rT)和7-甲基鸟苷(m7G)。次黄嘌呤和黄嘌呤是通过存在的诱变剂形成的许多碱基中的两种碱基。受体碱基的其他实例包括天然或取代嘧啶和嘌呤碱基；在1、2和6位中有一个或多个被取代的嘌呤碱基；在3和5位中有一个或多个被取代的嘧啶碱基；以及嘌呤、2-氮杂嘌呤、8-氮杂嘌呤、I-脱氮嘌呤(咪唑并吡啶)、3-脱氮嘌呤、7-脱氮嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、5-氟尿喃卩定、5- 二氟甲基尿喃唳、反式玉米素、2-氯-6-甲氨基嘌呤、6- 二甲氨基嘌呤、6-巯基嘌呤。该转糖基方法可用于制备核苷、核苷类似物以及特别是活性药物成分(API);包括或包含核苷部分或其类似物或者由核苷部分或其类似物组成。将API理解为意欲用于制造药物(医药)产品的任何物质或物质混合物，以及在其用于产生药物时其成为药物产品的活性成分。这类物质意欲提供药理学活性或者在诊断、治愈、减轻、治疗或预防疾病中的其他作用，或者影响身体的结构和功能(Eudralex, Part II of volume 4 EU Guidelines toGood Manufacturing Practice)。尿苷磷酸化酶(UPase, E. C. 2. 4. 2. 3)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP ；E. C. 2. 4. 2. I)的 结合物可将糖部分从供体核苷高效转移至受体碱基。当脱离其他嘧啶核苷，且以嘧啶碱基作为起始材料制备嘧啶核苷时，仅使用UPase就已足够，但优选使用PNPase和UPase两种酶，因为PNPase也可以促成磷酸解步骤。相反地，当脱离其他嘌呤核苷，且以嘌呤碱基作为起始材料制备嘌呤核苷时，也优选使用PNPase和UPase 二者。在另一方面，与单独使用每种类型的酶相比，当反应是从嘧啶生成嘌呤核苷例如从尿苷生成2，6 二氨基嘌呤核糖核苷时，使用PNPase和UPase两种酶成功得多。转糖基方法优选使用UPase和PNPase的结合物。可以将粗细胞裂解物或澄清的粗酶溶液以不同比例混合，以得到优化的生物催化剂用于具体的转糖基反应。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，敏捷气热菌的UPase和硫磺矿硫化叶菌的PNPase由上文和下文描述的任一实施方案的宿主细胞提供。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，UPase、PNPase或其结合物以裂解物的形式使用。在一个实施方案中，所述转糖基方法包括步骤(i)在合适的培养基中培养宿主细胞；(ii)过表达UPaSe、PNPaSe或其二者；(iii )任选地制备细胞裂解物；(iv)加入供糖核苷、受体碱基和磷酸离子；以及(V)从所述反应混合物回收核苷。在具体的实施方案中，可以将包含所述载体的大肠杆菌转化体培养于含有胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠和选自卡那霉素、四环素、羧苄西林和氨苄西林的抗生素的培养基中——优选在37°C下培养——至其在波长约600nm下的光密度值为0. 5-0. 8。然后，可以向所述培养基加入异丙基-P -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至终浓度100mg/l，并可以在37°C下诱导6-12小时。可以通过在4°C下离心收获细胞，并可以将细胞片状沉淀物通过三次冻融循环裂解。可以通过本领域技术人员公知的标准技术破坏重组宿主细胞。所产生的细胞裂解物可直接用作生物催化剂，或者通过离心除去细胞碎片以得到澄清的粗酶溶液。本文使用的术语“生物催化剂”是指能够催化底物转化成产物(在本文的情况下是核苷生物转化)的任何生物实体。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所述供糖核苷选自包含D-核糖和2’ -脱氧核糖的天然核苷或修饰核苷；包含2’、3’和/或5’位修饰的核糖基团的核苷；以及其中糖是0 _D_阿拉伯糖、a -L-木糖、3’ -脱氧核糖、3’, 5’ -双脱氧核糖、2’, 3’ -双脱氧核糖、5’ -脱氧核糖、2’，5’ -双脱氧核糖、2’ -氨基-2’ -脱氧核糖、3’ -氨基-3’ -脱氧核糖、2’ _氟-2’ -脱氧核糖的核苷。 在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所述受体碱基选自天然嘧啶和嘌呤碱基或者取代的嘧啶和嘌呤碱基；在1、2、6位被取代的嘌呤碱基或所述嘌呤环的其结合物；在3、5位被取代的嘧啶碱基或所述嘧啶环的其结合物；例如嘌呤、2-氮杂嘌呤、8-氮杂嘌呤、I-脱氮嘌呤(咪唑并吡啶)、3_脱氮嘌呤、7-脱氮嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、反式玉米素、2-氯-6-甲氨基嘌呤、6-二甲氨基嘌呤、6-巯基嘌呤。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所产生的核苷类似物是本领域中所知的活性药物成分(API)。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所述方法在60°C和100°C之间进行。
在一个实施方案中，本发明的转糖基方法在水性介质中进行，或者在非质子极性共溶剂体系中进行。在一个实施方案中，所述非质子极性共溶剂体系选自二甲基亚砜、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二甲基甲酰胺或它们的任意结合物。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所述供糖核苷选自尿苷和2’ -脱氧尿苷，所述受体碱基是2，6- 二氨基嘌呤。在一个实施方案中，本发明提供了使用尿苷或2’ -脱氧尿苷作为糖部分供体的一锅法酶促合成核苷的方法，因为本发明的重组UPase酶对于这些底物是最特异的。然而，该酶可以与糖部分的任何供体一起使用，因为它不区分尿苷、2’ -脱氧尿苷以及其他嘧啶核苷，很遗憾，这与许多低等生物例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophiIus)中的情况一样[14]。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所述供糖核苷选自尿苷和2’ -脱氧尿苷，所述受体碱基是5-氟尿嘧啶。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所述供糖核苷选自尿苷和2’ -脱氧尿苷，所述受体碱基是5-三氟甲基尿嘧啶。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所述供糖核苷选自尿苷和2’ -脱氧尿苷，所述受体碱基是反式玉米素。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所述供糖核苷选自尿苷和2’ -脱氧尿苷，所述受体碱基是2-氯-6-甲氨基嘌呤。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所述供糖核苷选自尿苷和2’ -脱氧尿苷，所述受体碱基是6- 二甲氨基嘌呤。在一个实施方案中，在本发明的转糖基方法中，所述供糖核苷选自尿苷和2’ -脱氧尿苷，所述受体碱基是6-巯基嘌呤。术语“热稳定的核苷磷酸化酶”是指对热稳定、耐热，并且其在发生转糖基反应所需的时间内处于升高的温度时能够保持足够的核苷磷酸化酶活性从而使得能发生其他反应，而且不会发生不可逆的变性(失活)。如下给出的实施例的目的是为了对本发明进行举例说明，其不构成对本申请范围的限制。实施例如上文所述，使用从产UPase或产PNPase的细胞中得到的UPase和PNPase酶进行本发明的转糖基反应。这类细胞优选是能够表达大量UPase或PNPase的遗传修饰的大肠杆菌细胞。获得这类细胞、酶和它们的特征的方法，以及生产一些核苷类似物的方法在随附的如下所述的实施例中给出。实施例I 构建大肠杆菌deoD硫磺矿硫化叶菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)序列见于GenBank,登记号为AE006766。将该基因使用PCR从硫磺矿硫化叶菌P2扩增，使用2单位的Platinum Pfx酶(Invitrogen)UmM MgSOjPlX酶扩增缓冲液、200uM dNTP和0. 3 y M每种引物，引物寡核苷酸为 5，-caccgtgccatttttagaaaatggttcc-3’(硫磺矿硫化叶菌 deoD 正向；SEQ IDNO. I)和 5’-aatcagttttaagaatcttaaggtaat_3’(硫横矿硫化叶菌 deoD 反向；SEQ ID NO. 2)。按如下进行PCR反应初始变性步骤在94°C下30分钟，然后36个温度循环——在94°C下I分钟的变性步骤以及在60°C下I. 5分钟和在68°C下I分钟的退火/延伸步骤。在所述36个循环后，使所述样品处于68°C下10分钟，最后处于4°C。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并从所述凝胶纯化DNA条带(S.N.A.P. UV-Free Gel PurificationKit, Invitrogen)。将所扩增的片段克隆至携带氨节西林抗性基因的pUC18载体的多位点接头区[17]。将克隆的区域完全测序，发现它与数据库序列完全相同。实施例2构建大肠杆菌udp敏捷气热菌的嘧啶核苷磷酸化酶(UPase )序列见于GenBank，登记号为NC_000854. 2。将该基因通过PCR从敏捷气热菌Kl扩增，使用2单位的Platinum Pfx酶(Invitrogen)、ImM MgSOjPlX酶扩增缓冲液、200 y M dNTP和0. 3 y M每种引物，引物寡核苷酸为 5’-caccgtggcccgctacgttctcctc-3’(敏捷气热菌 udp 正向；SEQ ID NO. 3)和 5，-gaattcctatgtgcgtctgcacgccagg-3’(敏捷气热菌反向；SEQ ID NO. 4)[16] 按如下进行 PCR反应初始变性步骤在94°C下30分钟，然后36个温度循环——940C I分钟的变性步骤以及60°C I. 5分钟和68°C I分钟的退火/延伸步骤。在所述36个循环后，使所述样品处于68°C下10分钟，最后处于4°C。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并从所述凝胶纯化DNA条带(S. N. A. P. UV-Free Gel Purification Kit, Invitrogen)。将所扩增的片段克隆至携带氨苄西林抗性基因的PUC18载体的多位点接头区[17]。将克隆的区域完全测序，发现它与数据库序列完全相同。实施例3克降至nF/n ()2/r)-TO丨载体和细朐转化将包含敏捷气热菌udp基因序列和硫磺矿硫化叶菌deoD基因序列的DNA片段克隆至包含用于质粒复制的pBR322ori、氨苄西林抗性基因、允许I7RNA聚合酶结合的17启动子、当不存在异丙基硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)时抑制表达的乳糖(Iac)操纵基因、用于RNA翻译的核糖体结合位点、用于增加融合蛋白溶解性的His-补片-硫氧还蛋白以及用于检测和纯化融合蛋白的多组氨酸标签(6XHis)的pia'丨02/l_>-'r0丨载体(PET102Directional TOPO Expression Kit, Invitrogen)(图 3)。将所述载体通过热激弓I入大肠杆菌 BL21(pET102 Directional 'TOPO'"' Expression Kit, Invitrogen),该菌株为用于异源基因受控表达的商业菌株。它包含编码I7RNA聚合酶的基因，该聚合酶使所述菌株能够与含17启动子的pET载体的应用相容用于在有IPTG存在时过表达重组蛋白。将所产生的重组载体通过以10个单位的酶HindIII进行的DNA限制性酶切进行分析。将阳性克隆使用TrxFus正向测序引物5 ’TTCCTCGACGCTAACCTG3’ (SEQ ID NO. 5)和 T7 反向测序引物 5 ’ TAGITATTGCTCAGGGGTGG3’ (SEQ ID NO. 6)进行测序。实施例4发酵所述重组体菌株将本发明涉及的重组菌株在添加有氨苄西林的胰蛋白酶解酪蛋白大豆固体培养基中在pH=7下以分批模式分开培养。将一个培养物的菌落转入添加有200mg/l氨苄西林的包含Lab-Iemco粉末10g/l、蛋白胨10g/l和NaCl 5g/l的营养肉汤n° 2 (Oxoid)中。将 其在37°C下剧烈摇晃(200rpm)孵育。将携带表达质粒的大肠杆菌菌株培养至600nm下的光密度值为0. 6，然后加入IPTG(最多100mg/l)并继续再培养8小时。当发酵完成后，将所述培养基离心，将细胞沉淀物在30mM-pH 7磷酸盐缓冲液中洗涤。将所得到的菌体在-20° C下保存直至使用。实施例5部分UPase和PNPase纯化(细胞裂解物制备)为了部分纯化所述蛋白，将通过离心或微孔过滤从表达酶UPase或PNPase的重组体菌株培养物分离的细胞糊状物通过以下方式破坏加入160mg溶菌酶并在0°C下孵育I小时，然后是3个超快速冻融循环(_80°C /37°C)和加入1，000单位脱氧核糖核酸酶I降低粘度的最后步骤。实施例6UPase酶的酶活件测定将100微升离心细胞裂解物——其包含UPase表达细胞的悬浮物，且以1:100 (体积/体积)的比例用PH 7. 0的磷酸钾缓冲液稀释——加入到800微升在30°C预孵育的溶解于IOOmM的pH 7.0的磷酸盐缓冲液中的75mM尿苷溶液中。5分钟后，通过加入Iml的2N HCl终止所述磷酸解反应。将反应混合物的一个等分部分使用尺寸为250X4. 6mm的Kromasil100-5C18 (Akzo Nobel)柱进行高效液相色谱(HPLC)分析。使用4%的甲醇-水溶液进行洗脱。所述细胞裂解物的酶活性表示为每ml的单位数(微摩尔尿喃唳XmirT1 Xmr1),相对于相同条件下洗脱的标准尿嘧啶溶液进行计算。回收了大约590个单位/ml的离心的细胞裂解物。实施例7PNPase酶的酶活件测定将100微升离心细胞裂解物——其含有PNPase表达细胞悬液并以1:100的比例(体积/体积)稀释于PH 7. 0的磷酸钾缓冲液中——加入到800微升在30°C预孵育的溶解于IOOmM的pH 7. 0的磷酸盐缓冲液中的60mM肌苷溶液中。精确的10分钟后，通过加入Iml的2N HCl停止所述磷酸解反应。将所述反应混合物中的一个等分部分使用尺寸为250X4. 6mm 的 Kromasil 100-5C18 (Akzo Nobel)柱进行高效液相色谱(HPLC)分析。使用4%的甲醇-水溶液进行洗脱。所述细胞裂解物的酶活性表示为每ml的单位数(微摩尔次黄嘌呤XmirT1Xmr1),相对于相同条件下洗脱的标准次黄嘌呤溶液进行计算。回收了大约310个单位/ml的离心的细胞裂解物。实施例8转糖基催化活性的测定为了测定转糖基催化活性，将包含UPase和PNPase的细胞裂解物的混合物通过如下方式制备混合所述裂解物以获得约I: I的UPase: PNPase酶活性比，按实施例6和7中所述方法进行测定。转糖基反应在如下条件中以分析级(analytical scale)进行将250 yl细胞裂解物(等于14个单位的每种UPase和PNPase酶活性)加入到IOml具有如下组分的溶液中4mM 1-3_0-呋喃核糖基尿嘧啶(尿苷核苷)、41111腺嘌呤碱基、301111^ 7的磷酸钾缓冲液，恒温控制在60°C。在60V反应I. 5小时后，通过以1:5稀释所述混合物并在冰上冷却终止所述反应。腺嘌呤碱基生物转化成9- ^ -D-呋喃核糖基腺嘌呤(腺苷核苷)的百分数通过如下方式确定使用尺寸为250X4. 6mm的Kromasil 100-5C18 (Akzo Nobel)柱 对所述反应混合物的一个等分部分进行高效液相色谱(HPLC)分析，以4%的甲醇-水溶液进行洗脱。转糖基催化活性表示为每ml的单位数(每ml细胞裂解物混合物I. 5小时形成的Ara-A微摩尔数)或者表示为每g湿的树脂的单位数(每ml细胞裂解物I. 5小时形成的D-呋喃核糖基腺嘌呤的微摩尔数)，相对于相同条件下通过HPLC洗脱的标准D-呋喃核糖基腺嘌呤溶液进行计算。在这些条件下，形成了大约55%的腺苷核苷(每ml细胞裂解物大约9个单位)。实施例9温度和pH对所述核苷磷酸化酶活性的影响pH和温度对核苷磷酸化酶的性能的影响通过使用“实验设计法”进行研究。将不同的温度与不同PH值组合以探明产生最大酶活性的条件。实验区域被确定为80°C -IOO0C和pH 5. 5-8. 5o如图4中所示，根据“Doehlert矩阵”，将5个温度与3个pH值组合，形成7个温度和pH的组合。将底物在选择的反应溶液和温度下在无酶条件下孵育，然后加入酶并在选择的条件下孵育。如上述方法处理所述样品，用于测定PNPase或UPase酶的酶活性。将活性值表示为出现的相应最大值(100%)的百分数。结果分别显示于图5和6中。实施例10热稳定件在80°C下测定所述酶的热稳定性。制备所述酶的等分试样，100微升至200微升的UPase或/和PNPase表达细胞(细胞裂解物)悬液在pH7. 0-7. 2的磷酸钾缓冲液中以1:100或1:1000的体积/体积比例稀释。将所述生物催化剂在80°C下孵育不同时间。加热后，立即将所述溶液保持在冰上，如实施例6和7中所述方法测量所述的核苷磷酸化酶活性。在80°C下10小时后未观察到核苷磷酸化酶活性损失。溶剂对核苷磷酸化酶活性的影响有机共溶剂常用于反应中，分离的酶必须能够在相对高浓度的共溶剂的条件下有活性。在存在有机溶剂例如甲醇(质子极性溶剂)和二甲基亚砜(非质子极性溶剂)的条件下进行了实验。本发明的核苷磷酸化酶酶耐受有机溶剂，在包含5和10体积％的所述有机溶剂的缓冲液中表现出活性。
表I. PNPase酶对一些有机溶剂的稳定性
权利要求
1.一种重组表达载体，包含a)编码嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase，E. C. 2. 4. 2. I)的序列，b)编码尿苷磷酸化酶(UPase，E. C. 2. 4. 2.3)的序列，c)或者前述两者；所述序列中的每一个可操作地连接于指导在合适的表达宿主中产生所述磷酸化酶的一个或多个控制序列；所述序列源自于古菌热变形菌纲，其特征在于PNPase来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus) (SEQ ID NO. 7), UPase 来自敏捷气热菌(Aeropyrum pernix) (SEQ IDNO. 8)。
2.—种宿主细胞，包含权利要求I的重组表达载体。
3.权利要求2的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
4.权利要求2-3任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是裂解物的形式。
5.一种在存在磷酸离子时在供糖核苷和受体碱基之间的转糖基方法，其特征在于所述方法包括使用敏捷气热菌的尿苷磷酸化酶(UPase)(NC_000854. 2)、硫磺矿硫化叶菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase) (NC_002754. I)或它们的结合物。
6.权利要求5的转糖基方法,其中所述敏捷气热菌的UPase和所述硫磺矿硫化叶菌的PNPase由权利要求2_4任一项的宿主细胞提供。
7.权利要求5-6任一项的转糖基方法，其中所得到的产物是活性药物成分(API)或其中间体。
8.权利要求5-7任一项的转糖基方法，其中所述供糖核苷选自包含D-核糖或2’-脱氧核糖的天然的核苷或修饰的核苷；包含2’、3’和/或5’位修饰的核糖基团的核苷；以及其中糖是β -D-阿拉伯糖、a -L-木糖、3’ -脱氧核糖、3’ , 5’ -双脱氧核糖、2’ , 3’ -双脱氧核糖、5’ -脱氧核糖、2’，5’ -双脱氧核糖、2’ -氨基-2’ -脱氧核糖、3’ -氨基-3’ -脱氧核糖，或者2’ -氟-2’ -脱氧核糖的核苷。
9.权利要求5-8任一项的转糖基方法，其中所述受体碱基选自天然的或取代的嘧啶和嘌呤碱基；在1、2和6位中有一个或多个被取代的嘌呤碱基；在3和5位中有一个或多个被取代的嘧啶碱基；以及嘌呤、2-氮杂嘌呤、8-氮杂嘌呤、I-脱氮嘌呤(咪唑并吡啶)、3_脱氮嘌呤、7-脱氮嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、反式玉米素、2-氯-6-甲氨基嘌呤、6- 二甲氨基嘌呤、6-巯基嘌呤。
10.权利要求5-9任一项的转糖基方法，其中所述方法在60°C和100°C之间进行。
11.权利要求5-10任一项的转糖基方法，其中所述方法在水性介质或者在非质子极性共溶剂体系中进行。
12.权利要求11的转糖基方法，其中所述非质子极性共溶剂体系选自二甲基亚砜、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃和二甲基甲酰胺。
13.权利要求5-12任一项的转糖基方法，其中所述供糖核苷选自尿苷和2’-脱氧尿苷，所述受体碱基选自2，6- 二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、反式玉米素、2-氯-6-甲氨基嘌呤、6- 二甲氨基嘌呤和6-巯基嘌呤。
全文摘要
本发明涉及一种重组表达载体，包含a)编码嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase,E.C.2.4.2.1)的序列，b)编码尿苷磷酸化酶(UPase,E.C.2.4.2.3)的序列，c)或者前述两者；所述序列中的每一个可操作地连接于指导在合适的表达宿主中产生所述磷酸化酶的一个或多个控制序列；所述序列源自于古菌热变形菌纲，其特征在于PNPase来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)(SEQ ID NO.7)，UPase来自敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)(SEQ ID NO.8)。另外，本发明涉及一种在存在磷酸离子下在供糖核苷和受体碱基之间的转糖基方法，特征在于所述方法包括使用敏捷气热菌的尿苷磷酸化酶(UPase)(NC_000854.2)、硫磺矿硫化叶菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)(NC_002754.1)或它们的结合物。
文档编号C12N9/10GK102770532SQ201080064567
公开日2012年11月7日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者C·埃斯特韦斯康帕尼, C·洛佩兹戈麦兹, J·卡斯泰尔斯波利亚特, M·帕斯卡尔吉拉波特, R·蒙蒂利亚阿雷瓦洛, V·M·德隆赛勒托马斯 申请人:普拉斯米亚生物技术有限公司