兔出血症病毒荧光定量rt-pcr检测方法

文档序号:394597阅读:492来源:国知局
专利名称:兔出血症病毒荧光定量rt-pcr检测方法
技术领域
本发明涉及一种兔出血症病毒的分子检测方法,具体地说,涉及一种兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法,其属于生物技术领域。
背景技术
[ij IfiL^E (Rabbit hemorrhagic disease, RHD) ^ [ii(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的一种高度接触烈性传染病,传播快,发病急,发病率和致死率都很高,以呼吸系统出血、肝坏死、实质脏器水肿、淤血及出血性变化为特征, 是兔的一种毁灭性传染病,目前所有已测的兔的品种都表现出易感性。自然条件下,RHDV主要侵害成年兔,2月龄以下的仔兔自然感染时一般不发病。该病对养兔业造成巨大的经济损失,也严重威胁濒临灭绝的野兔品种。由此,RHDV引起了国内外学者高度重视,从形态学、 生物化学和分子生物学等各个方面系统的研究该病毒。RHDV在国际病毒分类委员会(ICTV) 2000年最新的第七次报告中被列入新成立的杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。RHDV为单股正链RNA病毒,其基因组由7437个核苷酸组成,分子量为2.4X 106-2.6X 106,5’端没有帽状结构,而是共价结合与感染相关的Vpg(virion protein, genome linked)蛋白,3’末端具有一个短的PolyA 尾。第l-9nt为5’非编码区,最后59nt为3’非编码区,含有两个开放阅读框架(ORF),第 10-7044nt为ORFl编码的一个含有2344个氨基酸的多聚蛋白,该多聚蛋白经蛋白水解酶加工成主要衣壳蛋白VP60以及包括RNA聚合酶和蛋白酶在内的三个非结构蛋白。根据分析, 该病毒的RNA基因组结构与同科的猫嵌杯样病毒不一样,仅含有两个开放阅读框。RHDV的免疫原性蛋白、衣壳蛋白VP60,在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用,是病毒免疫保护性抗原。VP60基因全长1740bp,在病毒诱导机体的免疫反应中起主要作用,其核苷酸极端保守。RHDV是一种急性、高度致死性RNA病毒,在兔体内停留时间短,没有足够的时间让病毒发生有利于进化的变异,因此几十年中RHDV仍然能保持高序列同源性。目前,已有将分子生物学应用到RHDV诊断中的研究,其主要包括玻片凝集试验 (SHA)检测RHDV、酶联免疫吸附法(ELISA)检测RHDV、RT-PCR检测RHDV等,但上述这些方法存在敏感性低、可重复性差、结果判定易受多种因素影响、处理耗时多等问题。焚光定量 PCR (fluorescence quantitative polymerase chain reaction),又禾尔实时定量(real-time quantitative) PCR。这种技术是在PCR技术基础上发展起来的高度灵敏的核酸定量技术。它是一种在PCR体系中引入了荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使PCR扩增和终产物检测全处在封闭的条件下进行,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析方法,具有实时监测、无污染、快速、灵敏、精确、特异等特点,极大的克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题,其最主要的优势是能对待测样本起始PCR反应模板进行准确定量,扩大了 PCR的应用范围,使得PCR技术更广泛的应用于临床,在监测患者病情、预后、指导用药等方面。目前已广泛应用于分子生物学研究和医学
3研究等领域。TaqMan探针技术是由美国Perkin Elmer (PE)公司研发的一种实时PCR技术,它在一条20bp左右的寡核苷酸探针的5’端标记荧光报告基团(Itep0rter,R),3’端标记荧光淬灭基团(QuenCher,Q),其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。当这条探针保持完整时,Q和R基团由于距离很近(7-lOnm),Q基团将淬灭R基团发出的荧光信号,即报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收。PCR反应后,随着链的延伸,Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置,发挥其5’ -3’外切核酸酶活性,将荧光探针切断,Q基团由于距离较远而失去对报告荧光的淬灭作用,R基团的荧光信号得以释放而被检测仪所捕获。如果在PCR过程中,探针序列与模板序列不能互补,探针仍然是游离的,未杂交的探针仍然保持完整,荧光信号也就不能被检测到,从而保证了扩增的特异性。常用的荧光报告基团有 FAM、JOE、HEX、Texas-Red 等,淬灭基团有 TAMRA、Eclipse 等。

发明内容
本发明的目的在于提供用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan 探针。本发明的另一目的在于提供用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒。本发明的目的还在于提供兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法。为了实现本发明的目的,本发明的用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2所示;本发明的用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR 检测的TaqMan探针(荧光探针VP60p),其核苷酸序列如SEQ IDNo. 3所示,本发明所述的TaqMan探针,其5’端的荧光基团为FAM,3’端的荧光猝灭基团为 TAMRA0本发明根据GenBank (GenBank注册号FJ794180) RHDV VP60衣壳蛋白基因序列设计筛选出PCR引物,并确认了各引物的特异性。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。该引物对的扩增片段长度为96bp。本发明还提供含有如权利要求1所述的引物和TaqMan探针的兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒。所述试剂盒还包括扩增缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂和dNIPs。本发明还提供兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法,其采用一步法RT-PCR方法进行检测,包括如下步骤1)提取待测样品的RNA ;2)以步骤1)提取的RNA作为模板,用上述核苷酸序列如SEQ IDNo. 1和2所示的引物和TaqMan探针VP60p,采用一步法RT-PCR方法进行荧光定量PCR检测,根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。其中,步骤1)中所述样品为兔的肝组织、血液、分泌物或排泄物,所述样品还可以是用福尔马林固定或石蜡包埋的兔的肝组织。步骤2)中的RT-PCR反应体系为 每25 μ L反应液中含有2 X Quant 一步法荧光定量RT-PCR试剂盒12. 5 μ L、2. 5U/ μ L Hotmaster DNA 聚合酶 1 μ L、4U/μ L Quant 反转录酶 0. ;35 μ L、10 μ mol/L 的上下游引物各 0. 5 μ L、10 μ mol/L 的探针 0· 5 μ L、RNA模板 1 μ L,不含 RNA酶的水(RNase-free ddH20) 补足至25 μ L0RT-PCR 反应条件为50°C、30min,92°C、3min,92°C、10s,56°C、20s,68°C、20s,40
个循环。为了便于分析检测结果,可在RT-PCR扩增步骤中使用阳性标准品和阴性对照,所述阴性对照是以DEPC处理的水代替RNA模板;所述阳性标准品按如下步骤得到1)提取RHDV病毒RNA,用核苷酸序列如SEQ ID No. 4和5所示的引物,进行一步法RT-PCR扩增,得到目的片段;然后将该目的片段克隆到pGEM-T fesy载体上,转入感受态细胞大肠杆菌DH5 α,提取白斑阳性质粒;2)对提取的质粒进行Mc I酶切,使质粒DNA线性化,然后在T7RNA聚合酶作用下体外转录RNA,作为阳性标准品。上述PCR引物是根据GenBank(GenBank注册号FJ794180)RHDVVP60衣壳蛋白基因序列设计筛选、经上海英骏生物技术有限公司合成得到的,使用BLAST检索,确认各引物的特异性。该引物对的扩增出的目的片段长度为MObp,位于RHDV的VP60基因内部,该序列为保守序列,240bp的片段与预期大小一致,且包含上述用核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2 所示的引物扩增出的96bp的片段。此外,将切胶回收的目的片段与pGEM-T fesy载体连接, 转入感受态细胞DH5 α,进行蓝白斑筛选,挑取白斑摇菌后送公司测序,经测序表明VP60重组质粒序列正确,为阳性重组质粒,可用于后续试验。本发明中检测结果的判定标准为对样品进行荧光定量RT-PCR检测时,出现扩增曲线,即表明样品感染了兔出血症病毒;没有扩增曲线的扩增,则说明没有感染该病毒。本发明的优点在于1、采用一步法RT-PCR检测技术,在一管内连续完成反转录和定量PCR扩增,完全闭管扩增和检测,提高临床诊断依据的可靠性,减少多重操作污染的可能性,易于操作,减少加样过程中的体积损耗,保证结果的可信性,反转录得到的所有cDNA样品都用来扩增, 灵敏度更高。2、在荧光PCR仪上进行扩增和检测,无需电泳或是其他PCR后处理,有效的防范了 PCR扩增产物的污染,避免假阳性结果,避免了溴化乙锭或同位素对人体及环境的危害。只需2小时即可完成PCR过程,有利于提高报告数据的速度,无人为判断,仪器自动收集和分析数据。3、本发明的RHDV TaqMan荧光定量RT-PCR方法对VP60具有高特异性;且操作简单、快速,稳定性、重复性良好,结果一目了然;实现了实时检测,能够直观的了解整个PCR 过程的动态变化。4、本发明的荧光定量RT-PCR检测方法除能从病毒含量最高的肝组织中检测到 RHDV,还能从感染RHDV致死兔的其它组织中扩增出特异性片段,可用于检测RHDV在兔体内各组织中的动态分布。该方法还可以用于检测活兔的血液、分泌物、排泄物,以及福尔马林固定或石蜡包埋样品等是否含有病RHDV ;国外有报道苍蝇、跳蚤、蚊子等可能起着机械传播RHDV的作用,故该方法还可检测苍蝇、跳蚤、蚊子等媒介体内是否含有RHDV。本发明建立的检测RHDV的荧光定量RT-PCR方法为兔出血症的早期确诊和分子流行病学调查奠定基石出。


图1为本发明目的片段MObp序列PCR扩增电泳结果;其中,M:标记、1 目的产物; 2 阴性对照。图2为本发明目的片段347bp序列PCR扩增电泳结果;其中,M 标记、1 目的产物; 2 阴性对照。图3为本发明不同质粒拷贝数的荧光检测结果。图4为本发明的荧光定量RT-PCR标准曲线。图5为本发明的兔肝组织样品的荧光定量RT-PCR检测结果。图6为本发明的对活兔血液样品的荧光定量RT-PCR检测结果。图7为不同引物用量时的荧光定量RT-PCR检测结果图8为本发明的荧光定量RT-PCR特异性检测结果。
具体实施例方式以下通过具体实施例来进一步说明本发明,但不用来限制本发明的范围。实施例1阳性标准品的制备1) RHDV病毒提取RNA,用核苷酸序列如SEQ ID No. 4和5所示的引物,进行一步法 RT-PCR扩增,得到MObp目的片段(如图1所示);PCR反应体系为每25 yL反应液中含有10XRT-PCR缓冲液2. 5 μ L、超纯dNTP混合物(各 IOmM) 1 μ L、5 X RT-PCR 增强剂 5 μ L、40U/ μ L RNA 酶抑制剂 0. 25 μ L、2. 5U/ μ L Hotmaster DNA聚合酶1. 25 μ L、Quant反转录酶0. 25 μ LU0mmol/L的上下游引物各0. 5 μ L、RNA模板 1 μ U RNase-freeddH20 补至 25 μ L ;PCR 反应条件为50°C、30min,94°C、2min,94°C、lmin,51. 7°C、lmin,65°C、lmin, 扩增35个循环,65°C、IOmin ;2)然后将该目的片段克隆到PGEM-T Easy载体(购自Promega公司)上,转入宿主细胞大肠杆菌DH5 α (购自北京全式金生物技术有限公司),阳性克隆经PCR鉴定后测序, 测序结果表明为目标序列。将鉴定正确的基因片段抽提质粒DNA ;3)对提取的质粒进行Mc I酶切,使质粒DNA线性化,然后在T7RNA聚合酶作用下体外转录RNA ;Sac I序列为5,-GAGCTC-3,,反应体系为RE IOX缓冲液2 μ L、乙酰化的BSA 0. 2 μ L、质粒 DNA 2. 3 μ LUOU/μ L Sac I 0· 5 μ L、ddH20 补加至 20 μ L ;反应条件为37°C
温度下孵育Ih。T7 启动子序列为 5,-TAATACGACTCACTATA-3,;反应体系为Transcription Optimized 5X Buffer (5 倍优化转录缓冲液)4 μ L ;DTT2 μ L、Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor (RNasin 重组核糖核酸酶抑制剂)0. 5 μ L ;rATP、rGTP、rUTP 和 rCTP混合物4 μ L ;线性化DNA 8 μ L ; 19U/ μ L T7RNA聚合酶1 μ L ;DEPC水补加至20 μ L ;反应条件为37°C温度下孵育lh,然后加入RQl 0. 5 μ L,37°C温度下孵育15min ;4)经RNA Marker检测上述体外转录RNA长度为347bp (如图2所示),用紫外分光光度计测得上述体外转录RNA浓度为908. Ing/yL,计算出拷贝数;稀释其拷贝数为 1. OX IO12拷贝/y L,然后根据拷贝数将质粒10倍倍比稀释成含IO6-IO1拷贝/y L,作为阳性标准品。RNA纯度=A26tZA28tl (1.8-2.0之间,小于1. 8提示有残余蛋白质,大于2. 0提示有 RNA降解)。实施例2标准曲线绘制根据GenBank (GenBank注册号FJ794180) RHDV VP60衣壳蛋白基因序列设计筛选出PCR引物,并确认了各引物的特异性,所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。该引物对的扩增片段长度为96bp。以实施例1得到的阳性标准品作为模板,用核苷酸序列如SEQ IDNo. 1和2所示的引物和荧光探针VP60p,采用一步法RT-PCR方法进行检测。检测结果如图3所示。上述 RT-PCR中反应体系为每 25 μ L 反应液中含有2 X Quant One Step Probe qRT—PCR Master Mix (Quant 一步法荧光定量RT-PCR试剂盒(探针法))12. 5μ L、2. 5U/ μ LHotmaster DNA聚合酶1 μ L、 4U/ μ L Quant反转录酶0. 35 μ LUOy mol/L的上下游引物各0. 5 μ L、10 μ mol/L的探针各 0. 5 μ L、RNA模板1 μ L,不含RNA酶的水补足至25L。RT-PCR 反应条件为50°C、30min,92°C、3min,92°C、10s,56°C、20s,68°C、20s,扩
增40个循环。上述RT-PCR中反应模板浓度依次为IO6 IO1拷贝/ μ L,反应的灵敏度为IO1拷贝/ μ L,在IO6 IO1拷贝/ μ L浓度范围内有极好的线性关系。结果如图4所示。实施例3对兔肝组织样品的检测
1、提取兔肝组织样品的RNA取RHDV分离株(购自江苏农业科学院)100倍稀释液0. 2mL,肌肉注射3月龄未免疫兔。3日后部分兔出现死亡,取10只死亡兔的肝脏组织,分别使用RNApr印pure动物组织总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取兔肝组织样品。(1)将200mg肝组织加300 μ L裂解液RL,彻底研磨成勻浆,加入590 μ L RNase-free ddH20 禾Π 10 μ L 蛋白酶 K,混勻后 56°C处理 IOmin。(2)将所得液体12000rpm离心5min,取上清。(3)上清液缓慢加入200μ L无水乙醇,混勻,得到溶液和沉淀一起放入吸附柱中, 12000rpm离心lmin,弃去废液,将吸附柱放回收集管中。(4)向吸附柱中加入350 μ L去蛋白液RW1,12000rpm离心lmin,弃废液,将吸附柱
放回收集管中。(5)吸附柱中加入80 μ L的DNase I工作液,室温放置15min。(6)吸附柱中加入350 μ L去蛋白液RWl,12000rpm离心lmin,弃废液,将吸附柱放
回收集管中。(7)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液RW,室温静置2min,12000rpm离心lmin,弃废
液,将吸附柱放回收集管中,并重复此步骤一次。(8) 12000rpm离心2min,弃废液,吸附柱室温放置5min,转入新的RNase-free离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加40 μ L的RNase-free ddH20,室温放置2min,12000rpm离心2min,得到RNA溶液。2、以上述RNA作为模板,以DEPC处理的水代替RNA模板作为阴性对照,采用一步法RT-PCR方法进行检测,反应体系及反应条件与实施例2相同,根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。结果如图5所示。来自10只死亡兔的肝组织样品的RNA都呈现出扩增曲线,检出率为100%,说明该荧光定量RT-PCR方法可以准确检测兔出血症病毒。实施例4对活兔血液样品的检测1、提取兔血液样品的RNA取RHDV分离株100倍稀释液0. 2mL,肌肉注射3月龄未免疫兔。3日后部分兔出现死亡,对未死亡的12只兔采血,使用RNApr印pure血液总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)分别对12份兔血液提取血液样品。(1)将200 μ L血液样品加1000 μ L的1 X红细胞裂解液,冰上孵育20min,在孵育过程中,涡旋振荡混勻2次。(2)将所得液体4°C 2IOOrpm离心lOmin,留沉淀。(3)向白细胞沉淀中,加入IX红细胞裂解液,重悬细胞。(4)所得液体4°C 2IOOrpm离心lOmin,留沉淀。(5)向白细胞沉淀中,加入500 μ L裂解液RL,混勻。(6)将溶液转移至过滤柱中,12000rpm离心2min,弃去过滤柱,收集滤液。(7)向滤液中加入500 μ L的70%乙醇,混勻,得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中,12000rpm离心lmin,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。(8)向吸附柱中加入35(^1^去蛋白液,12000印111离心11^11,倒掉收集管中的废液, 将吸附柱放回收集管中。(9)向吸附柱中央加入80 μ L的DNase I,室温放置15min。(10)向吸附柱中央加入350yL去蛋白液,12000rpm离心lmin,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。(11)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液,室温静置2min,12000rpm离心lmin,倒掉收
集管中的废液,将吸附柱放回收集管中,重复此步骤一次。(12) 12000rpm离心2min,倒掉废液,将吸附柱置于室温放置5min,彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(13)将吸附柱转入一个新的RNase-free离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴力口 40 μ L 的 RNase-free ddH20,室温放置 2min, 12000rpm 离心 2min,得到 RNA 溶液。2、以上述RNA作为模板,以DEPC处理的水代替RNA模板作为阴性对照,采用一步法RT-PCR方法进行检测,反应体系及反应条件与实施例2相同,根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。结果如图6所示。血液样品的RNA都呈现出扩增曲线,检出率为100%,说明该荧光定量RT-PCR方法可以准确检测兔出血症病毒。 试验例IRT-PCR中引物用量的优化 引物的浓度是影响PCR反应的关键因素,若浓度太低,会使反应不完全;若引物太多,则发生错配及产生非特异产物的可能性会大大增加,还会使背景荧光值增加。非特异性产物和引物二聚体也多与靶序列竞争DNA聚合酶、dNTP底物,从而使靶序列的扩增量降低。 本试验例按下述方法对引物终浓度(引物用量)进行优化。按实施例1方法制得浓度为908. Ing/ μ 1的体外转录RNA,计算得到 4.6X1012copy,然后倍比稀释。取IO4Copy的体外转录RNA为模板,用核苷酸序列如SEQ IDNo. 1和2所示的引物和荧光探针VP60p,采用一步法-荧光定量RT-PCR方法进行检测。上述RT-PCR中反应体系为将核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2所示的引物 (ΙΟμπιοΙ/L)按体积比1 1混合,依次向反应体系中加入0.5“1^、1“1^、1.5“1^、2口1^、 4μ L ;其余试剂及用量与实施例2中的反应体系相同,用实施例2的反应条件进行一步 RT-PCR检测,结果如图7所示。根据最大荧光信号强度和最小Ct值综合考虑,确定最佳引物用量为Ι.Ομ 1,即引物的终浓度分别为0. 4 μ mol/L。试验例2特异性考核分别用4种菌液作为模板,在实施例2相同的条件下进行一步法RT-PCR检测,每次扩增设阴阳性对照,鉴定探针法荧光定量方法的特异性,结果如图8所示。这4份菌液分别为兔水疱性口炎病毒细胞毒、轮状病毒细胞毒、仙台病毒、RHDV0 (兔水疱性口炎病毒细胞毒、轮状病毒细胞毒、仙台病毒均购自江苏省农科院)结果表明RHDV有扩增,呈阳性,而兔水疱性口炎病毒细胞毒、轮状病毒细胞毒、 仙台病毒没有扩增,均呈阴性,表明特异性很好,可以用于兔出血症病毒的检测。虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方案及试验例对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
9
权利要求
1.用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物,其核苷酸序列如SEQID No. 1和2 所示。
2.用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的TaqMan探针,其核苷酸序列如SEQID No. 3所示。
3.如权利要求2所述的TaqMan探针,其特征在于,所述TaqMan探针的5’端的荧光基团为FAM,3’端的荧光猝灭基团为TAMRA。
4.含有如权利要求1所述的引物以及权利要求2或3所述TaqMan探针的兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,还包括扩增缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂和dNIPs。
6.一种兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测方法,其特征在于,包括如下步骤1)提取待测样品的RNA;2)以步骤1)提取的RNA作为模板,用权利要求1所述引物和TaqMan探针,采用一步法 RT-PCR方法进行荧光定量PCR检测,根据荧光定量扩增曲线判定样品检测结果。
7.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于,步骤1)中所述样品为兔的肝组织、血液、分泌物或排泄物。
8.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述样品为用福尔马林固定或石蜡包埋的兔的肝组织。
9.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于,步骤2)中的RT-PCR反应体系为每25 μ L反应液中含有2 X Quant 一步法荧光定量RT-PCR试剂盒12. 5 μ L、2. 5U/ μ L Hotmaster DNA聚合酶1 μ L、4U/μ L Quant反转录酶0. 35 μ L、10 μ mol/L的上下游引物各 0. 5 μ L、10 μ mol/L的探针0· 5 μ L、RNA模板1 μ L,不含RNA酶的水补足至25 μ L。
10.如权利要求6所述的检测方法,其特征在于,步骤2)中的RT-PCR反应条件为 50°C、30min,92°C、3min,92°C、10s,56°C、20s,68°C、20s,40 个循环。
全文摘要
本发明提供了用于兔出血症病毒荧光定量RT-PCR检测的引物和TaqMan探针。本发明还提供了含有上述引物和探针的试剂盒,以及使用上述引物和探针采用一步法RT-PCR检测兔出血症病毒的方法。本发明采用一步法RT-PCR检测技术,在一管内连续完成反转录和定量PCR扩增,完全闭管扩增和检测,减少了多重操作污染的可能性,易于操作,减少加样过程中的体积损耗,保证结果的可信性,反转录得到的所有cDNA样品都用来扩增,灵敏度更高。
文档编号C12Q1/70GK102154512SQ201110062529
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月15日 优先权日2011年3月15日
发明者孙卫东, 林祥梅, 武昱孜, 苏国清, 贾广乐 申请人:中国检验检疫科学研究院
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1