专利名称：一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学的病毒检测领域，具体地说涉及一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法。
背景技术：
^VlXDendranthema morifolium Tzve 1. {Chrysanthemum morifolium Ramat.)) 为菊科菊属多年生宿根草本植物，是我国十大传统名花，世界上最早栽培的观赏植物之一， 具有很高的经济和观赏价值，在花卉产业中占据重要的地位。菊花在移栽、扦插、以及种植过程中易感染病毒。菊花B病毒(Chrysanthemum virus B，CVB)，使患病菊花在菊花叶上表现为轻型花叶症，而对于易感品种，可形成明显花叶症状或坏死斑，严重的会产生褐色枯斑。CVB于观赏菊花上普遍发生，发病率6(Γ65%。菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chloritic mottleviroid，CChMVd)是为害菊花的另一种重要病原，引起菊花斑驳病。受害植株通常在叶上呈现斑驳状，后完全褪绿。有些品种则表现为生长迟缓矮化，生根不良。以往检测植物病毒可用电镜负染色法进行检测和鉴定，但是负染色电镜方法对初学者来讲，难度比较大，不仅容易受到破碎细胞的干扰而影响判断结果，而且不能鉴定潜隐和复合侵染病毒。随着现代植物病毒和类病毒检测手段的发展，目前运用最为广泛的是酶联免疫法 (ELISA)，在国外已经形成商品化生产，但是每种病毒都需要特异的酶标记特异抗体，标记过程比较复杂，价格比较昂贵，有时也会产生非特异性的颜色干扰，而且不能鉴定不含外壳蛋白的类病毒。北京市农林科学院于2008年申请的中国专利“一种用于检测菊花B病毒的方法”(申请号CN200810M0415)和“一种用于检测菊花褪绿斑驳类病毒的方法”(申请号 CN200810M0414)公开了采用分子生物学方法检测CVB和CChMVd的方法，但采用LAMP进行检测容易受到污染，出现假阳性结果，对引物设计的要求非常高。目前对于菊花在CVB和CChMVd复合侵染下可同时检测出病原的技术未见报道，如果可同时检测出病原，可提高检测效率，显著降低检测成本。
发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法，可同时检测出CVB和CChMVd。技术方案为实现上述目的，本发明的一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR 检测方法，包括如下步骤
(1)从菊花植株取样并提取总RNA ；
(2 )分别针对CVB和CChMVd病毒设计两对特异性弓I物=CVB-F, CVB-R ； CChMVd-F， CChMVd-R ；
(3)以随机六聚体为引物进行反转录得到两种cDNA ；(4)利用RT-PCR技术扩增所述cDNA，将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到特异性片段表示感染CVB，得到206bp特异性片段表示感染CChMVd。步骤(1)所述取样包括菊花植株的花、上部叶片、下部叶片，取样后将样本用液氮冷冻保存。所述提取总RNA采用Takara公司提供的RNA提取试剂盒，得到的总RNA保存于_70°C超低温冰箱。步骤(2)所述两对特异性引物分别为 CVB-F :5’ -ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3，， CVB-R 5' -TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3’ ； CChMVd-F :5’ -CAGTTTCGGCTTGTGCGGGAGT-3，， CChMVd-R :5’ -TCCGAGGAGAATATCCAACGAG-3，。步骤(4)所述RT-PCR 反应体系 25μ 1 中包括 0. 5μ 1 CVB_F，0. 5μ1 CVB-R, 0. 5 μ 1 CChMVd-F, 0. 5 μ 1 CChMVd-R0具体的说，所述RT-PCR反应在25 μ 1的反应体系中还加入 1 μ 1 dNTPs(2. 5mmol/L), 1 μ 1 cDNA, 2. 5 μ 1 10XPCR Buffer, 0. 2 μ 1 Taq 酶，1·5μ1 Mg2+。步骤(4)所述RT-PCR反应设定为94°C预变性5 min, 94°C变性45s，52°C退火45s， 72°C延伸lmin循环33次，72°C延伸lOmin。所述扩增的产物通过洲琼脂糖凝胶电泳，得到 665bp的CVB特异性片段和206bp的CChMVd特异性片段。本发明由于CVB和CChMVd两种引物的Tm值接近，可于同一退火温度进行扩增，简化了操作；而特异性片段长度分别为665bp和206bp，差异显著，通过琼脂糖凝胶电泳能轻松将两种条带区分开来。有益效果本发明的一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法可同时检测被CVB和CChMVd复合侵染的病株，检测特异性强，灵敏度高，工序简单，节约成本。
图1为病叶样本图2为实施例1双重RT-PCR的凝胶电泳图，1 =CChMVd ；2 =CVB ；3 花；4 上部叶；5 下部叶；
图3为试验例1单重RT-PCR中CVB的凝胶电泳图，1 下部叶；2 上部叶；3 花； 图4为试验例1单重RT-PCR中CChMVd的凝胶电泳图，1 花；2 叶； 图5为试验例2中cDNA模板不同比例稀释后的PCR凝胶电泳图，1 原始模板；2 稀释 KT1 ；3 稀释 Kr2 ；4 稀释 1(Γ3。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作更进一步的说明。实施例1
取田间表现花叶、斑驳、褪绿的菊花植株为材料，对所取的植株进行总RNA提取，提取总RNA采用Takara公司提供的RNA提取试剂盒，得到的RNA保存于_70°C的超低温冰箱。设计CVB和CChMVd的特异性引物 CVB-F :5’ -ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3，， CVB-R 5' -TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3’ ；CChMVd-F :5’ -CAGTTTCGGCTTGTGCGGGAGT-3，， CChMVd-R 5' -TCCGAGGAGAATATCCAACGAG-3’ ；
以随机六聚体为引物进行反转录，得到CVB和CChMVd的两种cDNA。20μ1的反应体系为在 Microtube 管中力口入 μ 模板 RNA，2Pl Random Primers (25μΜ)，9μ1 RNase free H2O于70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷2min，离心数秒后使模板RNA的变性溶液聚集于Microtube管的底部，再向12μ1的变性溶液中加入4μ1 5XM-MLV Buffer, μ dNTP Mixture (10mM),0. 5μ1 RNase Inhibitor (40υ/μ1)，0· 8μ 的 RTase M-MLV (200υ/μ1), 1. 7μ1 RNase free H2O 于 30°C反应 lOmin，然后在 42°C保温 60min，70°C保温 15min 后冰上冷却，得到CVB和CChMVd的两种cDNA。双重RT-PCR 反应体系 25 μ 1 中包括 0. 5 μ 1 CVB-F, 0. 5 μ 1 CVB-R, 0. 5 μ 1 CChMVd-F, 0. 5 μ 1 CChMVd-R, 1 μ 1 dNTPs (2. 5mmol/L), 1 μ 1 cDNA,2. 5 μ 1 IOXPCR Buffer, 0. 2 μ 1 Taq酶，1· 5 μ 1 Mg2+。RT_PCR 反应设定为:94°C预变性 5 min，94°C变性 45s， 52°C退火 45s，72°C延伸 Imin 循环 33 次，72°C延伸 IOmin0扩增产物用21的琼脂糖凝胶电泳分析，如图2所示，CChMVd在206bp具有特异性片段，CVB在665bp具有特异性片段。而且在病株的花、上部叶和下部叶都可以同时检测出是否被CVB和CChMVd复合侵染。实施例2
取田间表现花叶、斑驳、褪绿的菊花植株为材料，对所取的植株进行总RNA提取，提取总RNA采用Takara公司提供的RNA提取试剂盒，得到的RNA保存于_70°C的超低温冰箱。设计CVB和CChMVd的特异性引物 CVB-F :5’ -ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3，， CVB-R 5' -TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3’ ； CChMVd-F :5’ -CAGTTTCGGCTTGTGCGGGAGT-3，， CChMVd-R 5' -TCCGAGGAGAATATCCAACGAG-3’ ；
以随机六聚体为引物进行反转录，得到CVB和CChMVd的两种cDNA。20μ1的反应体系为在 Microtube 管中力口入 μ 模板 RNA，2Pl Random Primers (25μΜ)，9μ1 RNase free H2O于70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷2min，离心数秒后使模板RNA的变性溶液聚集于Microtube管的底部，再向12μ1的变性溶液中加入4μ1 5XM-MLV Buffer, μ dNTP Mixture (10mM),0. 5μ1 RNase Inhibitor (40υ/μ1)，0· 8μ 的 RTase M-MLV (200υ/μ1), 1. 7μ1 RNase free H2O 于 30°C反应 lOmin，然后在 42°C保温 60min，70°C保温 15min 后冰上冷却，得到CVB和CChMVd的两种cDNA。双重RT-PCR 反应体系 25 μ 1 中包括 0. 5 μ 1 CVB-F, 0. 5 μ 1 CVB-R, 0. 5 μ 1 CChMVd-F, 0. 5 μ 1 CChMVd-R, 2 μ 1 dNTPs (2. 5mmol/L), 1 μ 1 cDNA,2. 5 μ 1 10XPCR Buffer, 0. 2 μ 1 Taq酶，1· 5 μ 1 Mg2+。RT_PCR反应设定为:94°C预变性 5 min，94°C变性 43s， 52°C退火 40s, 72°C延伸 Imin 循环 35 次，72°C延伸 IOmin0实施例3
取田间表现花叶、斑驳、褪绿的菊花植株为材料，对所取的植株进行总RNA提取，提取总RNA采用Takara公司提供的RNA提取试剂盒，得到的RNA保存于_70°C的超低温冰箱。设计CVB和CChMVd的特异性引物CVB-F :5’ -ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3，， CVB-R 5' -TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3’ ； CChMVd-F :5’ -CAGTTTCGGCTTGTGCGGGAGT-3，， CChMVd-R 5' -TCCGAGGAGAATATCCAACGAG-3’ ；
以随机六聚体为引物进行反转录，得到CVB和CChMVd的两种cDNA。20μ1的反应体系为在 Microtube 管中力口入 μ 模板 RNA，2Pl Random Primers (5μΜ)，9μ1 RNase free H2O于70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷2min，离心数秒后使模板RNA的变性溶液聚集于Microtube管的底部，再向12μ1的变性溶液中加入4μ1 5XM-MLV Buffer, μ dNTP Mixture (10mM),0. 5μ1 RNase Inhibitor (40υ/μ1 )，0· 8μ 的 RTase M-MLV (200υ/μ1), 1. 7μ1 RNase free H2O 于 30°C反应 lOmin，然后在 42°C保温 60min，70°C保温 15min 后冰上冷却，得到CVB和CChMVd的两种cDNA。双重RT-PCR 反应体系 25 μ 1 中包括 0. 5 μ 1 CVB-F, 0. 5 μ 1 CVB-R, 0. 5 μ 1 CChMVd-F, 0. 5 μ 1 CChMVd-R, 2 μ 1 dNTPs (2. 5mmol/L), 1 μ 1 cDNA,2. 5 μ 1 IOXPCR Buffer, 0. 2 μ 1 Taq酶，1· 5 μ 1 Mg2+。RT_PCR反应设定为:94°C预变性 5 min，94°C变性 45s， 52°C退火 47s，72°C延伸 Imin 循环 30 次，72°C延伸 IOmin0试验例1
取田间表现花叶、斑驳、褪绿的菊花植株为材料，对所取的植株进行总RNA提取，得到的RNA保存于-70°C的超低温冰箱。设计CVB和CChMVd的特异性引物 CVB-F :5’ -ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3，， CVB-R 5' -TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3’ ； CChMVd-F :5’ -CAGTTTCGGCTTGTGCGGGAGT-3，， CChMVd-R 5' -TCCGAGGAGAATATCCAACGAG-3’ ；
以随机六聚体为引物进行反转录，得到第一链的cDNA。20μ1的反应体系为在 Microtube 管中力口入 μ 模板 RNA，2Pl Random PrimersC5μΜ), 9μ1 RNase free H2O 于 70°C 保温IOmin后迅速在冰上急冷2min，离心数秒后使模板RNA的变性溶液聚集于Microtube 管的底部，再向 12μ1 的变性溶液中加入 4μ1 5XM-MLV Buffer, μ dNTP Mixture(IOmM), 0. 5μ1 RNase Inhibitor (40υ/μ1)，0· 8μ 的 RTase M-MLV (200υ/μ1), 1. 7μ1 RNase free H2O于30°C反应lOmin，然后在42°C保温60min，70°C保温15min后冰上冷却，得到CVB和 CChMVd 的两种 cDNA。分别用RT-PCR扩增CVB和CChMVd的两种cDNA
CVB 的 25μ1 反应体系为2. 5μ1 IOXPCR Buffer, 2. 0μ1 dNTPs (2. 5mmol/L), 1. 5μ1 Mg2+, μ CVB-R, μ CVB-F， μ cDNA，0. 2μ1 Taq酶，用去离子水补足到25μ1。PCR体系的扩增条件为:94°C预变性5min，94 °C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸Imin循环30次，72°C 延伸lOmin。扩增产物用洲的凝胶电泳检测分析。得到预期长度为的特异性片段， 如图3所示；
CChMVd 的 25μ1 反应体系为2. 5μ1 10Χ PCR Buffer, 2. 0μ1 dNTPs(2. 5mmol/L),l. 5μ1 Mg2+, μ CChMVd-R, μ CChMVd-F, μ cDNA，0. 2μ1 Taq 酶，去离子水补足到 25μ1。PCR 体系的扩增条件为94°C预变性5 min，94°C变性45s，50°C退火30s，72°C延伸Imin循环30次，72°C延伸lOmin。得到的PCR产物用洲的琼脂糖凝胶电泳分析，得到预期长度为206bp 的特异性片段，如图4所示。分别将所得到的两种RT-PCR产物切胶回收目的条带，将其连接到PMD19-T Simple载体，转化TOPlO感受态细胞，37°C培养15h，根据蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行培养，PCR反应进行阳性鉴定，样品测序由北京六合华大基因科技公司完成，用BLAST软件进行序列同源性分析，结果如下
CVB的外壳蛋白扩增片段长度为66^3ρ，与Singh.等(GenBank:AM493895. 2)和Jabeen (GenBank: AJ876635. 1)分离物的相应核苷酸同源性为86%和84% ；而CChMVd的序列同源性与 Flores (GenBank:AJ878089. 1)和 Yamamoto (GenBank:AB181858. 1)分离物的相应核苷酸的同源性高达97%。从而确定了两种病毒的种类，同时也证明CVB和CChMVd病毒的基因序列具有保守性，根据其CP序列设计的引物也具有广泛的适用性。试验例2
该试验例的过程与实施例1相同，但将cDNA模板分别按照ΙΟ^ΙΟ^ΚΓ3进行不同比例稀释。检测该方法同时检测CVB和CChMVd的灵敏度，结果如图5所示，可见，当模板浓度稀释10_3时仍能在206bp和665bp检测出来，说明该方法同时检测两种病毒具有很高的灵敏度。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)从菊花植株取样并提取总RNA ；(2 )分别针对CVB和CChMVd病毒设计两对特异性弓I物CVB-F，CVB-R ； CChMVd-F， CChMVd-R ；(3)以随机六聚体为引物进行反转录得到两种cDNA；(4)利用RT-PCR技术扩增所述cDNA，将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到特异性片段表示感染CVB，得到206bp特异性片段表示感染CChMVd。
2.根据权利要求1所述的菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法，其特征在于步骤(2)所述两对特异性引物分别为CVB-F :5’ -ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3，，CVB-R 5' -TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3’ ；CChMVd-F :5’ -CAGTTTCGGCTTGTGCGGGAGT-3，，CChMVd-R :5’ -TCCGAGGAGAATATCCAACGAG-3，。
3.根据权利要求1所述的菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法，其特征在于步骤(4)所述 RT-PCR 反应体系 25μ 1 中包括 0. 5μ 1 CVB_F，0. 5μ1 CVB-R, 0. 5 μ 1 CChMVd-F,0· 5 μ 1 CChMVd-R0
4.根据权利要求1所述的菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法，其特征在于步骤(4)所述RT-PCR反应设定为94 °C预变性5 min, 94 V变性43 47s，52 °C退火 40 45s，72°C延伸 Imin 循环 30 35 次，72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本发明公开了一种菊花CVB和CChMVd病毒的二重RT-PCR检测方法，属于分子生物学的病毒检测领域，该方法包括(1)从菊花植株取样并提取总RNA；(2)分别针对CVB和CChMVd病毒设计两对特异性引物CVB-F，CVB-R；CChMVd-F，CChMVd-R；(3)以随机六聚体为引物进行反转录得到两种cDNA；(4)利用RT-PCR技术扩增所述cDNA，将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到665bp特异性片段表示感染CVB，得到206bp特异性片段表示感染CChMVd。本发明提供的检测方法可同时检测被CVB和CChMVd复合侵染的病株，检测特异性强，灵敏度高，工序简单，节约成本。
文档编号C12Q1/68GK102242225SQ201110203309
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者尤燕平, 房伟民, 管志勇, 蒋甲福, 陈发棣, 陈素梅 申请人:南京农业大学